李雙雙，潘忠成,2*，張心心，鄭鵬飛，田利明，周 柳，張鵬飛，李蒲民

(1.陜西麥可羅生物科技有限公司，陜西 渭南 714200，2.哈爾濱工程大學(xué)材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院/教育部超輕材料與表面技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150001,3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西 太古 030801)

近年來(lái)，越來(lái)越多的人們開始關(guān)注飲食營(yíng)養(yǎng)和保健作用，藥食同源的紅棗被人們愈加關(guān)注[1]。棗原產(chǎn)于我國(guó)，至少有3000多年的栽培歷史，且我國(guó)是世界上棗產(chǎn)量最大的國(guó)家[2-3]。紅棗含有豐富的cAMP、VC、多酚類、黃酮類以及多糖類等功能成分，同時(shí)又為補(bǔ)中益氣、養(yǎng)血安神、緩和藥性的常用中藥，是集營(yíng)養(yǎng)與醫(yī)療保健于一體的優(yōu)質(zhì)滋補(bǔ)品[4]。

1.1 cAMP研究進(jìn)展

環(huán)磷酸腺苷(Adenosine3'，5'-cyclicmonophosphate，簡(jiǎn)稱cAMP)化學(xué)式為C10H12N5O6P，在成熟棗果肉中含量為一般動(dòng)植物的數(shù)千至數(shù)萬(wàn)倍，是棗果中最重要的生物活性物質(zhì)[5]。它是蛋白激酶致活劑，是最重要的胞內(nèi)信使之一，能參與細(xì)胞分裂與分化、形態(tài)建成、類固醇生成、糖原和脂肪分解等多種生理生化過(guò)程，在基因表達(dá)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，能抑制細(xì)胞增殖、癌細(xì)胞、過(guò)敏性疾病等，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)也有調(diào)節(jié)作用，還能誘導(dǎo)激素或酶的合成，促進(jìn)機(jī)體合成代謝[6-8]。還有研究表明，包括癌癥、高血壓、冠心病、心肌梗塞在內(nèi)的40余種疾病均與人體內(nèi)cAMP代謝相關(guān)[9-10]。

1957年Sutherland[11-12]從哺乳動(dòng)物的組織中發(fā)現(xiàn)了cAMP。劉孟軍和王永蕙[13]對(duì)棗和酸棗等14種植物的cAMP進(jìn)行了研究，測(cè)定結(jié)果表明，棗和酸棗含量明顯高于其他植物，并且山西木棗成熟果肉中含量最高。由于大棗中cAMP含量豐富，近年來(lái)從棗中提取cAMP的相關(guān)的研究較多。JCyong等[14]率先從棗中分離出cAMP，利用離子交換柱法并優(yōu)化了該分離提取工藝。環(huán)磷酸腺苷的測(cè)定方法有高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，簡(jiǎn)稱HPLC)、競(jìng)爭(zhēng)蛋白法、薄層層析、酶聯(lián)免疫法等方法。目前，HPLC已成為cAMP測(cè)定的常用方法[15]，HPLC以其分離、定量分析性能高，分析速度快、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，逐步在分析領(lǐng)域內(nèi)占據(jù)重要的地位[16]。

張明娟等[17]采用高效液相色譜法測(cè)定了8種棗果中的cAMP的含量，其中最高的為朝陽(yáng)圓棗(375.61μg/g)，最低為1-早脆王(46.01μg/g)，由該試驗(yàn)可知超聲時(shí)間、乙醇濃度、料液比對(duì)cAMP的提取有不同的影響，各因素作用主次順序?yàn)椋毫弦罕?超聲時(shí)間>乙醇濃度，料液比1：25。趙堂等[18]以寧夏幾種特色紅棗(靈武長(zhǎng)棗、同心圓棗和中寧圓棗)為研究對(duì)象，并與山東大棗、陜北灘棗進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)寧夏的靈武長(zhǎng)棗(335.71μg/g)含量最高，靈武長(zhǎng)棗以其個(gè)大、味甜等享譽(yù)國(guó)內(nèi)外。通過(guò)本研究可發(fā)現(xiàn)，靈武長(zhǎng)棗在藥用價(jià)值方面也具有一定的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，研究結(jié)果為進(jìn)一步推動(dòng)靈武長(zhǎng)棗走向國(guó)際市場(chǎng)提供了一定的科技支撐。

也有學(xué)者研究過(guò)不同處理措施對(duì)棗中環(huán)磷酸腺苷含量的變化影響。劉世軍等[19]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)與未經(jīng)炮制的大棗生品比較中，經(jīng)過(guò)炮制的大棗中環(huán)磷酸腺苷含量均有提高，其中經(jīng)過(guò)醋蒸的大棗環(huán)磷酸腺苷含量增加最為明顯。張冠楠等[20]以靈武長(zhǎng)棗為試材，采用海藻酸鈉、殼聚糖、普魯蘭多糖進(jìn)行涂膜處理。研究表明，各處理果中環(huán)磷酸腺苷含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組，其中，殼聚糖涂膜處理環(huán)磷酸腺苷含量提高最為顯著。

1.2 VC研究進(jìn)展

抗壞血酸(easorbiceaidAsA，VC)主要存在于日常食用的新鮮蔬菜水果中，它作為人體必不可少的一種維生素，可以幫助人體內(nèi)鐵的吸收，降低人體血液膽固醇濃度，預(yù)防普通感冒，促進(jìn)蛋白質(zhì)的牢聚性，防治環(huán)血病等，從而起到延長(zhǎng)壽命的效果[21]。重要的是它可以參與到人體的某些代謝活動(dòng)中，對(duì)生物氧化有重要影響，增強(qiáng)機(jī)體的抗病力和解毒作用等。在化學(xué)實(shí)驗(yàn)中也可作為還原劑、掩蔽劑及色譜分析試劑等[22]。

VC是植物中廣泛存在的一種水溶性抗氧化有機(jī)小分子，1932年Wang和King[23]首先分離出純的VC，并證明是抗壞血病因子。植物抗壞血酸首先在線粒體內(nèi)膜上合成，然后再運(yùn)輸?shù)桨麅?nèi)其他亞細(xì)胞區(qū)室和質(zhì)外體中。由于調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)運(yùn)體系的存在，抗壞血酸能夠根據(jù)生理、發(fā)育和代謝的需要在不同細(xì)胞區(qū)間迅速轉(zhuǎn)移，因此植物不同組織抗壞血酸含量存在差異[24]。在VC含量測(cè)定中，HPLC法相較于滴定法，熒光法優(yōu)勢(shì)在于穩(wěn)定性好重復(fù)性高，已有部分研究者側(cè)重使用[25-26]。

李小梅等[27]對(duì)野生酸棗果肉、酸棗仁、紅心獼猴桃和冬棗中維生素C含量進(jìn)行測(cè)定和比較。研究表明，野生酸棗果肉中維生素C的含量最高，達(dá)到436.65mg/100 g，是紅心獼猴桃的3.6倍，冬棗的1.5倍，酸棗仁中維生素C的含量最低，僅有16.353mg/100 g。石東里等[28]對(duì)濱州市21個(gè)棗品種的VC含量進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)一般鮮棗果實(shí)的抗壞血酸含量都在200mg/100 g以上，大部分在300mg/100 g～500mg/100 g之間，平均為418mg/100g，其中在500mg/100 g以上的品種有酸棗、金絲小棗、陽(yáng)信大棗、長(zhǎng)紅和濱北薄棗。

國(guó)內(nèi)外研究者為提高VC含量，做了大量研究。孫學(xué)成等[29]采用分期播種的方法研究了鉬對(duì)冬小麥葉片中VC含量的影響，結(jié)果表明施鉬提高了冬小麥葉片中VC含量，在取樣溫度較低時(shí)，VC含量上升幅度大。

1.3 外源激素：植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是經(jīng)過(guò)果實(shí)表皮、葉片的角質(zhì)膜等進(jìn)入果樹體內(nèi)來(lái)調(diào)節(jié)果樹不同時(shí)期的生長(zhǎng)發(fā)育狀況，由于它吸收好、用量小、作用大以及高效等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛被使用[30]。我國(guó)使用頻繁的屬生長(zhǎng)素與GA類的化合物，多應(yīng)用于果蔬、棉花等作物來(lái)提高產(chǎn)量。其中GA經(jīng)常被用來(lái)促進(jìn)植物芽和葉的伸長(zhǎng)與生長(zhǎng)；ABA是一種抑制高等植物生長(zhǎng)的植物激素，多用于提高花卉園藝的應(yīng)用價(jià)值。α-萘乙酸及其鈉鹽等類均具有一定的生長(zhǎng)素的活性，它能促進(jìn)根的伸長(zhǎng)和不定根的形成，以及果實(shí)、塊根和塊莖的膨大，在栽培時(shí)常被用作膨大素來(lái)使用，且經(jīng)過(guò)田間試驗(yàn)證明了它能提高蘋果、梨、葡萄、彌猴桃等果樹以及辣椒、茄子等蔬菜單果重，并大幅度提高產(chǎn)量，改善品質(zhì)。

果實(shí)的功能營(yíng)養(yǎng)隨著人們生活水平的提高愈加得到關(guān)注，同時(shí)能夠提高果實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的使用也成為農(nóng)業(yè)上必不可少的栽培技術(shù)之一，此技術(shù)也很好的為棗農(nóng)收益做出了貢獻(xiàn)?；诖?，本試驗(yàn)選定了植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)不同生長(zhǎng)期的棗進(jìn)行處理，來(lái)比較分析調(diào)節(jié)劑對(duì)果實(shí)cAMP、VC等功能物質(zhì)的動(dòng)態(tài)影響，為棗果實(shí)提高功能物質(zhì)技術(shù)的研究提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

2.1.1 試驗(yàn)點(diǎn) 試驗(yàn)地點(diǎn)在山西省太谷縣，壺瓶棗棗樹屬小冠疏層形。

2.1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在棗幼果期進(jìn)行處理。試驗(yàn)分為赤霉素(GA)、α-萘乙酸鈉、脫落酸(ABA)以及清水對(duì)照組(CK)。選擇長(zhǎng)勢(shì)一致并良好的棗樹，完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每處理分為5個(gè)重復(fù)，每小區(qū)2株。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 噴施處理及采樣 試驗(yàn)中所選用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為GA、ABA和α-萘乙酸鈉。在棗幼果期進(jìn)行噴施，共噴施6次。每次均在噴藥前進(jìn)行采樣共7次。采樣在果樹東南西北四個(gè)方向進(jìn)行，適量即可，要求果實(shí)飽滿、完好，成熟度一致。

2.2.2 測(cè)定方法

2.2.2.1 cAMP測(cè)定方法

采用HPLC法進(jìn)行測(cè)定。具體步驟如下，液氮研磨，精確稱取1.00 g棗樣到10mL離心管中，加入7mL 16%的乙醇，震蕩，黑暗條件超聲提取10min，離心10000轉(zhuǎn)10min，吸取上清液至2mL離心管里，用小離心機(jī)離心12000轉(zhuǎn)5min，離完，用移液槍取≥600 μL于小棕色瓶中，過(guò)濾膜到小棕瓶，待上樣。

色譜條件：賽默飛高效液相色譜儀C18色譜柱；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；流動(dòng)相：甲醇：磷酸二氫鉀=2：8(體積比)；流速：1mL/min；柱溫：35℃；時(shí)長(zhǎng)：10min。根據(jù)利用抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y= 7.9175X- 0.1926(R2= 0.9997)計(jì)算cAMP的含量。

2.2.2.2 Vc測(cè)定方法

采用HPLC法進(jìn)行測(cè)定。液氮研磨，準(zhǔn)確稱取0.1 g樣品，加入4mL 0.1%草酸，避光超聲提取10min，10000轉(zhuǎn)離心10min，取上清液至10mL離心管中，重復(fù)提取1次，合并2次上清液，離心10min，取上清液于2ml離心管，離心12000轉(zhuǎn)5min，用移液槍取≥600 μL于小棕色瓶中，待上樣。

色譜條件：賽默飛高效液相色譜儀C18色譜柱；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm；流動(dòng)相：0.1%草酸；流速：1mL/min；柱溫：35℃；時(shí)長(zhǎng)：8min。

其中并根據(jù)利用抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y= 0.0675X- 0.3664(R2= 0.9765)計(jì)算VC的含量。

2.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均使用Excel進(jìn)行記錄，SPSS 21.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 外源激素對(duì)cAMP的影響

果實(shí)cAMP的含量總體上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)(圖1)。方差分析表明：在幼果期進(jìn)行了1次施藥處理，表現(xiàn)為GA、ABA和α-萘乙酸鈉處理的果實(shí)cAMP的含量與CK相比差異均不顯著。在白熟期8月10日至8月20日，ABA處理的果實(shí)cAMP的含量與其他處理相比有顯著差異，白熟期8月30日，ABA處理的果實(shí)cAMP的含量顯著高于CK和GA處理的。脆熟期9月10日，ABA處理極顯著高于GA處理，顯著高于α-萘乙酸鈉處理，同時(shí)其他處理均顯著高于GA處理。完熟期無(wú)顯著性差異。其中7月30日至9月10日，GA處理的果實(shí)cAMP的含量在生長(zhǎng)過(guò)程中一直處于緩慢上升的階段，而脆熟期9月10日極顯著低于其他處理。

圖1 cAMP標(biāo)品出峰圖

圖1 不同處理對(duì)壺瓶棗cAMP含量的影響注：數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，小寫英文字母表示0.05水平差異顯著性。下同。

3.2 外源激素VC的影響

果實(shí)VC含量動(dòng)態(tài)變化如圖2所示。果實(shí)可溶性總糖的含量總體上呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。棗果在幼果期7月21日各處理的VC含量均達(dá)到最大值，分別為1661mg/100g、1564mg/100g、1648mg/100g和1587mg/100g。在白熟期8月10日，ABA處理的果實(shí)VC含量顯著高于CK處理的。其他時(shí)期各處理的果實(shí)VC含量無(wú)顯著性差異。

圖2 Vc標(biāo)品出峰圖

圖4 不同處理對(duì)壺瓶棗VC含量的影響

4 討論

本試驗(yàn)在壺瓶棗幼果期開始進(jìn)行噴施GA、ABA、α-萘乙酸鈉的栽培技術(shù)處理，并對(duì)壺瓶棗果實(shí)功能成分含量的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，噴施GA、ABA、α-萘乙酸鈉對(duì)壺瓶棗成熟期果實(shí)cAMP、VC含量會(huì)有不同程度的影響。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，果實(shí)cAMP的含量在果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)前期積累在完熟期到達(dá)最大值后又略微下降的趨勢(shì)。棗果中的cAMP參與并調(diào)節(jié)棗細(xì)胞的生理活動(dòng)以及新陳代謝，發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)和控制作用。白熟期8月10日、8月20日ABA處理的果實(shí)cAMP的含量均顯著高于CK、GA和α-萘乙酸鈉處理，不同時(shí)期分別高出77.19%、48.47%、55.62% 和72.15%、42.27%、101.98%。白熟期8月30日，ABA處理的果實(shí)cAMP的含量顯著高于CK和GA處理，分別高出2.07倍和0.79倍。脆熟期9月10日，ABA處理極顯著高于GA處理，高了8.06倍，且顯著高于α-萘乙酸鈉處理，為53.99%。其中脆熟期9月10日GA處理的果實(shí)cAMP的含量極顯著低于其他處理，可能是由于GA處理造成棗果cAMP的合成減緩，使其含量過(guò)低造成的。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)ABA處理對(duì)cAMP的含量存在一定的促進(jìn)作用。

植物體VC的含量受到品種、類別以及栽培技術(shù)和環(huán)境條件影響之外，還會(huì)受到外界因子如光強(qiáng)或晝夜溫差變化、氣候環(huán)境、水肥管理等的影響。本試驗(yàn)通過(guò)噴施外源激素觀察VC含量變化，研究結(jié)果表明，棗果實(shí)VC的含量早期最高，后隨著果實(shí)的發(fā)育VC含量逐漸下降，在完熟期有略微的上升。這與大多數(shù)的研究結(jié)果相似，都支持VC在果實(shí)不成熟期的綠色期發(fā)生迅速積累，但早期的棗果果肉呈現(xiàn)綠色，質(zhì)地較疏松，汁少，酸澀，不適宜食用。白熟期8月10日，ABA處理的果實(shí)VC含量顯著高于CK處理的，高出19.61%。這與Jiang等[31]和Liu等[32]研究結(jié)果一致，Jiang等[31]和Liu等[32]研究發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫條件下，ABA對(duì)抗壞血酸含量的影響中均表明，ABA顯著提高干旱脅迫下玉米幼苗和白皮松低溫脅迫中的VC含量。完熟期CK、GA、ABA和α-萘乙酸鈉處理的果實(shí)VC含量平均值分別為611mg/100g、642mg/100g、618mg/100g和601mg/100g，此階段是壺瓶棗最適合食用的階段，其VC含量比其他瓜果蔬菜的VC高出幾十倍甚至更多。本試驗(yàn)ABA處理以及與其他研究者相同的ABA處理，對(duì)果實(shí)中VC含量均表現(xiàn)為促進(jìn)作用。

5 結(jié)論

(1)ABA處理對(duì)完熟前期棗果實(shí)cAMP的含量有促進(jìn)作用。此外白熟期ABA處理的果實(shí)cAMP的含量顯著高于其他處理。脆熟期ABA處理極顯著高于GA處理，顯著高于α-萘乙酸鈉處理，同時(shí)其他處理均顯著高于GA處理。完熟期無(wú)顯著性差異。

(2)ABA處理能有效增加棗果VC含量利于鮮棗提高營(yíng)養(yǎng)。幼果期各處理的VC含量均達(dá)到最大值，此時(shí)棗果酸澀汁少不利于食用。白熟期ABA處理的果實(shí)VC含量顯著高于CK處理的。其他時(shí)期各處理的果實(shí)VC含量無(wú)顯著性差異。