王妍茜 康海軍 周娟 陳穎 楊濤 王敏 趙越越 康剛勁

1西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院眼科（四川瀘州 646000）；2遂寧市中心醫(yī)院眼科（四川遂寧 629000）

白內(nèi)障是一種由多種因素引起的晶狀體蛋白質(zhì)變性產(chǎn)生混濁而導致嚴重的可逆性視力損害和失明的眼部疾病，是全世界最常見的致盲原因。據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)分析顯示，我國70 ～79 歲人群白內(nèi)障患病率為55.5%，而80 歲以上人群白內(nèi)障患病率高達71.1%［1］，其嚴重危害老年人身心健康。晶狀體上皮細胞（lens epithelial cells，LECs）是位于晶狀體前表面的功能性細胞，由于其是光線入眼的必經(jīng)通道，極易遭受氧化損傷，進而促進晶狀體混濁，故該過程被認為是白內(nèi)障發(fā)生的分子基礎(chǔ)［2-4］。眾多研究［5-8］顯示，靶向調(diào)控氧化平衡能夠顯著抑制LECs 氧化損傷，提高細胞活性，并改善白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展。因此，改善LECs 氧化應激損傷可能是預防、延緩甚至逆轉(zhuǎn)晶狀體混濁及治療白內(nèi)障的潛在策略。

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNAs，lncRNAs）是一類不編碼蛋白質(zhì)、長度大于200 nt 的非編碼RNA，具有調(diào)控細胞增殖、周期、代謝、凋亡、分化等多種生物學功能［9］。有研究［10］表明，老年性白內(nèi)障晶狀體中LncRNAs 的表達譜與透明晶狀體不同，存在大量差異性表達的LncRNAs，提示LncRNAs 異常表達可能參與白內(nèi)障的形成。LncRNA NALT（Notch1 associated lncRNA in T cell acute lymphoblastic leukemia，NALT，簡稱NALT）位于Notch1 基因上游，長度為546 nt，位于9q34.3，可作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子激活Notch1 信號通路的轉(zhuǎn)導［11］。Notch1 信號通路的激活可以促進細胞存活，抵抗氧化應激損傷［12-13］。NALT 是否可通過調(diào)控Notch1 信號通路促進H2O2暴露下LECs 的存活目前尚不明確。本研究采用H2O2刺激人LECs建立體外氧化損傷細胞模型，探討NALT 過表達對LECs 氧化損傷的影響，并探討其可能作用機制，旨在為臨床預防、延緩白內(nèi)障提供更多的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑人晶狀體上皮細胞株SRA01/04 來源于中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院眼科晶狀體實驗室；DMEM 低糖培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco公司；NALT 過表達質(zhì)粒（pVAX1-NALT）及其空載質(zhì)粒（Vector）由漢恒生物科技（上海）有限公司提供；Lipofectamine 3000 試劑購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；雙氧水（H2O2）購自上海阿科瑪雙氧水有限公司；Notch 抑制劑DAPT 購自購自美國MedChemExpress 公司；LncRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒和LncRNA 熒光定量檢測試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司；CCK-8 試劑盒購于北京安必奇生物科技有限公司；活性氧（ROS）檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Notch1 抗體、Hes1 抗體和GAPDH 抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及H2O2 濃度篩選將復蘇后的SRA01/04 細胞置于含有體積分數(shù)為10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中混合均勻，再置于5%CO2、37℃的常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d 換液1次，細胞鋪滿皿底時進行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期SRA01/04 細胞，按照2 000 個/孔的密度接種于96 孔板中，待細胞貼壁后達到70%匯合度時，采用不同濃度（0、25、50、100、200、400 μmol/L）H2O2干預SRA01/04 細胞24 h，隨后采用下述CCK-8 實驗檢測細胞增殖活性以確定本研究中H2O2最佳干預濃度。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染及分組處理取對數(shù)生長期SRA01/04 細胞，按照5 × 104個/孔的密度接種于6 孔板中，待細胞生長至70%匯合度時，按照試劑盒說明書將NALT 過表達質(zhì)粒（pVAX1-NALT）及其空載質(zhì)粒（Vector）經(jīng)Lipofectamine 3000 試劑分別轉(zhuǎn)染至SRA01/04細胞中，分為pVAX1-NALT組和Vector組，另設(shè)置空白對照組（blank 組）。轉(zhuǎn)染48 h 后，采用qRT-PCR 檢測各組細胞中NALT 表達水平。再根據(jù)實驗需要分為對照組（Control 組，不經(jīng)任何處理）、H2O2組（采用100 μmol/L H2O2干預24 h 建立細胞損傷模型）、H2O2+Vector 組（轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的SRA01/04 細胞經(jīng)100 μmol/L H2O2干預24 h）、H2O2+NALT組（轉(zhuǎn)染NALT 過表達質(zhì)粒的SRA01/04 細胞經(jīng)100 μmol/L H2O2干預24 h）和H2O2+NALT+DAPT 組（轉(zhuǎn)染NALT 過表達質(zhì)粒的SRA01/04 細胞，再經(jīng)10 μmol/L Notch 抑制劑DAPT 和100 μmol/L H2O2干預24 h）。

1.4 CCK-8 法檢測細胞增殖活力將對數(shù)生長期的各組細胞按照2 000 個/孔的密度接種于96 孔板中，設(shè)置空白孔和對照孔，待細胞貼壁后達到70%匯合度時進行分組處理24 h。隨后每孔中加入10 μL CCK-8 溶液，于37 ℃避光孵育4 h，采用酶標儀于450 nm 波長處檢測各孔吸光度（A）值，細胞增殖活力=［（A實驗-A空白）/（A對照-A空白）］×100%。

1.5 qRT-PCR 檢測細胞中NALT 表達水平采用不同濃度H2O2（0、25、50、100、200、400 μmol/L）干預SRA01/04 細胞24 h 或SRA01/04 細胞轉(zhuǎn)染后，收集細胞沉淀，采用Trizol 法提取細胞總RNA，采用分光光度計測定總RNA 濃度及純度。按照LncRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒說明進行去基因組DNA，并將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板按照LncRNA 熒光定量檢測試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR 反應。引物序列：NALT，上游引物5′-GTCATCCAGTAGGCTCAAG-3′，下游引物5′-ATAAGTGGAGAAAGGCAGAT-3′；GAPDH，上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。PCR 擴增反應條件：95 ℃預變性3 min，然后95 ℃變性5 s、60 ℃退火10 s、72 ℃延伸15 s，共40 個循環(huán)。以GAPDN 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算NALT 相對表達水平。

1.6 DCFH-DA 熒光探針標記法檢測細胞內(nèi)ROS水平 將各組細胞接種于6 孔板中，分組干預后，采用0.25%胰酶消化細胞后收集細胞，加入1 mL終濃度為10 μmol/L 的熒光探針DCFH-DA 重懸細胞，并于37 ℃下避光孵育20 min，每隔5 min 顛倒混勻1 次，用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3 次，采用流式細胞儀進行檢測。

1.7 化學法檢測細胞中MAD含量及SOD活性將各組細胞接種于6 孔板中，分組干預后，棄細胞培養(yǎng)液，收集細胞沉淀，根據(jù)試劑盒說明書分別采用比色法和WST-1 法檢測細胞中MDA 含量和SOD活性。

1.8 Annexin V-FITC/PI 法檢測細胞凋亡水平將各組細胞接種于6 孔板中，分組干預后，收集細胞并轉(zhuǎn)移至1.5 mL Doff 管中，1 000g離心5 min，棄上清，用PBS 輕輕重懸細胞并計數(shù)，取5 × 104個細胞1 000g離心5 min，棄上清后加入195 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液輕輕重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL 碘化丙啶（PI）染色液，充分混勻，并于室溫避光條件下孵育15 min，采用流式細胞儀進行檢測。

1.9 Western blot 檢測細胞內(nèi)Notch1 和Hes1 蛋白表達水平分組干預后收集各組細胞沉淀，加入RIPA 裂解液于冰上裂解細胞，4 ℃條件下12 000g離心25 min，取上清蛋白溶液，采用BCA 法測定蛋白濃度。取30 μg 蛋白經(jīng)沸水浴變性后配置上樣體系，行10%SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，取出PVDF 膜TBST 洗滌3 次，再經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST 洗滌3 次，分別加入Notch1 抗體（1∶1 000）、Hes1 抗體（1∶1 000）和GAPDH 抗體（1∶1 000），于4 ℃條件下孵育過夜。TBST 洗滌3 次，加入HRP標記的山羊抗兔IgG 二抗，室溫封閉1.5 h，TBST 洗滌3 次，滴加ECL 顯影液，曝光顯影。蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH 條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計學方法采用GraphPad Prism 5 進行柱形圖的繪制，其CCK-8 和qRT-PCR 實驗數(shù)據(jù)以對照組結(jié)果作為量化標準，被定義為100%或1，對不同試驗組結(jié)果數(shù)據(jù)進行標化。采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，均符合正態(tài)分布，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2干預對SRA01/04細胞存活率及NALT表達水平的影響見圖1A，不同濃度H2O2干預24 h后，SRA01/04 細胞增殖活力隨著H2O2濃度的增加而逐漸降低，差異有統(tǒng)計學意義（F= 93.670，P＜0.001）。與0 μmol/L 比較，100 μmol/L H2O2干預可將SRA01/04 細胞增殖活力降低至60%左右，故后續(xù)選擇100 μmol/L H2O2干預24 h 作為細胞損傷造模條件。如圖1B 所示，隨著H2O2濃度的增加，SRA01/04 細胞中NALT 表達水平逐漸降低，差異有統(tǒng)計學意義（F= 85.323，P＜0.001）。

圖1 H2O2干預對SRA01/04 細胞存活率及NALT 表達水平的影響Fig.1 Effect of H2O2 intervention on the survival rate of SRA01/04 cells and the expression level of NALT

2.2 過表達NALT 對H2O2 干預下SRA01/04 細胞存活率的影響見圖2A，轉(zhuǎn)染NALT 過表達質(zhì)粒后，與blank 組或Vector 組比較，pVAX1-NALT 組SRA01/04 細胞中NALT 表達水平顯著升高（P＜0.001）。見圖2B，與Control 組比較，H2O2組SRA01/04 細胞增殖活力顯著降低（P＜0.001）；與H2O2組比較，H2O2+NALT 組SRA01/04 細胞增殖活力顯著升高（P＜0.001），而H2O2+Vector 組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與H2O2+NALT 組比較，H2O2+NALT+DAPT 組SRA01/04 細胞增殖活力又顯著降低（P＜0.001）。

圖2 NALT 過表達對H2O2干預下SRA01/04 細胞存活率的影響Fig.2 Effect of NALT overexpression on the survival rate of SRA01/04 cellsexposed to H2O2

2.3 過表達NALT 對H2O2 干預下SRA01/04 細胞氧化應激水平的影響見圖3，與Control 組比較，H2O2組SRA01/04 細胞中ROS 水平顯著升高（P＜0.001）；與H2O2組比較，H2O2+NALT 組SRA01/04細胞中ROS 水平顯著降低（P＜0.001），而H2O2+Vector 組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與H2O2+NALT 組比較，H2O2+NALT+DAPT 組SRA01/04 細胞中ROS 水平又顯著增加（P＜0.001）。見圖4，與Control 組比較，H2O2組SRA01/04 細胞中MDA 含量顯著升高（P＜0.001），而SOD 活性顯著下降（P＜0.001）；與H2O2組比較，H2O2+NALT 組SRA01/04 細胞中MDA 含量顯著降低（P＜0.001），SOD 活性顯著升高（P＜0.001），而H2O2+Vector 組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與H2O2+NALT 組比較，H2O2+NALT+ DAPT 組SRA01/04 細胞中MDA 含量又顯著增加（P＜0.001），而SOD 活性又顯著降低（P＜0.001）。

圖3 各組細胞中ROS 水平比較Fig.3 Comparison of ROS levels in cells of each group

圖4 各組細胞中MDA 含量及SOD 活性比較Fig.4 Comparison of MDA content and SOD activity in cells of each group

2.4 過表達NALT 對H2O2 干預下SRA01/04 細胞凋亡的影響見圖5，與Control 組比較，H2O2組SRA01/04 細胞凋亡水平顯著增加（P＜0.001）；與H2O2組比較，H2O2+NALT 組SRA01/04 細胞凋亡水平顯著降低（P＜0.001），而H2O2+Vector 組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與H2O2+NALT 組比較，H2O2+NALT+DAPT 組SRA01/04 細胞凋亡水平又顯著增加（P＜0.001）。

圖5 各組細胞凋亡水平比較Fig.5 Comparison of apoptosis levels in each group

2.5 過表達NALT 對H2O2 干預下SRA01/04 細胞Notch 信號通路的影響見圖6，與Control 組比較，H2O2組SRA01/04 細胞中Notch1 和Hes1 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）；與H2O2組比較，H2O2+NALT 組SRA01/04 細胞中Notch1 和Hes1 蛋白表達水平顯著增加（P＜0.001），而H2O2+Vector 組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與H2O2+NALT 組比較，H2O2+NALT+DAPT 組SRA01/04 細胞中Notch1 和Hes1 蛋白表達水平又顯著降低（P＜0.001）。

圖6 各組細胞中Notch1 和Hes1 蛋白表達水平比較Fig.6 Comparison of the expression levels of Notch1 and Hes1 proteins in each group of cells

3 討論

lncRNAs 在白內(nèi)障中的作用越來越受關(guān)注。ZHANG 等［14］通過高通量測序技術(shù)進行對比分析發(fā)現(xiàn)，在健康志愿者及老年白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜中存在7 000 多種差異表達的lncRNAs。且多項研究［15-17］顯示，lncRNAs 的異常表達可導致晶狀體發(fā)育異常、LECs 凋亡及晶狀體透明度降低。本研究通過體外培養(yǎng)SRA01/04 細胞，采用H2O2處理模擬LECs 氧化應激損傷模型，結(jié)果顯示，H2O2可呈現(xiàn)劑量依賴性抑制SRA01/04 細胞增殖活性，并且100 μmol/L H2O2干預可提高SRA01/04 細胞內(nèi)ROS水平及MDA 含量，降低SOD 活性，誘導細胞凋亡，表明LECs 氧化應激損傷體外模型構(gòu)建成功。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在不同濃度H2O2刺激后的SRA01/04 細胞中NALT 的表達逐漸下調(diào)，說NALT 可能參與調(diào)控LECs 氧化應激損傷。

NALT，又稱LINC01573，是一種長度為546 nt的lncRNA，由WANG 等［11］于2015年在T 細胞急性淋巴細胞白血病中首次發(fā)現(xiàn)，并證實其可通過順式調(diào)控作用調(diào)控Notch1 基因的表達。PIAO 等［18］研究證實，NALT 在胃癌組織中高表達，并促進胃癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，其作用機制也是通過調(diào)控Notch1 表達從而激活Notch 信號通路的轉(zhuǎn)導。然而，目前暫無更多有關(guān)NALT 的功能研究報道。因此，為了進一步探討NALT 在H2O2誘導的LECs 氧化應激損傷中作用與功能，本研究將NALT 過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SRA01/04 細胞中，構(gòu)建NALT 過表達的SRA01/04 細胞株，再進一步采用H2O2干預，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NALT 過表達可以提高H2O2暴露下SRA01/04 細胞的增殖活性，降低胞內(nèi)ROS 水平及MDA 含量，提高SOD 活性，抑制細胞凋亡，同時還可提高細胞中Notch1 和Hes1 等蛋白的表達水平，說明NALT 過表達可以改善H2O2誘導的SRA01/04 細胞損傷，其作用機制也可能與激活Notch 信號通路的轉(zhuǎn)導有關(guān)。

Notch 信號通路是一個進化上相對較為保守的細胞與細胞之間的信號轉(zhuǎn)導通路，決定著哺乳動物發(fā)育過程中細胞的命運。Notch 受體（包括Notch1～4）及其配體（包括DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1 和Jagged2）均是具有較大胞外結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白，二者結(jié)合后受體發(fā)生蛋白水解裂解，釋放出Notch 胞內(nèi)活化片段（Notch intracellular domain，NICD），NICD 進入細胞核內(nèi)并與轉(zhuǎn)錄因子CSL 相結(jié)合，聚集核轉(zhuǎn)錄激活蛋白MAML 家族，形成NICD-CSL-MAML 轉(zhuǎn)錄復合物，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，如Hes 和Hey 家族基因等，從而調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡、黏附、周期等［19］。LE 等［20］研究顯示，Notch 信號通路的正常轉(zhuǎn)導是正常小鼠晶狀體發(fā)育的必要組成部分。有研究表明，Notch 信號通路的激活可以抵抗H2O2誘導的細胞凋亡，并促進細胞存活。此外，鑒于NALT 可通過順式調(diào)控作用調(diào)控Notch1 基因的表達［11］，且本研究顯示，NALT過表達可上調(diào)H2O2暴露下SRA01/04 細胞中Notch1和Hes1 蛋白表達，推測NALT 過表達對H2O2誘導的SRA01/04 細胞損傷的改善作用可能與激活Notch 信號通路有關(guān)。為了進一步證實該推測，本研究使用Notch 抑制劑DAPT 進行聯(lián)合干預，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合DAPT 干預可逆轉(zhuǎn)NALT 過表達對H2O2誘導的SRA01/04 細胞損傷的改善作用，提示NALT過表達可能通過激活Notch 信號的轉(zhuǎn)導改善H2O2誘導的SRA01/04 細胞損傷。

綜上所述，NALT 在H2O2誘導的LECs 中表達下調(diào)，其過表達可通過促進Notch 信號通路的轉(zhuǎn)導促進H2O2暴露下LECs 的存活，抑制H2O2誘導的氧化損傷和細胞凋亡，對H2O2暴露下的LECs 具有保護作用。然而，本研究僅為體外細胞實驗，對白內(nèi)障臨床治療的指導價值有限，下一步將著重開展體內(nèi)動物實驗及臨床試驗進一步驗證NALT 對白內(nèi)障的防治作用，以期為基于LECs 防治白內(nèi)障提供新的思路。

【Author contribution】WANG Yanxi and ZHOU Juan：Performed the experiments and wrote the article. WANG Min，CHEN Yin，YANG Tao and ZHAO Yueyue：Performed the experiments.KANG Haijun and KANG Gangjin：Revised the article. KANG Gangjin：Designed the study and reviewed the article. All authors read and aplproved the final manuscript as sub-mitted.