杜 燚，楊衛(wèi)誠(chéng)，何琴琴，翁 濤，肖佳興，楊 姣

（1.貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 貴州師范大學(xué)喀斯特洞穴研究中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州赤水桫欏國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，貴州 赤水 564700）

在昆蟲與植物的關(guān)系中，植物化學(xué)成分、形態(tài)特征和各種環(huán)境因子等影響著昆蟲對(duì)寄主選擇，其中寄主植物釋放的揮發(fā)性物質(zhì)起著關(guān)鍵的作用[1]。植物的特異性化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)昆蟲產(chǎn)生多種行為，如寄主定向、產(chǎn)卵行為、取食行為等[2]。研究植食性昆蟲對(duì)寄主植物氣味的趨性有助于了解植食性昆蟲寄主選擇的機(jī)制[3]，探索新的害蟲防控措施，在利用天然活性物質(zhì)、抗蟲育種和生物防治中具有積極意義[4]。大量文獻(xiàn)報(bào)道：昆蟲利用植物所釋放的化學(xué)信號(hào)物質(zhì)進(jìn)行寄主定向。如馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata依靠馬鈴薯Solanum tuberosum葉片氣味產(chǎn)生定向選擇[5]，十字花科Brassicaceae所釋放的芥子油對(duì)小菜蛾P(guān)lutella xylostella具有吸引作用[6]，寄主白菜Brassica pekinensis氣味對(duì)桃蚜Myzus persicae有明顯的引誘作用[7]，煙草甲Lasioderma serricorne對(duì)不同辣椒Capsicum annuum揮發(fā)物表現(xiàn)出極顯著的趨向作用[8]。根據(jù)纓翅目Thysanoptera薊馬科Thripidae昆蟲借助植物氣味尋找寄主的特性，將煙堿乙酸酯和苯甲醛混合在一起制成誘芯在田間使用，能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)花薊馬的發(fā)生及為害時(shí)期，并且能大量誘殺薊馬成蟲[9]。天?？艭erambycidae、郭公甲科Cleroidea、象甲科Curculionidae和小蠹蟲科Scolytidae的昆蟲能被松針葉的揮發(fā)物α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯和莰烯所引誘[10]。但有關(guān)寄主植物氣味是否對(duì)綠帶妒尺蛾P(guān)hthonoloba viridifasciata存在引誘作用還未見報(bào)道。

綠帶妒尺蛾隸屬于鱗翅目Lepidoptera尺蛾科Geometridae，是桫欏Alsophila spinulosa和小黑桫欏Alsophila metteniana的食葉昆蟲之一[11]。在貴州赤水桫欏國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)1 a發(fā)生4～5代，幼蟲以取食嫩葉為主，蟲害暴發(fā)期，可將嫩葉和成葉取食殆盡，嚴(yán)重影響了桫欏的正常發(fā)育和繁殖[12]。桫欏和小黑桫欏隸屬于桫欏科Cyatheaceae桫欏屬Alsophila蕨類植物，其中桫欏是世界瀕危植物[13?14]、中國(guó)二級(jí)珍惜保護(hù)植物[15]。目前桫欏和小黑桫欏對(duì)綠帶妒尺蛾有效防治研究較少。避免使用化學(xué)農(nóng)藥帶來的問題，尋找綠色的防控措施對(duì)促進(jìn)有害生物的可持續(xù)控制意義重大[16]。研究綠帶妒尺蛾幼蟲對(duì)桫欏和小黑桫欏的趨向行為和寄主植物葉片的化學(xué)成分，能為桫欏和小黑桫欏的蟲害防控篩選合適的引誘劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

綠帶妒尺蛾幼蟲采自貴州赤水桫欏國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)。將野外在桫欏上采集到的初孵幼蟲放置于SPX型智能生化培養(yǎng)箱(SPX-280，寧波江南儀器廠)內(nèi)飼喂成2齡幼蟲，飼養(yǎng)條件：溫度(26±1) ℃，相對(duì)濕度為 (70±10)%，光周期為 14 h 光照/10 h 黑暗 (7:00—20:00為光照期，20:00—7:00為黑暗期)。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明：初孵幼蟲活動(dòng)能力弱，而幼蟲蟲齡越大，由于取食經(jīng)歷會(huì)形成記憶對(duì)飼養(yǎng)植物偏愛，故選擇2齡幼蟲進(jìn)行饑餓處理(24 h)作為待測(cè)幼蟲。

1.2 材料

直徑12.0 cm的培養(yǎng)皿、直徑1.5 cm的打孔器、綠色濾紙、鑷子、圓形濾紙、養(yǎng)蟲盒(長(zhǎng)14.3 cm×寬 8.5 cm×高 4.0 cm)、黑色塑料薄膜、正己烷有機(jī)溶劑 (天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)、HP6890/5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀GC/MS(美國(guó)安捷倫公司)、150 mL錐形瓶、膠頭滴管等。

1.3 供試植物

采樣點(diǎn)位于貴州赤水桫欏國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)大水溝 (28°25′10.69″N，106°01′14.85″E)，海拔為 614 m。供試植物為桫欏、小黑桫欏、中華復(fù)葉耳蕨Arachniodes chinensis和腎蕨Nephrolepis auriculata。將野外采集到的當(dāng)年生新鮮葉片帶回室內(nèi)低溫保存，測(cè)定前將4種蕨類植物嫩葉用蒸餾水沖洗干凈后，打孔器制作成1.5 cm大小的植物葉碟。對(duì)照為非寄主植物中華復(fù)葉耳蕨和腎蕨，以及綠色葉碟(外形與桫欏和小黑桫欏葉碟大小相同的綠色濾紙)。

1.4 方法

1.4.1 綠帶妒尺蛾幼蟲對(duì)植物葉碟與綠色葉碟的趨性選擇 光照和黑暗條件下，桫欏和小黑桫欏葉碟分別與綠色葉碟組合，各取2片葉碟共4個(gè)處理，1次1頭，每處理重復(fù)測(cè)定60頭。

1.4.2 綠帶妒尺蛾幼蟲對(duì)不同蕨類植物的趨性選擇 黑暗條件下，桫欏和小黑桫欏分別與腎蕨和中華復(fù)葉耳蕨組合，共4個(gè)處理，1次1頭，每處理重復(fù)測(cè)定50頭；桫欏和小黑桫欏配對(duì)，各取2片葉碟，1次1頭，重復(fù)測(cè)定65頭。

1.4.3 綠帶妒尺蛾幼蟲在4種蕨類植物共存時(shí)的趨性選擇 黑暗條件下，4種蕨類植物共存時(shí)，各取2片葉碟，“十字”交叉等距離放置于培養(yǎng)皿底部邊緣，共1個(gè)處理，1次1頭，重復(fù)測(cè)定120頭。

1.5 生物測(cè)定

利用培養(yǎng)皿[17]測(cè)定綠帶妒尺蛾幼蟲對(duì)不同葉碟的選擇頻次。選用直徑為12.0 cm的培養(yǎng)皿，在底部鋪墊相同直徑的圓形濾紙，測(cè)定前在濾紙上均勻噴灑少量蒸餾水保濕。將制作好的葉碟(圖1)放置，以“十”字交叉排列等距離放在培養(yǎng)皿的底部邊緣。放置完成后，在培養(yǎng)皿中央接入1頭已饑餓的綠帶妒尺蛾幼蟲，以幼蟲接觸葉碟并停留(3 min)作為選擇的標(biāo)準(zhǔn)(一直停留在待選擇區(qū)域的幼蟲則記為無效選擇，不計(jì)數(shù))，每頭觀察15 min，記錄觀察幼蟲對(duì)不同葉碟的趨向選擇情況，每次測(cè)定結(jié)束后更換新的試蟲，并清理培養(yǎng)皿中的實(shí)驗(yàn)材料，蒸餾水清洗干燥后用于下次測(cè)定[18]。

圖1 綠帶妒尺蛾幼蟲趨向選擇裝置Figure 1 Selection device for larvae of P.viridifasciata

整個(gè)實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)進(jìn)行，測(cè)定時(shí)間為13:00—17:00。黑暗條件將培養(yǎng)皿用黑色塑料薄膜遮蓋。

1.6 桫欏和小黑桫欏揮發(fā)物化學(xué)成分分析

1.6.1 樣品制定 稱取 5 g 桫欏和小黑桫欏新鮮嫩葉，分別放置于 150 mL 錐形瓶中。用膠頭滴管提取10 mL的正己烷加入瓶中浸濕葉片，同時(shí)每間隔5 min振蕩1次，30 min后加入2 mL的正己烷(分3次潤(rùn)洗)經(jīng)無水硫酸鈉過濾，獲得粗提物。重復(fù)3次。放入?20 ℃的冰箱內(nèi)密封低溫保存。進(jìn)樣前，用99.99%的高純氮?dú)鉂饪s至1 mL。

1.6.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) (GC-MS)分析 使用 HP6890/5975C 氣質(zhì)聯(lián)用儀 GC/MS(美國(guó)安捷倫公司)對(duì)2種桫欏植物嫩葉粗提物樣品進(jìn)行化學(xué)成分分析。色譜柱為Agilent HP-5MS(60 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱，初始溫度 70 ℃(保留 2 min)，以 5 ℃·min?1升溫至 110 ℃，再以 10 ℃·min?1升溫至310 ℃，運(yùn)行時(shí)間為45 min；汽化室溫度為250 ℃；載氣為高純氦氣(99.999%)；柱前壓為0.127 5 MPa，載氣流量為1.0 mL·min?1，不分流，溶劑延遲時(shí)間為6 min。離子源為電子轟擊離子源(EI)，離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；電子能量為70 eV；發(fā)射電流為34.6 μA；倍增器電壓為1 729V；接口溫度為280 ℃；質(zhì)量范圍為29～500。

1.7 數(shù)據(jù)處理

用Excel統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，用R語言進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用卡方檢驗(yàn)比較綠帶妒尺蛾幼蟲對(duì)不同處理的趨性選擇，用Origin 2021作圖。對(duì)總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對(duì)Nist17和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，用峰面積歸一化法測(cè)定了各化學(xué)成分的相對(duì)含量。選擇率=(選擇蟲數(shù)/測(cè)試蟲總數(shù))×100%[10]

2 結(jié)果與分析

2.1 綠帶妒尺蛾幼蟲對(duì)植物葉碟的趨性選擇

如表1所示：無論在光照或黑暗條件下，綠帶妒尺蛾幼蟲對(duì)2種蕨類植物葉碟的選擇頻次均極顯著大于對(duì)綠色葉碟的選擇頻次(P＜0.01)，說明寄主植物氣味可對(duì)綠帶妒尺蛾幼蟲產(chǎn)生引誘作用。光照環(huán)境下對(duì)桫欏和小黑桫欏的選擇率略低于黑暗環(huán)境下的選擇率，可能是在視覺作用下，綠帶妒尺蛾幼蟲被外形相似的綠色葉碟所“蒙騙”，導(dǎo)致光照條件下選擇綠色葉碟的頻次略大于在黑暗下的選擇頻次，視覺可能在寄主選擇中也發(fā)揮著一定得作用。

表1 綠帶妒尺蛾幼蟲對(duì)桫欏和小黑桫欏葉碟的趨性選擇Table 1 Selection frequencies of P.viridifasciata larvae towards A.spinulosa and A.metteniana leaf discs respectively

2.2 綠帶妒尺蛾幼蟲對(duì)不同蕨類植物的趨性選擇

由表2顯示：黑暗條件下，綠帶妒尺蛾幼蟲對(duì)桫欏分別與中華復(fù)葉耳蕨、腎蕨組合，小黑桫欏分別與中華復(fù)葉耳蕨、腎蕨組合的趨性選擇均差異極顯著(P＜0.01)，說明綠帶妒尺蛾幼蟲能依靠寄主植物氣味信息準(zhǔn)確識(shí)別寄主。綠帶妒尺蛾幼蟲對(duì)桫欏和小黑桫欏的選擇頻次無顯著差異(P＞0.05)，說明2種植物的氣味都可以對(duì)綠帶妒尺蛾幼蟲產(chǎn)生一定的吸引作用。

表2 綠帶妒尺蛾幼蟲在不同蕨類植物比較時(shí)的選擇頻次Table 2 Selection frequencies of P.viridifasciata larvae towards combinations of different ferns

2.3 綠帶妒尺蛾幼蟲在4種蕨類植物共存時(shí)的趨性選擇

如表3所示：黑暗條件下，在4種蕨類葉碟共存時(shí)，綠帶妒尺蛾幼蟲對(duì)不同蕨類葉碟的選擇頻次差異顯著(P＜0.05)，其中對(duì)桫欏的選擇頻次最高，占總頻次的38.3%。這說明在多植物環(huán)境下，綠帶妒尺蛾幼蟲可以準(zhǔn)確判斷最適宜的寄主植物，桫欏葉片所釋放的揮發(fā)物對(duì)綠帶妒尺蛾幼蟲的定向選擇具有更強(qiáng)烈的引誘作用。

表3 綠帶妒尺蛾幼蟲在 4 種蕨類植物共存條件下的選擇反應(yīng)Table 3 Selection responses of P.viridifasciata larvae towards different ferns presented together

2.4 桫欏和小黑桫欏植物化學(xué)成分

通過GC-MS分析得到桫欏和小黑桫欏嫩葉浸提物的總離子流圖TIC(圖2)。初步確定2種桫欏的化學(xué)組分主要是烴類、醇類、醛類等，共檢測(cè)出34種化合物。其中桫欏的化合物成分有23種，小黑桫欏的化合物成分有19種，同時(shí)2種桫欏共有物質(zhì)有8種。由表4可知：2種桫欏的主要成分為烴類，桫欏中相對(duì)含量最高的是二十五烷(7.75%)，小黑桫欏相對(duì)含量最高的是正二十七烷(8.84%)。其次是醇類，桫欏有5種，小黑桫欏2種，桫欏和小黑桫欏共有γ-谷甾醇、豆甾烷醇，γ-谷甾醇(5.25%)和豆甾烷醇(8.21%)在小黑桫欏的揮發(fā)性成分中所占比例要高于桫欏，而葉醇(3.04%)僅在桫欏中存在。醛類、有機(jī)酸類、脂類、胺類在桫欏和小黑桫欏中的相對(duì)含量均相對(duì)較低，對(duì)甲氧基肉桂酸辛酯在桫欏中的相對(duì)含量?jī)H有0.35%，庚醛在小黑桫欏中的相對(duì)含量?jī)H為0.1%。說明在化合物組成上，桫欏和小黑桫欏既存在相似性，同時(shí)也具有一定的差異性。

表4 寄主植物葉片浸提物成分分析Table 4 Analysis of chemical compounds of leaf extractive substances from host plants

圖2 桫欏和小黑桫欏嫩葉浸提物總離子流圖Figure 2 Total ion current diagram of the young leaves of A.spinulosa and A.metteniana

3 討論

植物揮發(fā)性物質(zhì)是一類組成復(fù)雜、分子量為100～200的混合物質(zhì)，主要包括烷烴類、醇類、醛類、酸類等，并以一定的比例組成植物獨(dú)有的化學(xué)指紋圖譜對(duì)植食性昆蟲產(chǎn)生嗅覺刺激[19]。本研究發(fā)現(xiàn)：桫欏和小黑桫欏葉片具有相似的化學(xué)指紋圖譜，化合物成分組成都以烴類為主，其次是醇類、醛類、酸類、脂類等。植物揮發(fā)物在植食性昆蟲寄主選擇中發(fā)揮著重要作用[20]。植食性昆蟲依據(jù)植物揮發(fā)物對(duì)特定植物進(jìn)行定向選擇，最終識(shí)別寄主植物進(jìn)行取食或產(chǎn)卵[21]。本研究發(fā)現(xiàn)：在光照和黑暗環(huán)境下，桫欏和小黑桫欏分別與綠色葉碟組合時(shí)，綠帶妒尺蛾幼蟲對(duì)桫欏和小黑桫欏有明顯的趨向選擇，可見桫欏和小黑桫欏釋放的氣味對(duì)綠帶妒尺蛾幼蟲有引誘作用。植食性昆蟲在寄主選擇時(shí)，視覺和嗅覺發(fā)揮著重要作用[22]。如蘋果實(shí)蠅Rhagoletis pomonella尋找寄主植物時(shí)，嗅覺會(huì)與視覺相互作用[23]。在光照條件下，寄主植物和綠色葉碟共存時(shí)，盡管外形相似，綠帶妒尺蛾幼蟲依然可以準(zhǔn)確選擇寄主植物。

植物揮發(fā)物作為引導(dǎo)植食性昆蟲的一種利他素，為植食性昆蟲—植物二級(jí)營(yíng)養(yǎng)關(guān)系建立過程中的信息化學(xué)物[24]。植食性昆蟲憑借植物的化學(xué)圖譜識(shí)別寄主植物和非寄主植物[25]。在一定距離內(nèi)，昆蟲通過嗅覺感官感知濃度達(dá)到一定閾值水平的化合物組成所代表的植物信息[26]。本次研究表明：當(dāng)寄主植物和非寄主植物對(duì)比時(shí)，綠帶妒尺蛾幼蟲可以準(zhǔn)確識(shí)別寄主植物，說明幼蟲可被寄主植物所吸引[27]。如曹鳳勤等[28]研究B型粉虱Bemisia tabaci對(duì)不同植物揮發(fā)物的行為反應(yīng)結(jié)果表明：寄主植物揮發(fā)物對(duì)其有明顯引誘作用。黃胸薊馬Thrips hawaiiensis對(duì)寄主植物揮發(fā)物有特殊偏好[29]。荔枝Litchi chinensis葉片氣味對(duì)粗脛翠尺蛾Thalassodes immissaria具有導(dǎo)向作用[30]。當(dāng)2種寄主植物對(duì)比時(shí)，綠帶妒尺蛾幼蟲對(duì)兩者的選擇并無差異，可能同為桫欏屬蕨類植物，兩者在化合物組成和含量上存在相似性。本研究通過GCMS分析桫欏和小黑桫欏葉片的化合物成分證實(shí)，2種桫欏共有8種化合物。

從進(jìn)化的角度來看，昆蟲面臨著強(qiáng)大的選擇壓力，如在尋找寄主時(shí)，往往要面對(duì)復(fù)雜的氣味環(huán)境[31]。昆蟲的感覺系統(tǒng)和搜索機(jī)制已經(jīng)進(jìn)化到處理復(fù)雜的化學(xué)物質(zhì)，從而有效地定位合適的宿主來最大化自身的適應(yīng)性[32]。如在6種植物共存時(shí)，煙葉蛾初孵幼蟲可準(zhǔn)確識(shí)別最適宜寄主植物煙草Nicotiana tabacum[33]。本研究中，在4種蕨類都存在時(shí)，綠帶妒尺蛾幼蟲可準(zhǔn)確識(shí)別最適宜寄主植物桫欏，說明對(duì)寄主氣味存在高度的特異性和敏感性[34]。在桫欏中存在的葉醇具有一定的青草氣味，同時(shí)也作為昆蟲警報(bào)、集合利用的信息素，并且還可作為防御、忌避、通信和環(huán)境安全的重要工具[35?36]，這可能是綠帶妒尺蛾幼蟲更趨向桫欏的原因之一。同時(shí)，在鱗翅目昆蟲中，由于幼蟲活動(dòng)能力受限，主要依賴于成蟲對(duì)寄主植物的產(chǎn)卵選擇[37]，如產(chǎn)卵假說認(rèn)為雌性成蟲更容易將卵產(chǎn)在有利于后代發(fā)育的寄主植物上[38]。田間采集情況發(fā)現(xiàn)，幼蟲主要集中分布在桫欏葉上，但成蟲具體如何產(chǎn)卵選擇，還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

綠帶妒尺蛾幼蟲鑒別寄主植物和非寄主的能力較強(qiáng)，能被桫欏和小黑桫欏所吸引，同時(shí)桫欏釋放的揮發(fā)物對(duì)其具有更強(qiáng)烈的引誘作用。GC-MS結(jié)果顯示：在桫欏中存在的葉醇和壬醛有望作為綠帶妒尺蛾的引誘劑成分。