劉振寧 許蘊怡 胡麗環(huán) 劉志輝 胡錦興 李華 關(guān)平

廣州市胸科醫(yī)院檢驗科（廣州 510095）

目前病原學(xué)檢測方法對結(jié)核診斷效率不高：涂片簡單、快速，但檢出率低、不能區(qū)分死菌活菌、不能排除非結(jié)核分枝桿菌；培養(yǎng)作為診斷的金標準，檢出率略高于涂片，但耗時長；分子檢測快速，方法學(xué)也逐漸趨向簡便，但檢出率與培養(yǎng)相當(dāng)而仍不理想；其總檢出率均不足60%［1-2］。因此研究人員一直在探討檢出率更高、操作更簡便的實驗診斷方法。具備快速、經(jīng)濟、簡便的抗體檢測成為了其中一個選擇。現(xiàn)階段雖然結(jié)核抗體的檢測性能不佳，容易導(dǎo)致誤診漏診［3-4］，但抗體檢測具備的優(yōu)點，尤其在新冠傳染病的診斷中取得的巨大成功［5］，使得人們在結(jié)核病診斷一直沒有放棄這方面的努力［6］。我們在蛋白芯片的檢測過程中發(fā)現(xiàn)調(diào)整臨界值可改善診斷性能，因而進行抗體檢測研究。由于當(dāng)前抗體檢測性能尚有不足，且結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展主要與細胞免疫相關(guān)［7-8］，有研究指出我們的檢測指標對結(jié)核病診斷具有較好的意義［9］，因此本項目從細胞免疫的角度出發(fā)，對CD45+CD3+淋巴細胞、CD45+CD64+單核細胞、CD161+細胞以及RF 進行分析。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料根據(jù)《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準-肺結(jié)核診斷（WS 288-2017）》，選取本院2021年初次收治且未抗結(jié)核治療的肺結(jié)核患者202 例作為結(jié)核病組，男119 例，女83 例，年齡18～65 周歲，無合并其他感染性疾病、惡性腫瘤和免疫性疾病。全部患者均經(jīng)過痰涂片、痰培養(yǎng)確診，或臨床診斷為肺結(jié)核。另外，選取同期本院的體檢健康者120 例作為健康對照組。男72 例，女48 例，年齡20～65 周歲，均經(jīng)過臨床診斷，排除了結(jié)核病。

1.2 儀器與試劑LE-01-B 型生物芯片閱讀儀購于西安聯(lián)爾科技有限公司；5810R 高速冷凍離心機購于德國eppendorf 公司；BD-Accuri-C6 流式細胞儀購于美國BD 公司；結(jié)核蛋白芯片檢測系統(tǒng)試劑盒購于西安聯(lián)爾科技有限公司；CD161 檢測試劑購于深圳聯(lián)合醫(yī)學(xué)科技有限公司。

1.3 方法結(jié)核五項檢測流程如下。提取血清，采用結(jié)核蛋白芯片檢測系統(tǒng)試劑盒，取出芯片，滴加4 滴三羥甲基氨基甲烷緩沖液，完全滲入后加待檢血清100 μL，血清滲入后加6 滴三羥甲基氨基甲烷緩沖液，滲入后滴加6 滴膠體金標記的羊抗人IgG，最后加入6 滴三羥甲基氨基甲烷緩沖液，通過LE-01-B 型生物芯片閱讀儀進行檢測，儀器軟件自動判讀結(jié)果。

流式細胞檢測流程如下。采集新鮮的抗凝全血，轉(zhuǎn)移100 μL 至流式管，加入12 μL 混合抗體（CD3、CD45、CD64 和CD161 抗體），震蕩混勻后在室溫下避光孵育20 min。在上述流式管加入紅細胞裂解液2 mL，震蕩混勻后在室溫下避光孵育5 min，2 000 r/min 離心5 min，除去上清液后加入磷酸鹽緩沖液（PBS）2 mL，震蕩混勻后2 000 r/min離心5 min，倒掉上清液，加入200 μL PBS，震蕩混勻后用流式細胞儀進行檢測。用軟件FlowJo 分析流式結(jié)果，分別篩選出淋巴細胞（CD45+CD3+）、單核細胞（CD45+CD64+）、CD161+細胞，計算淋巴細胞比例（CD45+CD3+%）、單核細胞比例（CD45+CD64+%）和CD161+細胞比例（CD161+%），最后利用TensorFlow 的Keras 庫構(gòu)建深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)分類模型［9］計算結(jié)核菌感染風(fēng)險指數(shù)RF。RF 值=淋巴細胞百分比/單核細胞百分比×淋巴細胞百分比。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行分析。以最小值和最大值描述數(shù)據(jù)的離散程度，四分位數(shù)描述數(shù)據(jù)的集中趨勢。如果符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用t檢驗；偏態(tài)分布計量資料秩和檢驗，統(tǒng)計量的比較采用t檢驗。通過受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線的曲線下面積（area under the curve，AUC）分析各項檢測指標診斷結(jié)核病的臨床價值。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組間各抗體、細胞比例及其感染風(fēng)險指數(shù)的比較由于各檢測項目含有非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，本研究采用秩和檢驗進行分析。計算結(jié)核組和健康組的最小值、最大值及其四分位數(shù)。兩組間的38KD、CFP10、ESAT-6 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），16KD、LAM、CD45+CD3+%、CD45+CD64+%、CD161+%、RF 的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均為0）。見表1。

表1 兩組間5 種抗體、3 種細胞比例及其感染風(fēng)險指數(shù)的比較Tab.1 Comparison of five antibodies, three cell ratios and infection risk index between the two groups

2.2 各檢測項目的ROC 曲線結(jié)果繪制ROC 曲線，計算各檢測項目的AUC，各檢測項目ROC 曲線下面積分別為RF：0.884；CD45+CD3+%：0.860；CD45+CD64+%：0.834；16KD：0.748；LAM：0.680；CD161+%：0.667；CFP10：0.564；ESAT-6：0.535；38KD：0.525。見圖1。

圖1 5 種抗體、3 種細胞比例及其統(tǒng)計風(fēng)險指數(shù)診斷結(jié)核的ROC 曲線Fig.1 ROC curve of 5 kinds of antibodies，3 kinds of cell ratio and statistical risk index in diagnosis of tuberculosis

2.3 各檢測項目最佳臨界值下的診斷性能指標數(shù)據(jù)通過ROC 曲線得出16KD、38KD、CFP10、ESAT-6、LAM、CD45+CD3+% 、CD45+CD64+% 、CD161+%、RF 的最佳臨界值分別為1.031、1.074、1.075、1.062、1.161、78.480、14.250、34.765、0.469。各檢測項目在最佳臨界值下的診斷性能指標見表2。

3 討論

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染性疾病，是2019年之前導(dǎo)致人類死亡最多最古老的傳染病之一［10-12］。盡管相關(guān)研究已經(jīng)進行了差不多一個世紀，取得了進展，但尚未明確用于診斷和監(jiān)測疾病進展過程中，重復(fù)性較好、易于量化的檢測指標［13］。而目前結(jié)核抗體的診斷價值不大，易導(dǎo)致誤診漏診，細胞免疫方面的檢測還未有明確結(jié)論。本項目顯示，結(jié)核抗體中，最佳臨界值下16KD 的臨床診斷價值最高，細胞免疫相關(guān)指標中RF、CD45+CD3+%、CD45+CD64+%在肺結(jié)核臨床診斷中具有較高的臨床應(yīng)用價值。通過本研究結(jié)果，在結(jié)核病診斷中，可以先用快速、經(jīng)濟、簡便的結(jié)核抗體16KD 進行快速篩查，再用RF、CD45+CD3+%、CD45+CD64+%三個指標彌補16KD 的缺陷。

有研究表明，主要以LAM、38KD 及16KD 三項聯(lián)合定性檢測初治結(jié)核病患者血清抗體的蛋白芯片技術(shù)敏感度為66.2%～69.2%［14-15］，而16KD、38KD、CFP-10、ESAT-6 和LAM 五項聯(lián)合的定性檢測抗體的敏感度為71.2%［16］。上述結(jié)果與我們目前在臨床實際應(yīng)用的情況相符。然而，在我們嘗試定量檢測分析結(jié)核抗體得出最佳臨界值后，結(jié)核五項各指標的臨床診斷價值均得到提升，其中16KD 的臨床診斷價值為五項最高，AUC 為0.748，最佳臨界值為1.031，靈敏度（82.18%）高于多項聯(lián)合的定性檢測（表2）。早期、快速、準確的診斷對于控制結(jié)核病流行具有顯著效果［17］，所以不應(yīng)放棄研究取樣方便、操作簡單快速的結(jié)核抗體檢測。我們的研究成果表明定量檢測可以顯著提升結(jié)核抗體的臨床診斷價值，最佳臨界值的單項16KD 定量檢測足以替代多項聯(lián)合的定性檢測，為臨床提供更高的診斷價值，更便捷、更快速、更經(jīng)濟的檢測方案。

表2 各檢測項目診斷性試驗評價指標分析Tab.2 Analysis of diagnostic test evaluation index of each test item

CD161 是一種C 型凝集素樣受體，CD161+細胞是人類記憶Th17 細胞的標志，是表現(xiàn)炎癥活性的細胞亞群，有結(jié)果表明，在結(jié)核菌刺激下，CD161+亞群的百分率下降［18-19］。相關(guān)研究報道，包括CD36、CD38、CD44、CD263、CD55、CD33、CD18 和CD161在內(nèi)的大分子里，CD161 是區(qū)分結(jié)核患者的最佳標志物，CD161+T 細胞的百分比明顯低于健康對照組，感染風(fēng)險指數(shù)RF 的靈敏度和特異度在72%左右［20］。另有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核患者CD45+單個核細胞數(shù)表達較高，有助于結(jié)核病的診斷［21］。單核細胞屬于先天免疫系統(tǒng)，CD64+單核細胞在結(jié)核患者中的表達顯著升高，敏感度為76.6%，特異度為73.3%，在對抗結(jié)核桿菌方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用［22］。有學(xué)者研究指出，結(jié)核患者CD3+淋巴細胞的百分比顯著低于健康對照組［20］。結(jié)核患者免疫功能的不同易導(dǎo)致結(jié)核抗體的階段特異性，患者體內(nèi)免疫細胞相關(guān)指標可隨著疾病的發(fā)展而發(fā)生變化［23-24］。在此背景，我們選擇了CD45+CD3+淋巴細胞、CD45+CD64+單核細胞、CD161+細胞以及RF 作為檢測結(jié)核病的相關(guān)指標。上述研究結(jié)果的細胞表達趨勢基本與我們的研究結(jié)果相符合。CD45+CD3+%、CD45+CD64+%和RF 的AUC 均大于0.83，臨床診斷價值較高（圖1）。其中由CD45+CD3+淋巴細胞、CD45+CD64+單核細胞、CD161+細胞建立的結(jié)核菌感染風(fēng)險指數(shù)RF 臨床診斷價值最高，最佳臨界值0.469，靈敏度75.74%略高于相關(guān)報道的72%，特異度92.50%則顯著高于72%，其余診斷評價指標均較高（表2）。我們的結(jié)果表明，結(jié)核抗體16KD可與CD45+CD3+%、CD45+CD64+%、RF 結(jié)合使用，優(yōu)勢互補。

免疫學(xué)檢測是病原學(xué)檢測的有力補充，病原學(xué)檢測用于結(jié)核病的鑒別診斷，確保不出錯，免疫學(xué)檢測用于結(jié)核病的初篩，盡量不漏診，二者可聯(lián)合檢測，綜合判讀，彌補不足。本實驗通過ROC 曲線得出各指標的最佳臨界值，篩選出在結(jié)核病診斷中具有重要臨床價值的指標，為臨床提供了一種新穎、便捷、快速、經(jīng)濟的診斷解決方案，解決當(dāng)前結(jié)核病診斷的局限性，為進一步的大樣本研究提供基礎(chǔ)。但本研究仍存在不足，如未分析其他肺部疾病與上述指標的關(guān)系，樣本量未足夠大，代表性未足夠強，還需繼續(xù)對16KD 與免疫細胞的臨床價值深入研究。

【Author contribution】LIU Zhenning：Conceptualization，Methodology，Writing-Original Draft. XU Yunyi：Writing-Review & Editing，Resources. HU Lihuan：Investigation，Validation. LIU Zhihui：Data Curation，Supervision. HU Jinxing：Project Administration. LI Hua：Software，Validation. GUANG Ping：Resources，Supervision.