王剛， 楊麗君， 楊丹， 段壬澤， 趙方毓， 陳顯兵

延齡草總皂苷通過調(diào)控GRP78/IRE1α/TRAF2/JNK信號通路抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激而減輕PSCI大鼠海馬神經(jīng)元損傷*

王剛， 楊麗君， 楊丹， 段壬澤， 趙方毓， 陳顯兵△

（湖北民族大學附屬民大醫(yī)院病理科，湖北民族大學醫(yī)學部，湖北 恩施 445000）

探討延齡草總皂苷（TST）對卒中后認知障礙（PSCI）大鼠海馬神經(jīng)元的保護作用及分子機制。將采用改良Zea Longa線栓法造模成功的大鼠隨機分為模型（model）組、TST（100 mg/kg）組和鹽酸多奈哌齊（DON； 0.45 mg/kg）組，另設假手術（sham）組，每組10只，連續(xù)給藥4周。采用Morris水迷宮實驗檢測大鼠學習記憶能力；TTC染色檢測大鼠腦梗死體積變化，HE、Nissl和TUNEL染色觀察大鼠海馬組織神經(jīng)元病理變化；免疫組化及Western blot檢測葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、肌醇需求酶1α（IRE1α）、腫瘤壞死因子受體相關因子2（TRAF2）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）、胱天蛋白酶12（caspase-12）、Bax和Bcl-2的蛋白水平。與sham組相比，model組大鼠逃避潛伏期顯著延長，穿越平臺次數(shù)及目標象限停留時間顯著減少（<0.01）；大鼠腦梗死體積顯著增大，神經(jīng)元尼氏小體數(shù)量顯著減少，凋亡細胞顯著增多；海馬組織中GRP78、IRE1α、TRAF2、p-JNK、caspase-12和Bax蛋白水平顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低（<0.01）。與model組比較，TST組及DON組大鼠逃避潛伏期顯著縮短，穿越平臺次數(shù)及目標象限停留時間顯著增加（<0.01）；大鼠腦梗死體積顯著縮小，神經(jīng)元尼氏小體數(shù)量顯著增多，凋亡細胞顯著減少；GRP78、IRE1α、TRAF2、p-JNK、caspase-12和Bax蛋白水平顯著降低，Bcl-2蛋白水平顯著升高（<0.01）。TST對PSCI大鼠海馬神經(jīng)元具有保護作用，其機制可能與減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、減少神經(jīng)元凋亡并抑制GRP78/IRE1α/TRAF2/JNK信號通路有關。

延齡草總皂苷；卒中后認知障礙；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激；細胞凋亡；GRP78/IRE1α/TRAF2/JNK信號通路

卒中后認知障礙（post-stroke cognitive impairment， PSCI）是指由卒中引起的從輕度認知障礙到癡呆的一系列綜合征，是世界范圍內(nèi)卒中后發(fā)病率和死亡率的主要來源。PSCI包括兩種不同程度的認知損害，即卒中后認知障礙非癡呆（post-stroke cognitive impairment with no dementia， PSCIND）和卒中后癡呆（post-stroke dementia， PSD）。研究表明，19.3%的卒中患者在中風后10年內(nèi)發(fā)展為癡呆癥［1］。因此，針對PSCI早期干預治療，阻止PSCI向PSD發(fā)展，是亟待解決的問題。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress， ERS）是指細胞受到各種應激因素的影響，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)出現(xiàn)錯誤折疊和未折疊蛋白質(zhì)積聚、Ca2+平衡紊亂，引起細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡的狀態(tài)［2-3］。而未折疊蛋白反應（unfolded protein response， UPR）是指ER應激發(fā)生時，細胞為促進蛋白質(zhì)正確折疊，或降解錯誤折疊蛋白質(zhì)而產(chǎn)生的應激反應［4］。PSCI的發(fā)病機制復雜，有缺血再灌注損傷、氧化應激、炎癥反應、自噬等機制［5-6］。研究顯示，ERS在PSCI發(fā)展過程中起重要作用，適當?shù)腅RS有利于去除錯誤折疊的蛋白質(zhì)，對疾病的病理過程起到保護作用［7］。但是，在嚴重或長期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的病理條件下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的生物學功能受損，引發(fā)海馬神經(jīng)元凋亡，從而導致認知功能下降［8-9］。目前，能夠引起細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導途徑共有三種：死亡受體信號途徑、線粒體途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑［10-11］。而在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的凋亡途徑中，JNK和caspase-12的激活起著重要作用［12-13］。

延齡草（Maxim， TTM）又名頭頂一顆珠，為湖北省恩施地區(qū)珍貴的土家藥材，該藥味甘、性平，有小毒。前期研究發(fā)現(xiàn)，其提取物TTM總皂苷（total saponins from TTM， TST）具有抗氧化、延緩衰老和神經(jīng)保護作用，但其作用效果和分子機制仍有待深入研究［14-15］。因此，本項工作采用改良線栓法行大腦中動脈栓塞術制備PSCI大鼠模型，進一步探討其對PSCI大鼠學習記憶能力及海馬神經(jīng)元的保護機制。

材料和方法

1　實驗動物

SPF級雄性SD大鼠60只，2月齡，體質(zhì)量（200±20） g，由三峽大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（鄂）2017-0012。動物飼養(yǎng)在本校清潔級動物房，溫度控制在23～25 ℃，相對濕度控制在50%～60%，常規(guī)適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

2　藥品、試劑與儀器

頭頂一顆珠采自恩施本地，經(jīng)專家鑒定為百合科延齡草屬植物延齡草的干燥根莖。潔凈藥材后，經(jīng)烘干粉碎置于圓底燒瓶內(nèi)，加入適量75%乙醇浸泡萃取。將提取后的藥液過濾并濃縮干燥，得延齡草提取物，加入雙蒸水將提取物完全溶解，采用飽和正丁醇再次萃取，減壓濃縮干燥，檢測提取物中總皂苷含量為14.72 mg/g生藥。鹽酸多奈哌齊（donepezil hydrochloride， DON）片（批號：0000001782，浙江華海藥業(yè)股份有限公司）。

TTC染液（批號：G3005，Solarbio）；TUNEL凋亡試劑盒（批號：E-CK-A321，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；免疫組化試劑盒（批號：2201269710A，福州邁新生物技術開發(fā)有限公司）；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78， GRP78）抗體、肌醇需求酶1α（inositol-requiring enzyme 1α， IRE1α）抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG和HRP標記的山羊抗小鼠IgG（批號分別為ab21685、ab37073、ab6721和ab6789；Abcam）；腫瘤壞死因子受體相關因子2（tumor necrosis factor receptor-associated factor 2， TRAF2）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase， p-JNK）和胱天蛋白酶12（caspase-12）抗體（批號分別為：ML02846、WL01813、WL03268，萬類生物技術有限公司）；Bcl-2和Bax抗體（批號分別為A19693和A19684，ABclonal）；β-actin抗體（批號：66009-1-Ig，武漢三鷹生物技術有限公司）。

1510型酶標儀（Thermo Scientific）；水迷宮系統(tǒng)（Top Scan 2.00）；Western Blot電泳及轉(zhuǎn)膜全套裝置（Bio-Rad）。

3　主要方法

3.1大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion， MCAO）大鼠模型的制備60只SD大鼠隨機分為造模組（50只）和假手術（sham）組（10只）。造模組參照文獻［16］采用改良Zea Longa線栓法制備MCAO大鼠模型；sham組僅切開皮膚，鈍性分離肌肉及筋膜，分離出左側(cè)頸總動脈后即縫合切口。手術后將動物置于放有清潔墊料的飼養(yǎng)盒內(nèi)并維持大鼠體溫，待大鼠蘇醒后進行行為學評分，1～3分為造模成功。其中造模組50只大鼠術后共死亡13只，sham組無死亡，剩余存活造模組大鼠進行神經(jīng)功能評分，納入評分標準的造模大鼠一共30只。

3.2MCAO模型的評價與動物的分組干預按照Zea Longa 5分法對造模后1、3、7、14和28 d大鼠神經(jīng)功能進行評分，并將30只造模成功大鼠隨機分為模型（model）組（10只）、TST組（10只）和DON組（10只），連同上述sham組（10只）大鼠進行實驗。根據(jù)動物與人體間等效劑量確定各組大鼠的給藥量，TST組給予100 mg/kg TST進行灌胃，DON組給予0.45 mg/kg DON進行灌胃，sham及model組給予等體積的雙蒸水灌胃，各組均連續(xù)灌胃28 d。

3.3Morris水迷宮評價大鼠學習記憶能力給藥結(jié)束當天對大鼠進行定位航行實驗，共持續(xù)5 d，提前將實驗大鼠搬進水迷宮實驗室以適應新環(huán)境，系統(tǒng)自動將圓形水面分為4個象限，求生平臺放在第3象限略低于水面0.6～1.0 cm處，大鼠面向池壁分別沿第1、2、4象限放入，系統(tǒng)自動記錄60 s內(nèi)大鼠尋找平臺所需時間，即逃避潛伏期；第6天休息；第7天上午進行正式定位航行實驗，將大鼠沿第1象限放入求得尋找平臺所需時間，下午進行空間探索實驗，將平臺撤去，大鼠沿第1象限放入，記錄60 s內(nèi)大鼠穿越平臺次數(shù)及目標象限停留時間比，并進行統(tǒng)計分析。

3.4腦組織灌注及海馬病理形態(tài)學觀察給藥7 d后每組隨機挑選出3只大鼠進行TTC染色，以10%水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，將大腦完整剝?nèi)〕龊螅?20 ℃冰箱冷凍20 min，沿冠狀位切1 mm厚片，加入適量TTC染液覆蓋腦組織，放入37 ℃恒溫箱中20 min，期間注意翻面，拍照分析；給藥28 d后每組取3只大鼠進行灌注固定，大鼠麻醉后，經(jīng)心臟灌注固定，斷頭取全腦，沿大腦視交叉處做4～5 mm冠狀切片，將其置于4%多聚甲醛中固定48 h。常規(guī)脫水、石蠟包埋后，行4 μm石蠟切片，進行HE、Nissl和TUNEL染色，切片掃描并觀察腦組織形態(tài)改變情況。

3.5免疫組化測定GRP78、IRE1α、TRAF2、p-JNK和caspase-12蛋白在海馬CA1區(qū)的表達定位腦組織被制成3 μm石蠟切片后，置于75 ℃攤片機中烘烤2 h，二甲苯脫蠟3次，每次10 min，無水乙醇浸泡3次，每次5 min，純水沖洗2 min，置于檸檬酸鈉配成的修復液中，水浴修復20 min。自然冷卻室溫后，組化筆圈起組織，PBS沖洗3次，每次3 min。嚴格按照免疫組化試劑盒說明操作，滴加A液（內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑）反應10 min；PBS沖洗3次，除去PBS，滴加B液（非特異染色阻斷劑）反應10 min，滴加稀釋好的GRP78抗體（1∶1 000）、IRE1α抗體（1∶500）、TRAF2抗體（1∶200）、p-JNK抗體（1∶200）和caspase-12抗體（1∶200），室溫孵育1 h；PBS沖洗3次，除去PBS，滴加C液（生物素標記的羊抗兔IgG聚合物），反應10 min；PBS沖洗3次，除去PBS，滴加D液（辣根過氧化物酶）反應10 min；PBS沖洗3次，除去PBS，滴加DAB顯色液避光顯色2 min，PBS沖洗3次，置于蘇木素中復染1 min，水洗1 min，分化30 s，水洗1 min，返藍15 s，水洗1 min，無水乙醇2 min，二甲苯2 min，中性樹膠濕封，切片掃描分析。

3.6Western blot檢測海馬中相關蛋白表達大鼠麻醉后，斷頭取腦，冰上剝?nèi)∽髠?cè)海馬并標記好放入-80 ℃?zhèn)溆茫环Q取50 mg組織放入EP管中，加入裂解液和PMSF混合液（100∶1）500 μL，冰上剪碎、研磨、超聲、裂解，得到混懸液，10 080×離心15 min，吸取上清液，配平組織蛋白濃度。制備12% SDS-PAGE凝膠，依次進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜；加入GRP78抗體（1∶1 000）、IRE1α抗體（1∶1 000）、TRAF2抗體（1∶1 000）、p-JNK抗體（1∶500）、caspase-12抗體（1∶1 000）、Bax抗體（1∶1 000）和Bcl-2抗體（1∶1 000），4 ℃冰箱孵育過夜；次日洗膜，Ⅱ抗室溫孵育1 h；洗膜，滴加ECL顯色液進行曝光處理，采用GIS 1D圖像分析軟件進行灰度值計算。

4　統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)分析處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1　各組大鼠神經(jīng)功能評分的比較

如圖1所示，術后model組中的大鼠神經(jīng)功能評分在前階段呈現(xiàn)出升高的趨勢，3 d后出現(xiàn)降低的趨勢，TST組與DON組在給藥兩周后神經(jīng)功能恢復顯著。與sham組比較，model組大鼠術后神經(jīng)功能評分顯著升高（<0.01）；與model組比較，TST組及DON組神經(jīng)功能評分顯著降低（<0.01）；TST組與DON組比較無統(tǒng)計學意義。

Figure 1. Comparison of neurological function scores of the rats in each group. Mean±SD. n=7. **P<0.01 vs sham group； ##P<0.01 vs model group.

2　TST對PSCI大鼠學習記憶能力的影響

如圖2所示，sham組與給藥組大鼠路線清晰較短且表現(xiàn)出一定的目標趨向性，model組大鼠路線雜亂且長目標趨向混亂。與sham組相比，model組大鼠逃避潛伏期時間顯著增加（<0.01），穿越平臺次數(shù)（<0.05）及目標象限停留時間顯著減少（<0.01）；與model組相比，TST組和DON組大鼠逃避潛伏期時間顯著減少（<0.01），穿越平臺次數(shù)（<0.05）及目標象限停留時間顯著增加（<0.01），見圖3。

Figure 2. Morris water maze swimming trajectories of the rats in each group.

Figure 3. The results of Morris water maze experiment in the rats of each group. A： escape latencies in rats for 5 consecutive days； B： bar chart of escape latency of the rats in each group； C： the times of the rat crossing the platform within 60 s； D： the ratio of the time that the rats stay in the target quadrant. Mean±SD. n=7. **P<0.01 vs sham group； #P<0.05， ##P<0.01 vs model group.

3　TST對各組大鼠腦梗死體積的影響

如圖4所示，假手術組大鼠腦組織呈均勻紅色，無缺血梗死灶，其它各組大鼠腦組織均有不同程度的缺血梗死灶出現(xiàn)。與sham組相比，model組大鼠左側(cè)腦組織白色缺血梗死灶顯著增大，與model組相比，TST組及DON組大鼠左側(cè)腦組織白色缺血梗死灶顯著減小。

Figure 4. The effect of TST on the volume of cerebral infarction in the rats of each group. In sham group， the brain tissue was uniformly red， with no ischemic infarction； in model group， the left brain tissue had obvious white ischemic infarction； the left infarction in TST group and DON group decreased to varying degrees.

4　TST對PSCI大鼠海馬組織病理變化的影響

如圖5所示，sham組大鼠腦組織著色均勻，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元飽滿豐富、排列整齊、數(shù)量較多，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的尼氏體。皮質(zhì)區(qū)細胞排列緊密，細胞核著色清晰，未見明顯的壞死細胞及空泡化現(xiàn)象；與sham組相比，model組大鼠腦組織著色不均，皮質(zhì)區(qū)域著色較淺，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，胞質(zhì)中尼氏體明顯減少，出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象。皮質(zhì)區(qū)出現(xiàn)大量壞死細胞及空泡化現(xiàn)象；與model組相比，TST組及DON組大鼠腦組織著色較為均勻，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元較飽滿，胞質(zhì)內(nèi)尼氏體明顯增多，空泡化現(xiàn)象減少。皮質(zhì)區(qū)著色較深，細胞空泡化現(xiàn)象及壞死細胞明顯減少。

Figure 5. The effect of TST on the pathological changes of brain tissue in PSCI rats （HE staining， scale bar=1 000 μm in HP， scale bar=50 μm CA1 and CA3； Nissl staining， scale bar=50 μm in CA1 and CA3）. In sham group， the nerve cells were neatly arranged， complete and abundant， and there were abundant Nissl bodies in the cytoplasm. In model group， part of the cerebral cortex showed a loose mesh structure， the arrangement of nerve cells was disordered， the cells shrank， the cell number decreased， and the Nissl bodies in the cytoplasm decreased significantly. In TST group and DON group， the atrophic morphology of nerve cells was improved， the cell number increased， and the Nissl bodies in the cytoplasm increased significantly.

5　TST對PSCI大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

如圖6所示，圖中顯藍色為細胞核，綠色為凋亡標記神經(jīng)元。與sham組相比，model組大鼠海馬CA1區(qū)綠色熒光強度明顯增強，陽性細胞數(shù)量明顯增多。與model組相比，TST組及DON組大鼠海馬CA1區(qū)綠色熒光強度明顯減弱，陽性細胞數(shù)量明顯減少。

Figure 6. The effect of TST on the apoptosis of hippocampal neurons in PSCI rats （scale bar=50 μm）. In sham group， the green fluorescence intensity in the CA1 region of the hippocampus was weak， and the number of apoptotic cells was small. In model group， the green fluorescence intensity in the CA1 region of the hippocampus was significantly enhanced， and the number of apoptotic cells increased. The green fluorescence intensity in hippocampal CA1 area of TST group and DON group was significantly weakened， and the number of positive cells was significantly reduced.

6　TST對大鼠海馬CA1區(qū)GRP78、IRE1α、TRAF2、p-JNK和caspase-12蛋白定位表達的影響

如圖7所示，掃描圖像400倍放大后顯示，除IRE1α為細胞核表達外，其余蛋白均為胞質(zhì)表達。與sham組相比，model組大鼠海馬CA1區(qū)GRP78、IRE1α、TRAF2、p-JNK和caspase-12的陽性細胞數(shù)量顯著增多；與model組相比，TST組及DON組GRP78、IRE1α、TRAF2、p-JNK和caspase-12的陽性細胞數(shù)量顯著減少。

Figure 7. The effect of TST on the protein expression and localization of GRP78， IRE1α， TRAF2， p-JNK and caspase-12 in the CA1 region of the rat hippocampus （scale bar=50 μm）. In sham group， the numbers of positive cells for GRP78， IRE1α， TRAF2， p-JNK and caspase-12 in the CA1 region of the hippocampus were less. In model group， the numbers of positive cells of GRP78， IRE1α， TRAF2， p-JNK and caspase-12 in the CA1 region of the hippocampus increased significantly. In TST group and DON group， the numbers of positive cells for GRP78， IRE1α， TRAF2， p-JNK and caspase-12 were significantly reduced compared with model group.

7　TST對大鼠海馬組織GRP78、IRE1α、TRAF2、p-JNK、caspase-12、Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

如圖8所示，與sham組相比，model組大鼠海馬組織GRP78、IRE1α、TRAF2、p-JNK、caspase-12和Bax的蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2的蛋白表達水平顯著降低（<0.01）；與model組相比，TST組及DON組大鼠海馬組織GRP78、IRE1α、TRAF2、p-JNK、caspase-12和Bax的蛋白表達水平顯著降低，Bcl-2的蛋白表達水平顯著升高（<0.01）。

Figure 8.　The effect of TST on the protein levels of GRP78， IRE1α， TRAF2， p-JNK， caspase-12， Bax and Bcl-2 in rat hippocampus. A： the protein levels of GRP78， IRE1α， TRAF2 and p-JNK； B： the protein levels of caspase-12， Bax and Bcl-2. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs sham group； ##P<0.01 vs model group.

討論

缺血性腦卒中是一種急性腦血管疾病，其特征是大腦局部的血流突然中斷，導致局部產(chǎn)生缺血缺氧狀態(tài)，認知功能損害是其并發(fā)癥之一。研究顯示，ERS是導致神經(jīng)元損傷的關鍵因素之一，也被認為是缺血性腦損傷干預的潛在治療靶點。腦缺血后，蛋白質(zhì)的錯誤折疊和過度積累，以及缺血再灌注引起的ROS過度產(chǎn)生，會觸發(fā)ERS并增加神經(jīng)元凋亡，從而導致認知功能的下降［17-18］。本研究采用水迷宮對各組大鼠的學習記憶能力進行評價，結(jié)果顯示，模型大鼠逃避潛伏期延長，尋找平臺的路徑雜亂且缺乏目標趨向性；在給予TST藥物干預后，大鼠逃避潛伏期及尋找平臺路徑縮短，目標趨向明確，這表明TST對于缺血性腦卒中引起的認知功能障礙具有明顯的改善作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是最大的管狀網(wǎng)狀細胞器，在細胞生理過程中發(fā)揮重要作用，主要負責蛋白質(zhì)的合成和折疊、鈣的儲存和釋放、脂質(zhì)的合成和分配等功能［19］。研究表明，ERS在腦缺血病理生理學中起著至關重要的作用，輕微的ERS有助于提高細胞耐受性并恢復細胞穩(wěn)態(tài)；然而，過度或長期ERS會導致細胞的凋亡［20， 21］。本研究顯示，經(jīng)改良線栓法造模后的大鼠出現(xiàn)肢體及認知功能損害，在經(jīng)TTC染色后病灶側(cè)出現(xiàn)缺血變白區(qū)域，初步判定大腦局部出現(xiàn)缺血缺氧的病理性損傷。進一步采用HE及尼氏染色對大鼠左側(cè)半腦缺氧狀態(tài)下的病理微觀變化進行分析，結(jié)果顯示，model組大鼠皮質(zhì)及海馬CA1區(qū)神經(jīng)元壞死凋亡現(xiàn)象最為顯著，神經(jīng)元出現(xiàn)排列疏松、核固縮及空泡化現(xiàn)象，且尼氏體數(shù)量顯著減少。在給予TST治療后，神經(jīng)元空泡化及核固縮現(xiàn)象顯著減輕，這說明TST對于缺血缺氧造成的神經(jīng)元丟失及損傷具有抑制作用。TUNEL染色顯示，model組海馬CA1區(qū)綠色熒光強度明顯增強，陽性細胞明顯增多，而給予TST治療后其熒光強度明顯減弱，陽性細胞數(shù)明顯減少，表明TST在一定程度上能夠抑制神經(jīng)元的凋亡，對神經(jīng)元起到一定保護作用。

研究表明，GRP78/IRE1α/TRAF2/JNK通路已被廣泛應用在調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的神經(jīng)細胞凋亡中，并且發(fā)揮重要作用［22-23］。當細胞受到輕微應激時，ERS激活UPR使GRP78與IRE1α發(fā)生解離，此時IRE1α在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上發(fā)生二聚化和自磷酸化從而激活JNK，活化后的JNK可以下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2來增強Bax依賴性凋亡［24］。然而，在長期或嚴重的應激下，IRE1α無法緩解ERS時，UPR會激活凋亡信號通路，此時激活后的IRE1α募集TRAF2，TRAF2可以募集和激活凋亡信號調(diào)節(jié)蛋白1，最終激活JNK和caspase-12通路來促進細胞凋亡，以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［25-27］。本研究顯示，model組大鼠海馬CA1區(qū)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關蛋白棕色陽性表達明顯，給予TST及DON治療后海馬CA1區(qū)棕色陽性表達減弱；Western blot結(jié)果顯示，TST能夠下調(diào)海馬組織中GRP78、IRE1α、TRAF2、p-JNK、caspase-12和Bax的蛋白表達，上調(diào)Bcl-2的蛋白表達，這表明TST可能對GRP78/IRE1α/TRAF2/JNK信號通路起到抑制作用，從而對PSCI大鼠海馬神經(jīng)元起到一定保護作用。

綜上所述，延齡草總皂苷可以改善PSCI大鼠的學習記憶能力，并能改善由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的海馬神經(jīng)元損傷，其機制可能與其抑制GAP78/IRE1α/TRAF2/JNK信號通路，上調(diào)Bcl-2的蛋白表達，下調(diào)caspase-12及Bax的蛋白表達有關。

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Total saponins fromMaxim attenuate hippocampal neuronal injury in PSCI rats by inhibiting endoplasmic reticulum stress via regulating GRP78/IRE1α/TRAF2/JNK signaling pathway

WANG Gang， YANG Lijun， YANG Dan， DUAN Renze， ZHAO Fangyu， CHEN Xianbing△

（，，，445000，）

To investigate the protective effect of total saponins fromMaxim （TST） on hippocampal neurons in rats with post-stroke cognitive impairment （PSCI）， and to explore the molecular mechanism.The rat PSCI model was successfully established by the modified Zea Longa suture method， and the rats were randomly divided into model group， TST （100 mg/kg） group， and donepezil hydrochloride （DON； 0.45 mg/kg） group. Another normal rats served as sham group. There were 10 animals in each group， and they were given continuous administration for 4 weeks. Morris water maze was used to detect the learning and memory ability of rats， TTC staining was used to detect the volume change of cerebral infarction in rats， and HE， Nissl and TUNEL staining was used to observe the pathological changes of neurons in the hippocampus of rats. The protein levels of glucose-regulated protein 78 （GRP78）， inositol-requiring enzyme 1α （IRE1α）， tumor necrosis factor receptor-associated factor 2 （TRAF2）， phosphorylated c-Jun N-terminal kinase （p-JNK）， caspase-12， Bax and Bcl-2 were detected by immunohistochemistry and Western blot.Compared with sham group， the escape latency of the rats in model group was significantly prolonged， and the number of platform crossings and the residence time in the target quadrant were significantly decreased （<0.01）. The volume of cerebral infarction in rats was significantly increased， the number of neuronal Nissl bodies was significantly decreased， and the number of apoptotic cells was significantly increased. The protein levels of GRP78， IRE1α， TRAF2， p-JNK， caspase-12 and Bax in the hippocampus were significantly increased， and the expression of Bcl-2 was significantly decreased （<0.01）. Compared with model group， the escape latency of the rats in TST group and DON group was significantly shortened， and the times of crossing the platform and the residence time of the target quadrant were significantly increased （<0.01）. The cerebral infarction volume of the rats was significantly reduced， and the number of neuronal Nissl bodies was significantly increased. Apoptotic cells were significantly reduced. The protein levels of GRP78， IRE1α， TRAF2， p-JNK， caspase-12 and Bax were significantly decreased， and the protein expression of Bcl-2 was significantly increased （<0.01）.TST has a protective effect on hippocampal neurons in PSCI rats， and its mechanism may be related to reducing endoplasmic reticulum stress and neuronal apoptosis and inhibiting GRP78/IRE1α/TRAF2/JNK signaling pathway.

total saponins fromMaxim； post-stroke cognitive impairment； endoplasmic reticulum stress； apoptosis； GRP78/IRE1α/TRAF2/JNK signaling pathway

R74； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.02.006

1000-4718（2023）02-0241-09

2022-09-30

2022-12-16

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（No. 82260821）；湖北民族大學博士啟動基金項目（No. MD2020B014）

Tel： 13517134626； E-mail： chenxianbing7612@163.com

（責任編輯：林白霜，羅森）