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        結(jié)核抗體檢測(cè)試劑國(guó)家參考品的建立

        2023-03-09 05:39:18石大偉王威楊曉于麗黃嘉維張春濤許四宏
        中國(guó)防癆雜志 2023年3期
        關(guān)鍵詞:檢測(cè)

        石大偉 王威 楊曉 于麗 黃嘉維 張春濤 許四宏

        準(zhǔn)確和有效地診斷結(jié)核病是控制結(jié)核病的重要手段。除了根據(jù)患者的癥狀體征,結(jié)核病的臨床診斷主要依靠影像學(xué)、病理學(xué)和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的主要手段有細(xì)菌學(xué)檢查、免疫學(xué)檢查和分子生物學(xué)檢查。痰涂片檢查及分枝桿菌分離培養(yǎng)是細(xì)菌學(xué)檢查常用的兩種檢查方法[1]。結(jié)核抗體檢測(cè)、結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)、γ-干擾素釋放試驗(yàn)都是用于肺結(jié)核診斷的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法[2]。

        我國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)管部門批準(zhǔn)上市的結(jié)核抗體檢測(cè)試劑主要分為免疫層析法(主要是膠體金法)、酶聯(lián)免疫法(微孔板法)、蛋白芯片法(固相基片和免疫滲濾法芯片)。不同方法學(xué)的試劑的性能存在較大差異。免疫層析法試劑操作簡(jiǎn)便,成本低廉,但無(wú)法進(jìn)行定量檢測(cè),且可重復(fù)性不高[3-4]。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)在2008年的一項(xiàng)評(píng)估發(fā)現(xiàn),與痰培養(yǎng)的結(jié)果比較,19種商品化試劑產(chǎn)品的敏感度為1%~60%,特異度為5%~99%,不同試劑檢驗(yàn)結(jié)果的一致性差[5]。近年來(lái)發(fā)展的酶聯(lián)免疫試劑和蛋白芯片法檢測(cè)準(zhǔn)確性和敏感度更高,但結(jié)果報(bào)告時(shí)間較長(zhǎng),成本較高[5-7]。該類型的檢測(cè)試劑,在不同測(cè)試中表現(xiàn)存在差異,且缺乏一致的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[8-10]。綜上,目前結(jié)核抗體檢測(cè)作為快速診斷方法的臨床應(yīng)用受到很大限制,同時(shí),行業(yè)共識(shí)認(rèn)為該類試劑的性能和質(zhì)量亟待提升和標(biāo)準(zhǔn)化[4]。因此,研制國(guó)家參考品用于結(jié)核抗體檢測(cè)試劑的質(zhì)量控制及評(píng)價(jià),對(duì)于質(zhì)量提升工作具有重要意義[11]。

        材料和方法

        一、參考品原料

        39份陽(yáng)性原料樣本來(lái)自于佛山市第四人民醫(yī)院、北京老年醫(yī)院、北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司(簡(jiǎn)稱“北京萬(wàn)泰”),115份陰性原料為單采血漿站報(bào)廢血漿。

        二、試劑

        參考品的初篩使用的結(jié)核抗體膠體金試劑為新加坡MP Biomedicals公司、艾博生物醫(yī)藥(杭州)有限公司、杭州博拓生物科技股份有限公司、北京貝爾生物工程股份有限公司(簡(jiǎn)稱“北京貝爾”)、深圳英科新創(chuàng)科技有限公司生產(chǎn)。復(fù)核試劑包括北京萬(wàn)泰、北京貝爾、上海榮盛生物藥業(yè)股份有限公司(簡(jiǎn)稱“上海榮盛”)、成都賽普克生物科技股份有限公司(簡(jiǎn)稱“賽普克”)和北京現(xiàn)代高達(dá)生物技術(shù)有限責(zé)任公司(簡(jiǎn)稱“現(xiàn)代高達(dá)”)的酶聯(lián)免疫法結(jié)核抗體檢測(cè)試劑盒。候選樣本的抗體譜信息使用深圳市普瑞康生物技術(shù)有限公司(簡(jiǎn)稱“普瑞康”)生產(chǎn)的蛋白芯片結(jié)核抗體檢測(cè)試劑盒獲得。協(xié)作標(biāo)定的試劑還包括鄭州安圖生物工程股份有限公司(簡(jiǎn)稱“鄭州安圖”)、深圳市安群生物工程有限公司(簡(jiǎn)稱“深圳安群”)的酶聯(lián)免疫法結(jié)核抗體檢測(cè)試劑盒,以及北京華大吉比愛生物技術(shù)有限公司(簡(jiǎn)稱“華大吉比愛”)的蛋白芯片結(jié)核抗體檢測(cè)試劑盒。

        三、方法

        1.樣本初篩和復(fù)核:使用5種國(guó)內(nèi)外公司的結(jié)核抗體膠體金檢測(cè)試劑,對(duì)154份參考品原料進(jìn)行篩選。將通過(guò)初篩的原料使用5種酶聯(lián)免疫法結(jié)核抗體檢測(cè)試劑進(jìn)行復(fù)核。對(duì)部分原料使用蛋白芯片結(jié)核抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行復(fù)核,得到抗體針對(duì)結(jié)核分枝桿菌特定抗原的信息。復(fù)核后,確定參考品陽(yáng)性和陰性候選樣本。

        2.參考品陽(yáng)性和陰性候選樣本的分組裝:對(duì)參考品陽(yáng)性和陰性候選樣本進(jìn)行分裝,并對(duì)其進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定編號(hào),組裝成協(xié)作標(biāo)定樣本盤,存于-20 ℃冰箱中。

        3.參考品陽(yáng)性和陰性候選樣本的協(xié)作標(biāo)定:參考品候選樣本經(jīng)9家公司(北京萬(wàn)泰、現(xiàn)代高達(dá)、北京貝爾、賽普克、鄭州安圖、上海榮盛、深圳安群、華大吉比愛和普瑞康)使用各自生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌抗體檢測(cè)試劑(酶聯(lián)免疫法)、蛋白芯片法(固相)進(jìn)行檢測(cè)。此后,對(duì)陽(yáng)性參考品候選樣本進(jìn)行2倍的梯度稀釋,并進(jìn)行檢測(cè),記錄每種試劑能夠檢出的最大稀釋倍數(shù)。

        4.最低檢出限參考品和精密度參考品候選樣本的分組裝:根據(jù)參考品陽(yáng)性候選樣本協(xié)作標(biāo)定的結(jié)果,選取適合的陽(yáng)性候選樣本進(jìn)行稀釋,制成最低檢出限和精密度參考品的候選樣本。對(duì)候選樣本進(jìn)行分裝,并進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定編號(hào),組裝成協(xié)作標(biāo)定樣本盤,存于-20 ℃冰箱中,發(fā)放各家企業(yè)進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定。

        5.最低檢出限參考品和精密度參考品候選樣本的協(xié)作標(biāo)定:參考品候選樣本由參與陽(yáng)性和陰性參考品協(xié)作標(biāo)定的9家公司使用各自生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)試劑進(jìn)行檢測(cè)。記錄各個(gè)產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果,并計(jì)算精密度參考品測(cè)試結(jié)果的變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)值。

        6.國(guó)家參考品組成和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的確定:根據(jù)參考品陽(yáng)性候選樣本、陰性候選樣本及最低檢測(cè)限和精密度參考品候選樣本協(xié)作標(biāo)定的結(jié)果,確定國(guó)家參考品的組成和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

        7.均勻性研究:根據(jù)每種候選樣本的分裝順序號(hào),通過(guò)簡(jiǎn)單隨機(jī)方法抽取分裝后-20 ℃保存的5套參考品,對(duì)每套參考品盤中的陽(yáng)性參考品、最低檢出限參考品和精密度參考品用同一批北京萬(wàn)泰的結(jié)核抗體檢測(cè)試劑(酶聯(lián)免疫法)分別進(jìn)行檢測(cè)。按照試劑盒說(shuō)明書操作,記錄檢測(cè)結(jié)果的樣本吸光度值(A值)。

        8.穩(wěn)定性研究:根據(jù)每種候選樣本的分裝順序號(hào),通過(guò)簡(jiǎn)單隨機(jī)方法各取出1套分裝后凍存的參考品于4 ℃放置7 d,于室溫(23~27 ℃)放置3 d,反復(fù)凍融3次。與凍存的參考品同時(shí)用同一批北京萬(wàn)泰的結(jié)核抗體檢測(cè)試劑(酶聯(lián)免疫法)分別進(jìn)行平行檢測(cè)。按照試劑盒說(shuō)明書操作,記錄檢測(cè)結(jié)果的樣本吸光度值(A值)。

        四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        使用Excel 2010軟件整理和初步分析數(shù)據(jù),采用GraphPad Prism 5.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用區(qū)組方差分析的方法(two-way ANOVA)和兩兩組間比較(Bonferroni’s multiple comparisons test)對(duì)參考品的穩(wěn)定性和均勻性實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié) 果

        一、樣本初篩和復(fù)核

        樣本使用結(jié)核抗體膠體金檢測(cè)試劑進(jìn)行初篩,從154份原料中選出39份陽(yáng)性原料和31份陰性原料。對(duì)初篩獲得的39份陽(yáng)性原料和31份陰性原料使用結(jié)核抗體檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)進(jìn)行復(fù)核,確定參考品陽(yáng)性和陰性候選樣本,結(jié)果見表1。根據(jù)復(fù)核結(jié)果,選擇原則上不少于4家(陽(yáng)性符合率為4/5)酶聯(lián)免疫法結(jié)核抗體檢測(cè)試劑盒復(fù)核結(jié)果為陽(yáng)性的11份陽(yáng)性候選樣本進(jìn)行分裝和協(xié)作標(biāo)定,其原料編號(hào)分別是TBK1、TBK5、TBK10、TBK11、TBK12、TBK14、TBK16、WANT3、LN2、LN14、LN17。這些樣本(TBK14和TBK16未檢測(cè))的蛋白芯片結(jié)果均為陽(yáng)性,抗體譜結(jié)果均為L(zhǎng)AM IgG陽(yáng)性,個(gè)別樣本合并有單個(gè)的相對(duì)分子質(zhì)量38 000蛋白和CFP10 IgG陽(yáng)性。選擇不少于3家(陰性符合率為3/4)酶聯(lián)免疫法結(jié)核抗體檢測(cè)試劑盒復(fù)核結(jié)果為陰性的15份陰性候選樣本進(jìn)行分裝和協(xié)作標(biāo)定,其原料編號(hào)分別是R2、R21、R27、R28、R29、R30、R32、R34、R37、R38、R43、R47、Bank293、Bank297、Bank299。最終,通過(guò)復(fù)核從初篩獲得的39份陽(yáng)性原料和31份陰性原料中確定了11份參考品陽(yáng)性候選樣本和15份參考品陰性候選樣本。

        表1 參考品候選樣本的復(fù)核結(jié)果

        續(xù)表1

        二、參考品陽(yáng)性和陰性候選樣本的分裝

        陽(yáng)性參考品候選樣本經(jīng)過(guò)復(fù)核后,取一定量的樣本,充分混勻后進(jìn)行分裝,裝量40 μl/支,協(xié)作標(biāo)定編號(hào)為B1~11。陰性參考品候選樣本使用多次紗布過(guò)濾和反復(fù)凍融等方式處理后進(jìn)行分裝,裝量40 μl/支,協(xié)作標(biāo)定編號(hào)為B12~26。

        三、參考品陽(yáng)性和陰性候選樣本的協(xié)作標(biāo)定

        協(xié)作標(biāo)定樣本中預(yù)期結(jié)果為陽(yáng)性的部分,不同試劑間檢出的差異較大,如公司B可以檢出全部11份陽(yáng)性參考品候選樣本,而公司F只能檢出6份。但對(duì)于公司B,15份陰性參考品候選樣本,出現(xiàn)了5份陽(yáng)性結(jié)果,而其他試劑對(duì)這5份樣本的檢測(cè)結(jié)果均為陰性(表2)。同時(shí),9家公司對(duì)參考品陽(yáng)性候選樣本(不包括B11)進(jìn)行了2倍的梯度稀釋,并逐一測(cè)試,直至檢出結(jié)果為陰性,記錄最高能夠檢出的稀釋倍數(shù)(表3)。

        表2 陽(yáng)性參考品和陰性參考品協(xié)作標(biāo)定結(jié)果

        表3 陽(yáng)性參考品梯度稀釋協(xié)作標(biāo)定結(jié)果

        四、最低檢出限參考品和精密度參考品候選樣本的分裝

        最低檢出限參考品候選樣本和精密度參考品候選樣本,使用陰性樣本(原料編號(hào):Blank937)作為稀釋基質(zhì)進(jìn)行稀釋。參考品陽(yáng)性候選樣本B5(原料編號(hào):TBK12)使用稀釋基質(zhì)經(jīng)1∶3稀釋后,使用2 ml無(wú)菌螺口凍存管分裝成400 μl/支,編號(hào)為R,作為精密度參考品候選樣本。參考品陽(yáng)性候選樣本B2(原料編號(hào):TBK5)使用稀釋基質(zhì)依次稀釋至原倍的1∶4、1∶8、1∶24、1∶72、1∶128,使用2 ml無(wú)菌螺口離心管分裝成40 μl/支,作為最低檢出限參考品候選樣本,編號(hào)為S1~S5。

        五、最低檢出限參考品和精密度參考品候選樣本的協(xié)作標(biāo)定

        9家公司的9個(gè)試劑產(chǎn)品參與協(xié)作標(biāo)定,8個(gè)產(chǎn)品能夠檢出最低檢出限參考品候選樣本S1(8/9)和S2(8/9),而S3~S5的檢出率則出現(xiàn)了明顯的下降,分別為3/9、2/9、1/9(表4)。精密度方面,各試劑對(duì)精密度參考品候選樣本的10次平行檢測(cè),均可檢出陽(yáng)性,其中,公司A~G的酶聯(lián)免疫法試劑的CV值分別為1.1%、4.5%、7.1%、4.6%、3.3%、7.6%、5.4%,均小于10%。而公司H的蛋白芯片法試劑相對(duì)分子質(zhì)量16 000蛋白、相對(duì)分子質(zhì)量38 000 蛋白、Rv1636、CFP10、Lam等靶標(biāo)對(duì)應(yīng)的CV值分別為5.6%、15.0%、5.9%、2.2%、13.0%;公司I的蛋白芯片法試劑相對(duì)分子質(zhì)量16 000蛋白、相對(duì)分子質(zhì)量38 000蛋白、MPT64、Ag85B等靶標(biāo)對(duì)應(yīng)的CV值分別為4.0%、4.0%、5.6%、8.4%。

        表4 最低檢出限參考品協(xié)作標(biāo)定結(jié)果

        六、參考品組裝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的確定

        根據(jù)協(xié)作標(biāo)定結(jié)果,同時(shí)考慮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)需對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量提供有適當(dāng)督促作用,從協(xié)作標(biāo)定的候選樣本中選擇部分樣本作為國(guó)家參考品的最終組成并進(jìn)行組裝。本國(guó)家參考品的組成和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)確定為:(1)陰性參考品N1~N10:應(yīng)均為陰性,陰性參考品符合率應(yīng)為10/10;(2)陽(yáng)性參考品P1~P10:陽(yáng)性參考品符合率≥9/10;(3)最低檢出限參考品S1~S5:S1和S2應(yīng)均為陽(yáng)性,S3~S5可為陽(yáng)性或陰性;(4)精密度參考品R:平行檢測(cè)10次,結(jié)果應(yīng)均為陽(yáng)性,且檢測(cè)結(jié)果(酶聯(lián)免疫法為吸光度值,固相蛋白芯片法為發(fā)光值)的CV值應(yīng)≤15%。

        七、穩(wěn)定性和均勻性研究

        經(jīng)區(qū)組方差分析,參考品的各穩(wěn)定性條件處理組與-20 ℃對(duì)照組間的酶聯(lián)免疫法吸光度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示,本參考品可于4 ℃放置7 d,于室溫(23~27 ℃)放置3 d,反復(fù)凍融3次,而不影響參考品的穩(wěn)定性。

        均勻性研究結(jié)果顯示,各參考品均勻性組與對(duì)照組間的酶聯(lián)免疫法吸光度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且同一參考品各分裝樣本間差異不超出30%。由此可見,本參考品的均勻性良好。

        討 論

        結(jié)核病的臨床診斷金標(biāo)準(zhǔn)以痰涂片或者痰培養(yǎng)為主,但是其檢出率低,尤其是對(duì)涂片陰性或者無(wú)痰患者的診斷比較困難,因此,血清學(xué)結(jié)核抗體檢測(cè)日益受到重視,對(duì)臨床檢測(cè)亦有重要的參考意義[6]。本套參考品為首次研制的針對(duì)酶聯(lián)免疫法和固相蛋白芯片法結(jié)核抗體檢測(cè)試劑盒的國(guó)家參考品。本參考品的特點(diǎn)在于:(1)陽(yáng)性候選樣本大部分來(lái)源于臨床確診的結(jié)核病患者,臨床背景信息清楚;陽(yáng)性候選樣本經(jīng)蛋白芯片試劑檢測(cè),有較清楚的抗體譜信息;均為未混合的,單人份血漿,保證樣本抗體譜的清晰,有利于試劑研發(fā)和質(zhì)量改進(jìn)過(guò)程中進(jìn)行對(duì)比研究。(2)樣本均為血漿來(lái)源,盡可能與試劑待檢的臨床樣本基質(zhì)保持一致。(3)與2008年中國(guó)食品藥品檢定研究院研制的主要針對(duì)膠體金法結(jié)核抗體檢測(cè)試劑國(guó)家參考品相比,本參考品盤設(shè)置了精密度參考品及其要求,并對(duì)試劑最低檢出限稀釋度檢出提出了明確要求,有利于明確引導(dǎo)試劑質(zhì)量改進(jìn)。

        為了充分驗(yàn)證參考品的適用性,本參考品使用9家不同企業(yè)的酶聯(lián)免疫法和固相蛋白芯片法結(jié)核抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定。適用性研究的結(jié)果顯示,不同試劑的參考品陽(yáng)性和陰性候選樣本檢出率有較大差異。這可能是由于不同試劑抗原的選擇和純度不同,制作工藝,試劑穩(wěn)定性差異等因素所導(dǎo)致。在以往不同的評(píng)估和研究中,不同試劑和方法的敏感度和特異度亦存在很大的差異[12-14]??紤]到結(jié)核抗體檢測(cè)試劑的性能質(zhì)量要求無(wú)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn),本參考品又是首次研制,按照積極引導(dǎo)和逐步提高的原則,筆者在選擇參考品組成時(shí)排除了個(gè)別較有挑戰(zhàn)性的樣本,并在設(shè)定參考品檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)將陽(yáng)性參考品符合率設(shè)定為9/10,給一些試劑提高質(zhì)量留出了空間,又預(yù)期能淘汰質(zhì)量較差的試劑,起到一定的督促作用。同時(shí),參考品盤的組成和檢測(cè)結(jié)果要求(質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn))也考慮到結(jié)核抗體檢測(cè)在臨床上的應(yīng)用需求,兼顧了試劑對(duì)陰性和陽(yáng)性樣本的檢出能力。此外,穩(wěn)定性和均勻性研究顯示本參考品的穩(wěn)定性和均勻性符合規(guī)定要求。

        本參考品不可避免的具有一些局限性:(1)參考品均為血漿樣本來(lái)源,因此,對(duì)于僅適用于血清樣本的試劑需要單獨(dú)驗(yàn)證。(2)陰性參考品僅為正常人血漿,未設(shè)置與結(jié)核病在臨床上需要鑒別診斷的其他疾病或陽(yáng)性樣本,如肺部腫瘤、肺纖維化、其他呼吸道病原體和急性感染患者的樣本。(3)與酶聯(lián)免疫法和固相蛋白芯片試劑相比,大部分免疫層析法試劑的檢測(cè)限(分析敏感度)較差,且加樣量較大(一般為100 μl,而酶聯(lián)免疫法為10 μl)導(dǎo)致原料不足。本參考品規(guī)定了僅適用于對(duì)酶聯(lián)免疫法和固相蛋白芯片試劑盒的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià),后續(xù)將研制適用于其他方法學(xué)(主要涉及免疫層析法和免疫滲濾法蛋白芯片)的結(jié)核抗體檢測(cè)試劑的國(guó)家參考品。

        利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

        作者貢獻(xiàn)石大偉:醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章、對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱、統(tǒng)計(jì)分析、獲取研究經(jīng)費(fèi)、行政/技術(shù)/材料支持;王威、楊曉和于麗:實(shí)施研究;黃嘉維:實(shí)施研究、起草文章、統(tǒng)計(jì)分析;張春濤:指導(dǎo)、支持性貢獻(xiàn);許四宏:醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱、獲取研究經(jīng)費(fèi)、指導(dǎo)

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