宋 濤，官澤宇，徐 超，朱二暢，蔡 瑤，盧 冉，余朝文

血管內(nèi)皮細(xì)胞在維持心血管系統(tǒng)的正常生理功能發(fā)揮重要作用，它通過(guò)分泌一系列血管活性物質(zhì)調(diào)節(jié)血液的自分泌、內(nèi)分泌或旁分泌，改善血流、血管壁張力、血管生成和炎癥。由于其屏障功能，血管內(nèi)皮細(xì)胞更容易受到物理或化學(xué)危險(xiǎn)因素誘導(dǎo)的損傷[1]，因此血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷發(fā)生在許多臨床事件中，包括血管生成、動(dòng)脈粥樣硬化、血栓形成、高血壓和心力衰竭[2]。

自噬可以消除不必要或功能失調(diào)的細(xì)胞器和細(xì)胞。眾所周知，伴隨輕鏈 3 Ⅰ/Ⅱ (LC3 Ⅰ/Ⅱ)和Beclin 1變化的自噬功能障礙與許多疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。LC3 Ⅱ是LC3的脂化形式，已被證明是哺乳動(dòng)物的自噬體標(biāo)志物，并已應(yīng)用于研究多種炎癥條件下的自噬[3]。 Beclin 1是自噬體成核復(fù)合物的關(guān)鍵成分，可促進(jìn)LC3轉(zhuǎn)化和 LC3 斑點(diǎn)的形成。自噬被破壞，通常會(huì)發(fā)生LC3 Ⅱ和Beclin 1 的表達(dá)降低[4]。一些證據(jù)表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬功能障礙導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙和血管穩(wěn)態(tài)破壞，進(jìn)一步導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)病機(jī)制[5]。此外，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 是細(xì)胞代謝的主要調(diào)節(jié)因子，是調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵分子[6]。

槲皮素是一種黃酮類(lèi)化合物，主要存在于中藥材。研究[7]表明，槲皮素具有抗氧化、抗癌和抗炎特性，重要的是，槲皮素已被證明可以保護(hù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)過(guò)氧化氫引起的損傷。而且槲皮素已被證實(shí)可在高糖水平可以介導(dǎo)部分細(xì)胞系自噬[8]，且氧化應(yīng)激損傷的線粒體、細(xì)胞可通過(guò)機(jī)體內(nèi)的自噬降解提高抗氧化能力，增強(qiáng)細(xì)胞活力。因此，槲皮素有可能通過(guò)介導(dǎo)自噬來(lái)防止內(nèi)皮細(xì)胞損傷。本研究主要分析了槲皮素是否可以保護(hù) HUVECs 免受過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的損傷并識(shí)別可能涉及的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試藥及儀器 HUVEC(編號(hào)7-1074)購(gòu)自齊氏生物科技有限公司。槲皮素(成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)：180704)；兔抗人LC3 Ⅰ/Ⅱ(批號(hào)：ABC929)、AKT(批號(hào)：SAB4500797)、mTOR(批號(hào)：T2949)、β-actin(批號(hào)：A3653)抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(美國(guó)，Sigma公司)。 CBl50 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國(guó)Binder公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)，BioTek)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，輔以10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素，采用5% CO2在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，并進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2 分組、建模和給藥 HUVEC以8×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在 96孔板中。細(xì)胞貼壁后，分為對(duì)照組(RPMI-1640 培養(yǎng)基)，H2O2組(200 μmol/L H2O2)，陽(yáng)性對(duì)照組(200 μmol/L H2O2+50 μg/mL 維生素 E)，槲皮素組 (200 μmol/L H2O2+30、15、7.5 μmol/L槲皮素)。

1.2.3 MTT檢測(cè) HUVEC 以 8×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96孔板中。 細(xì)胞貼壁后，依據(jù)實(shí)驗(yàn)分組給藥，48 h后將 MTT(20 μL 0.5 mg/μL PBS溶液)加入每個(gè)孔中，并將板置于37 ℃下孵育4 h。然后介質(zhì)去除并在每個(gè)孔中加入 DMSO(150 μL)，維持10 min以溶解紫色甲臜晶體。使用酶標(biāo)儀570 μm 處測(cè)定吸光度?；谝韵鹿接?jì)算細(xì)胞活力的百分比：細(xì)胞活力(%)=A570給藥組/A570對(duì)照組×100%。

1.2.4 MDC染色 MDC 染色用作自噬囊泡的示蹤劑，陽(yáng)性細(xì)胞在其核區(qū)周?chē)?，所有酸性液泡被染色。?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種在24孔板中，設(shè)置對(duì)照組(RPMI-1640 培養(yǎng)基)，H2O2組(200 μmol/L H2O2)，槲皮素組 (200 μmol/L H2O2+30、15、7.5 μmol/L槲皮素)，培養(yǎng)48 h制作細(xì)胞爬片，細(xì)胞爬升片制備過(guò)夜進(jìn)行組處理，37 ℃水浴中加入0.05 mmol/L MDC處理 15 min，用 PBS 洗滌 3 次，然后用 4% 多聚甲醛固定 15 min。 然后在抗熒光淬滅載玻片上進(jìn)行熒光顯微鏡避光觀察。

1.2.5 Western blotting實(shí)驗(yàn) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種在6孔板中，設(shè)置對(duì)照組(RPMI-1640 培養(yǎng)基)，H2O2組(200 μmol/L H2O2)，槲皮素組 (200 μmol/L H2O2+30、15、7.5 μmol/L槲皮素)，培養(yǎng)48 h。將細(xì)胞在含有1 mmol/L PMSF的 RIPA緩沖液裂解。收集上清液并通過(guò)BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。在8%～15%梯度SDS-PAGE凝膠上加載和分離蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。用脫脂牛奶封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)1 h后，將膜與LC3B(1∶1 000)、p-AKT(1∶2 000)、AKT(1∶2 000)、p-mTOR(1∶2 000)、mTOR(1∶2 000)、β-actin(1∶1 000)一抗一起孵育過(guò)夜。然后將膜與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗在室溫下以1∶5 000 稀釋度孵育1 h。條帶通過(guò)WD-9413B成像系統(tǒng)檢測(cè)，ImageJ 軟件(1.51a 版)用于分析條帶密度。

1.2.6 3-MA對(duì)槲皮素誘導(dǎo)自噬的影響 實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組、H2O2組(200 μmol/L H2O2)，槲皮素組 (200 μmol/L H2O2+30 μmol/L槲皮素)，槲皮素(200 μmol/L H2O2+30 μmol/L槲皮素)+3-MA(10 mmol/L 3-MA)組，處理48 h，每孔添加20 μL MTT，孵育 4 h。570 nm測(cè)量光密度，Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對(duì)細(xì)胞活力的影響 與對(duì)照組比較，H2O2組細(xì)胞吸光度值明顯降低(P<0.01),提示模型建立成功。與H2O2組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、30、15、7.5 μmol/L槲皮素組吸光度值明顯增加(P<0.01)(見(jiàn)表1)。

2.2 槲皮素對(duì)細(xì)胞中自噬體的影響 與H2O2組比較，槲皮素能增加HUVEC中MDC染色標(biāo)記的熒光顆粒，并伴隨槲皮素濃度的上調(diào)明顯增加(P<0.01)(見(jiàn)圖1、表2)。

2.3 槲皮素對(duì)自噬相關(guān)蛋白的影響 槲皮素能促進(jìn)HUVEC中自噬蛋白LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ水平表達(dá)(P<0.01)，降低p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平(P<0.01)(見(jiàn)圖2、表3)。

2.4 3-MA對(duì)槲皮素誘導(dǎo)自噬的影響 與對(duì)照組比較，H2O2組LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ明顯降低(P<0.01)，p-mTOR/mTOR明顯增加(P<0.01)，細(xì)胞活力明顯下調(diào)(P<0.01)；與槲皮素組比較，槲皮素+3-MA組LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ明顯降低(P<0.05)，p-mTOR/mTOR明顯增加(P<0.05)，細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)(見(jiàn)圖3、表4)。

表1 槲皮素對(duì)細(xì)胞活力的影響(ni=3)

表2 各組HUVEC細(xì)胞MDC相對(duì)熒光強(qiáng)度

表3 槲皮素對(duì)自噬相關(guān)蛋白的影響

3 討論

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是一種高血糖條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的主要因素。文獻(xiàn)[9]顯示，槲皮素可被視為抗氧化劑。目前的研究顯示，槲皮素可以改善 HUVECs 暴露于高濃度葡萄糖后的抗氧化防御系統(tǒng)。例如用槲皮素處理后，用 30 mmol/L 葡萄糖處理的HUVECs細(xì)胞的丙二醛和活性氧自由基顯著降低[10]。因此，槲皮素對(duì)調(diào)節(jié)氧化劑/抗氧化劑失衡，減少氧化劑對(duì)血管內(nèi)皮損傷具有一定的功能，即通過(guò)抗氧化劑清除氧自由基，減少氧化損傷和隨后的細(xì)胞死亡，并可以通過(guò)自噬清除損傷的線粒體、細(xì)胞，提高細(xì)胞活力。在本研究中，7.5、15、30 μmol/L槲皮素能有效地提高HUVECs細(xì)胞活力，這也證實(shí)了上述的觀點(diǎn)。并且30 μmol/L槲皮素處理HUVECs后，細(xì)胞活力達(dá)到了74.17%，因此后續(xù)驗(yàn)證槲皮素調(diào)控自噬的機(jī)制時(shí)，選擇了該濃度進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

表4 3-MA對(duì)槲皮素誘導(dǎo)自噬的影響

槲皮素對(duì)H2O2引起的細(xì)胞損傷的有效抗氧化能力機(jī)制比較復(fù)雜，其中自噬作為一種分解代謝過(guò)程，能消除受損細(xì)胞器，在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。自噬受自噬相關(guān)基因編碼的一些特殊蛋白質(zhì)的嚴(yán)格調(diào)控相關(guān)程序[10]。在這些蛋白質(zhì)中，LC3 對(duì)于自噬體的生物發(fā)生或成熟是必不可少的，它還可作為選擇性自噬的銜接蛋白發(fā)揮作用。根據(jù)多種文獻(xiàn)，LC3 Ⅰ被轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3 Ⅱ，這是自噬早期的一個(gè)眾所周知的標(biāo)志物[12]。而AKT/mTOR信號(hào)通路是負(fù)性調(diào)控自噬的經(jīng)典途徑，活化AKT使 AKT 發(fā)生磷酸化，之后將信號(hào)傳至mTOR，觸發(fā)mTOR磷酸化，從而激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路,mTOR通過(guò)影響自噬體的形成，對(duì)自噬起負(fù)調(diào)控作用。本研究中，槲皮素會(huì)抑制HUVECs細(xì)胞中的AKT/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)，誘導(dǎo)自噬體形成和LC3 Ⅱ 的上調(diào)。自噬阻斷 (3-MA) 可有效緩解槲皮素對(duì)自噬的影響，表明自噬激活有助于槲皮素促進(jìn)細(xì)胞增殖。而且自噬阻斷，還會(huì)進(jìn)一步影響AKT/mTOR信號(hào)通路的分子水平，自噬抑制劑 3-MA和30 μmol/L槲皮素共同處理HUVECs細(xì)胞，LC3 Ⅱ表達(dá)水平較30 μmol/L槲皮素組明顯減弱，mTOR磷酸化水平明顯加強(qiáng)，而mTOR磷酸化水平受到p-AKT的調(diào)控，這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步表明 AKT/mTOR信號(hào)通路參與了 HUVECs細(xì)胞自噬，并調(diào)控細(xì)胞增殖。

總之，槲皮素可通過(guò)抑制 AKT/mTOR信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬并促進(jìn) HUVECs細(xì)胞增殖。這些數(shù)據(jù)闡明了槲皮素改善血管內(nèi)皮功能的潛在機(jī)制，并表明其作為靜脈內(nèi)皮細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑的潛在治療價(jià)值。