周亞妮，姜鵬濤，李會(huì)榮

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis，UC)是一類發(fā)病原因不明確的慢性特發(fā)性腸道炎癥性疾病，病變局限于大腸黏膜及黏膜下層，病程遷延且反復(fù)發(fā)作[1]。過(guò)去該病在西方國(guó)家發(fā)病率較高，但近年來(lái)其在我國(guó)的發(fā)病率呈明顯升上升趨勢(shì)。蒲公英具有抗菌、抗突變、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理學(xué)作用[2]。有研究[3-4]顯示，蒲公英多糖對(duì)UC大鼠白細(xì)胞介素(IL)-6/STAT3通路的作用，對(duì)血清中的IL-6及結(jié)腸組織中的髓過(guò)氧化物酶(MPO)有影響。蒲公英水提物對(duì)2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的UC大鼠模型血清中炎性因子IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平表達(dá)有影響作用[5]。有研究[6]顯示蒲公英對(duì)小鼠痤瘡模型炎癥因子IL-8水平有調(diào)節(jié)作用。近年來(lái)，5-氨基水楊酸(5-ASA)制劑灌腸治療UC療效明顯，其中美沙拉嗪治療TNBS/乙醇誘導(dǎo)的UC大鼠，提高了抗炎因子IL-4水平，并降低了促炎因子IL-6水平[7-8]。目前炎性因子的表達(dá)成為研究UC發(fā)病發(fā)展的熱點(diǎn)，但在UC發(fā)病中針對(duì)炎性因子與MPO的表達(dá)相關(guān)性方面研究較少，因此，該研究擬以建立TNBS/乙醇大鼠UC模型為基礎(chǔ)[9]，采用蒲公英多糖聯(lián)合美沙拉嗪對(duì)UC大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)炎癥活動(dòng)期大鼠血清中炎性因子IL-6、IL-4、IL-8、IL-10和TNF-α含量以及結(jié)腸組織中MPO 水平，探討血清中炎癥因子與結(jié)腸組織中MPO在UC活動(dòng)期的相關(guān)性，為臨床UC的診斷和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 采用雄性Wistar大鼠50只，6～8周齡，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(陜)2015-0009]。動(dòng)物飼養(yǎng)設(shè)施符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[SYXK(陜)2013-0210]。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵照國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用指南。

1.1.2 主要試劑和儀器 實(shí)驗(yàn)用蒲公英購(gòu)自陜西省西安市懷仁堂中藥店(小寨店)，并經(jīng)生藥鑒定為正品。5%TNBS溶液購(gòu)自北京天根生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：160712)；美沙拉嗪緩釋顆粒劑購(gòu)自法國(guó)愛(ài)的發(fā)制藥公司(批號(hào):20140202)，規(guī)格每袋0.5 g，10袋/盒；IL-6 ELISA試劑盒、IL-4 ELISA試劑盒購(gòu)、IL-8 ELISA試劑盒購(gòu)、IL-10 ELISA試劑盒購(gòu)、TNF-α試劑盒購(gòu)自上?？泼郎锟萍加邢薰?；紫外分光光度檢測(cè)儀器購(gòu)自購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司、顯微鏡購(gòu)自上海光學(xué)儀器廠，電子天平購(gòu)自德國(guó)Sartorious公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及TNBS/乙醇大鼠UC模型建立 SPF級(jí)SD雄性大鼠50只，適應(yīng)性生活72 h，隨機(jī)抽取10只大鼠作為正常對(duì)照組，其余40只大鼠進(jìn)行造模。TNBS-乙醇的UC動(dòng)物模型參照文獻(xiàn)[9]建立。造模前均禁食24 h，用10%水合氯醛(0.30 mL/100 g，現(xiàn)配)腹腔注射麻醉后，用聚丙烯管插入肛門(mén)上段8 cm一次性緩慢注入TNBS/50%乙醇混合液(100 mg/kg TNBS+50%乙醇)0.25 mL，誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎。觀察到大鼠毛色暗淡、精神萎靡、食量減少且出現(xiàn)黏液膿血便或便潛血試驗(yàn)陽(yáng)性，3 d后，取正常對(duì)照組和模型組各2只大鼠進(jìn)行解剖，并分別抽取腹主動(dòng)脈血分離血清標(biāo)記保存待測(cè)。參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[10]，確認(rèn)造模成功后，將造模大鼠隨機(jī)分成模型對(duì)照組、美沙拉嗪治療組、蒲公英治療組以及美沙拉嗪與蒲公英聯(lián)合治療組(聯(lián)合治療組)。

1.2.2 蒲公英多糖提取物的制備 (1)預(yù)處理材料，將100 g干燥蒲公英用中草藥粉碎機(jī)磨成粉末，過(guò)80目篩備用。(2)脫脂，將蒲公英根粉末用濾紙包好，放入索氏提取器中，于50 ℃條件下石油醚回流脫脂3～4 h。(3)單糖和寡糖的去除，將脫脂后的濾紙包風(fēng)干，再用80%乙醇回流2 h。(4)熱水浸提，將回流后的濾紙包風(fēng)干，各取5 g進(jìn)行單因素及正交試驗(yàn)。(5)除蛋白，用木瓜蛋白酶解蛋白。(6)醇析，向提取液中緩緩加入95%乙醇，并用玻璃棒緩慢攪拌，使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，靜置4 h，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min。(7)濃縮，取離心后的上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3。(8)純化，濃縮后的溶液用80%乙醇沉淀蒲公英根多糖，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min，多糖沉淀分別用無(wú)水乙醇、丙酮洗3次，真空干燥得精制多糖[3]。

1.2.3 分組灌胃治療 模型復(fù)制成功后，第3天開(kāi)始灌胃給藥：正常對(duì)照組，按照劑量為1 mL·100 g-1·d-1(約2 mL)計(jì)算，以0.9%氯化鈉溶液灌胃，每天1次；模型對(duì)照組，按照劑量為1 mL·100 g-1·d-1(約2 mL)計(jì)算，以0.9%氯化鈉溶液灌胃，每天1次；美沙拉嗪組，按照劑量為每次1 mg·100 g-1·d-1美沙拉嗪灌胃，每天1次；蒲公英多糖組，按照劑量為每次1 mg·100 g-1·d-1蒲公英多糖灌胃，每天1次；聯(lián)合治療組，劑量為美沙拉嗪1 mg·100 g-1·d-1和蒲公英多糖1 mg·100 g-1·d-1聯(lián)合灌胃，每天1次。以上各組灌胃均持續(xù)14 d。

1.2.4 標(biāo)本采集 末次給藥后，各組大鼠禁食24 h后眼眶取血，以3 000 r/min離心15 min，分離血清，置-20 ℃低溫冰箱保存。

1.2.5 ELISA法測(cè)定血清中IL-6、IL-4、IL-8、IL-10和TNF-α水平 將待用血清從-20 ℃冰箱中取出放入4 ℃冰箱中溶解24 h，于實(shí)驗(yàn)前1 h放至室溫待全部溶解，輕輕搖晃混勻，以免出現(xiàn)沉淀。嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，操作完成后使用自動(dòng)化酶標(biāo)儀分光光度計(jì)測(cè)定450 nm處吸光度值分別計(jì)算血清中IL-6、IL-4、IL-8、IL-10和TNF-α濃度。

1.2.6 Western blotting法檢測(cè)結(jié)腸黏膜組織中MPO的表達(dá) 剪取大鼠炎癥明顯處4塊結(jié)腸組織約50 mg，用PBS沖洗，剪碎并加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液500 μL，研磨勻漿提取蛋白，經(jīng) BCA 定量蛋白濃度后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，蛋白轉(zhuǎn)印至活化的PVDF膜上，5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h，MPO 抗體(1∶500)4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3遍，每遍10 min，加入二抗( 1∶5 000) 室溫孵育1 h，TBST洗滌3遍，每遍10 min，滴加ECL進(jìn)行化學(xué)曝光，顯影、沖洗膠片并掃描分析，對(duì)目的條帶做灰度分析，以目的蛋白的灰度值比內(nèi)參GAPDH 的灰度值校正誤差，比較蛋白表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析、q檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清血清中IL-6、IL-4、IL-8、IL-10和TNF-α表達(dá)水平 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、蒲公英多糖組血清IL-6、IL-8和TNF-α水平升高，IL-4和IL-10水平降低(P<0.05)，美沙拉嗪組血清IL-6和TNF-α水平升高，IL-4和IL-10水平降低(P<0.05)，聯(lián)合治療組與正常對(duì)照組比較各因子水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型對(duì)照組比較，美沙拉嗪組、蒲公英多糖組和聯(lián)合治療組血清IL-6、IL-8和TNF-α水平降低，IL-4和IL-10水平升高(P<0.05)；與美沙拉嗪組、蒲公英多糖組比較，聯(lián)合治療組血清IL-6、IL-8和TNF-α水平降低，IL-4和IL-10水平升高(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

2.2 蒲公英多糖對(duì)結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中MPO表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、蒲公英多糖組和美沙拉嗪組結(jié)腸組織中MPO的含量升高；與模型對(duì)照組比較，美沙拉嗪組、蒲公英多糖組和聯(lián)合治療組結(jié)腸組織中MPO的含量降低；與美沙拉嗪組、蒲公英多糖組比較，聯(lián)合治療組MPO的含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

2.3 血清中細(xì)胞因子與結(jié)腸組織中MPO的變化關(guān)系分析 結(jié)腸炎大鼠模型中，IL-6(r=0.852)、IL-8(r=0.614)、TNF-α(r=0.426)表達(dá)水平與MPO水平呈正相關(guān)關(guān)系，IL-4(r=-0.106)和IL-10(r=-0.086)表達(dá)水平與MPO水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。

表1 藥物灌胃后血清中幾種細(xì)胞因子水平的表達(dá)

表2 藥物灌胃后結(jié)腸組織中MPO的含量(U/g)

3 討論

UC的病因尚不完全清楚，但可以確定的是異常免疫反應(yīng)在UC的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。隨著人民生活水平的提高和生活節(jié)奏加快，我國(guó)UC的發(fā)病率也出現(xiàn)逐漸增高趨勢(shì)[11]。TNBS/乙醇誘導(dǎo)的UC模型在臨床癥狀、組織學(xué)和微觀方面與人類 UC 相似，具有很好的結(jié)腸損傷及腸上皮屏障破壞的發(fā)病特征，適合篩選UC潛在治療藥物[12]。

蒲公英多糖能夠顯著抑制炎性動(dòng)物模型體內(nèi)IL-6mRNA的表達(dá)，異常免疫反應(yīng)它激活了UC發(fā)病的標(biāo)志物活性氧/氮物質(zhì)(ROS/RNS)生成系統(tǒng)，導(dǎo)致血清中促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-8等過(guò)度產(chǎn)生，而抑炎因子IL-4、IL-10降低，炎癥反應(yīng)逐級(jí)放大[13-16]。MPO由中性粒細(xì)胞分泌，其活性是中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的重要指標(biāo)，也能間接反映腸道炎癥活動(dòng)程度。有研究[16]表明，TNBS腸腔灌注的造模方法構(gòu)建炎癥性腸病動(dòng)物模型，模型組大鼠MPO水平顯著增高。結(jié)合蒲公英的藥理活性和UC發(fā)病的異常免疫特點(diǎn)，我們以蒲公英多糖為目標(biāo)藥物，通過(guò)與近年來(lái)治療UC新型替代性5-ASA制劑的美沙拉嗪聯(lián)合灌腸，考察蒲公英多糖在治療UC大鼠的作用中，細(xì)胞因子IL-6、IL-4、IL-8、IL-10和TNF-α表達(dá)水平與結(jié)腸組織中MPO變化相關(guān)性分析。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，UC模型對(duì)照組大鼠血清中炎癥因子IL-6、IL-8和TNF-α水平高于正常對(duì)照組，而IL-4和IL-10水平低于正常對(duì)照組；模型對(duì)照組大鼠結(jié)腸組織中MPO水平高于正常對(duì)照組。給予3種藥物灌腸治療后發(fā)現(xiàn)，蒲公英多糖組、美沙拉嗪組大鼠分別與模型對(duì)照組大鼠比較，細(xì)胞因子IL-6、IL-8和TNF-α降低水平和IL-4、IL-10升高水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究還發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用美沙拉嗪和蒲公英多糖大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平以及結(jié)腸組織中MPO含量顯著降低，IL-4、IL-10 水平顯著升高，且與美沙拉嗪組和蒲公英多糖組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為聯(lián)合用藥對(duì)治療UC有更好的療效，進(jìn)一步說(shuō)明，蒲公英多糖對(duì)UC的傳統(tǒng)用藥美沙拉嗪有協(xié)同治療作用，這與宋雨鴻等[17]研究結(jié)果相一致。因此，筆者認(rèn)為，炎癥因子L-6、IL-8、TNF-α為促炎因子，對(duì)于UC炎癥的進(jìn)程起推進(jìn)作用，MPO作為腸道炎癥活動(dòng)程度的一項(xiàng)指標(biāo)也得以證明。IL-4、IL-10作為2種主要的抗炎因子，在抑制UC炎癥發(fā)生及促進(jìn)疾病轉(zhuǎn)歸方面都起到重要的作用[18]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)評(píng)價(jià)大鼠血清中IL-6、IL-4、IL-8、IL-10和TNF-α表達(dá)水平與結(jié)腸組織中MPO含量，認(rèn)為聯(lián)合使用美沙拉嗪和蒲公英多糖治療UC模型大鼠比單獨(dú)一種藥物抗炎效果更佳，其可能的機(jī)制為減少血清促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α的釋放以及結(jié)腸組織中MPO的表達(dá)，并上調(diào)抑炎因子IL-4、IL-10阻斷炎癥的放大效應(yīng)。進(jìn)一步證明，蒲公英多糖對(duì)美沙拉嗪治療UC有協(xié)同作用，這為UC的臨床診斷和藥物療效評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。