盧 姍，張珊珊，鄒 康，盧昌寧，趙林果

（南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037）

異槲皮素（isoquercitrin），又名異槲皮素-3-O-葡萄糖苷[1]，具有抗氧化[2]、抑制腫瘤與癌癥[3]、調(diào)節(jié)免疫功能[4]、降低血糖血脂[5]等藥理作用，還可用于抗抑郁藥物的研發(fā)[6]，但其在植物中的含量極低，無法使用傳統(tǒng)的提取方法進(jìn)行大規(guī)模制備[7]。研究表明，蘆?。╮utin）與異槲皮素?fù)碛邢嗤哪负私Y(jié)構(gòu)，僅在異槲皮素葡萄糖基的C6 位多連接了一個(gè)鼠李糖[8]，其在植物中含量較高，如槐花米中的含量高達(dá)28%[9]，但其藥理活性、生物利用度等均不如異槲皮素[10]。因此，可以使用蘆丁作為轉(zhuǎn)化的底物制備異槲皮素。相較于化學(xué)法，生物轉(zhuǎn)化法因其條件溫和、高效環(huán)保、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)，已成為大規(guī)模制備異槲皮素的一種較為可行的途徑[11]。值得注意的是，生物轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化蘆丁制備異槲皮素的關(guān)鍵是尋找高效的能作用于α-1，6-鼠李糖苷鍵的α-L-鼠李糖苷酶。

α-L-鼠李糖苷酶（EC 3.2.1.40）屬于糖苷水解酶，可特異性切除糖苷類化合物非還原末端的α-L-鼠李糖基[12]，在食品工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[13-17]。目前已研究了多種細(xì)菌[18]和真菌[19]來源的α-L-鼠李糖苷酶，其中大部分α-L-鼠李糖苷酶最適反應(yīng)溫度在40～60 ℃[18-20]，屬于中溫酶，較難滿足一些工業(yè)生產(chǎn)所需。另一方面，天然產(chǎn)物大多是水難溶或水不溶的化合物，在實(shí)際的工業(yè)生產(chǎn)中，常借助高溫增加底物溶解度，提高傳質(zhì)速率，從而提高轉(zhuǎn)化效率，同時(shí)較高的反應(yīng)溫度還能降低體系黏度和避免雜菌污染等[21]，但這對(duì)參與反應(yīng)的酶蛋白的熱穩(wěn)定性有著很高的要求。研究發(fā)現(xiàn)嗜熱菌來源的酶蛋白普遍表現(xiàn)出優(yōu)異的熱穩(wěn)定性[22]，在較高的反應(yīng)溫度下也能長時(shí)間保持良好的催化活力。然而，目前僅報(bào)道過少數(shù)嗜熱菌來源的α-L-鼠李糖苷酶，如嗜熱菌Thermomicrobium sp.[23]、Dictyoglomus thermophilum[24-25]和Thermotoga petrophila DSM 13995[26]等。因此，嗜熱菌來源的α-L-鼠李糖苷酶資源值得進(jìn)一步研究和開發(fā)。

在前期研究中，作者已從NCBI 數(shù)據(jù)庫中篩選到嗜熱菌Sulfolobus islandicus（NC_021058.1）來源的α-L-鼠李糖苷酶SisRha 的基因序列，對(duì)其進(jìn)行了重組質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，作者首先優(yōu)化了重組酶SisRha 的表達(dá)條件，接著測定其酶學(xué)性質(zhì)，然后優(yōu)化了重組酶SisRha 制備異槲皮素的工藝條件。研究結(jié)果豐富了現(xiàn)有的α-L-鼠李糖苷酶資源，為嗜熱菌來源的α-L-鼠李糖苷酶的研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)提供了一種高反應(yīng)溫度下轉(zhuǎn)化蘆丁制備異槲皮素的方法。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

α-L-鼠李糖苷酶基因sisRha 來源于嗜熱菌Sulfolobus islandicus（NC_021058.1），基因片段的全長為2 652 bp，可編碼883 個(gè)氨基酸，理論蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量約為1.005 4×103，預(yù)測的等電點(diǎn)pI 為6.14。目的序列的全基因合成由上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行，表達(dá)宿主菌株Escherichia coli（E.coil）BL21（DE3）購自南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

乙腈、甲醇、乙醇、二甲基亞砜（DMSO）、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀及其他常見生化試劑（均為國產(chǎn)分析純）：國藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；酵母提取物、蛋白胨：英國Oxoid 公司產(chǎn)品；麥芽糊精：南京姜華化玻璃有限公司產(chǎn)品；蘆?。荷虾Ｕ鐪?zhǔn)生物科技有限公司產(chǎn)品；異槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品：成都曼思特生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；硫酸卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）：生物工程上海股份有限公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)電泳緩沖液、預(yù)混蛋白質(zhì)電泳Marker：南京天為公司產(chǎn)品；對(duì)硝基苯酚鼠李糖糖苷（pNPR）、考馬斯亮藍(lán)G-250：美國Sigma 公司產(chǎn)品；Bradford 蛋白質(zhì)含量檢測試劑盒：日本TaKaRa 公司產(chǎn)品；PAGE 凝膠快速制備試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒：上海雅酶生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：1.0 g/dL 胰蛋白胨，0.5 g/dL 酵母提取物，1.0 g/dL 氯化鈉。

TB 培養(yǎng)基：A 液為1 g/dL 麥芽糊精（或其他碳源），1.2 g/dL 胰蛋白胨，2.4 g/dL 酵母提取物；B 液為磷酸二氫鉀2.3 g/dL，磷酸氫二鉀16.43 g/dL。A液和B 液體積比為9∶1。

1.4 主要儀器與設(shè)備

SX-500 型全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器：日本TOMY公司產(chǎn)品；HH-4 型恒溫水浴鍋：國華電器（常州）有限公司產(chǎn)品；SHP-250 型生化培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；U-1800 型分光光度計(jì)：日本Hitachi 公司產(chǎn)品；超聲波細(xì)胞破碎機(jī)：寧波新芝生物科技有限公司產(chǎn)品；5415R 型高速離心機(jī)、溫度梯度PCR 儀：德國Eppendorf 公司產(chǎn)品；AIR TECH US-1300L-U 型超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)：美國BIO-RAD 公司產(chǎn)品；Agilent 1260 型高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司產(chǎn)品。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 重組菌的構(gòu)建及表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET-28-sisRha 熱激轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）的感受態(tài)細(xì)胞中，采用含有質(zhì)量濃度50 μg/mL 卡那霉素的LB 平板培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，37 ℃過夜培養(yǎng)后長出陽性轉(zhuǎn)化子，挑取單菌落至5 mL LB 試管中，于37 ℃搖床過夜培養(yǎng)，使用30%（體積分?jǐn)?shù)）的甘油將菌種保存于-80 ℃冰箱。取5 μL 菌液加入含50 μg/mL卡那霉素抗性的5 mL LB 試管中，180 r/min、37 ℃搖床過夜復(fù)蘇。

將500 μL 復(fù)蘇后的菌液轉(zhuǎn)接到50 mL LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，使用0.01 mmol/L 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)，28 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)8 h。8 000 r/min、16 ℃離心10 min 后收集菌體。加入5 mL 25 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液重懸菌體，超聲破碎后于10 000 r/min、16 ℃離心15 min，測定上清液酶活力。

1.5.2 酶活力的測定 以5 mmol/L pNPR 為底物，水解得到的對(duì)硝基苯酚（pNP）與碳酸鈉發(fā)生顯色反應(yīng)，在405 nm 的波長下測定產(chǎn)物的吸光度。反應(yīng)體系為：10 μL 500 mmol/L 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，20 μL 底物，65 μL 去離子水，混勻預(yù)熱后加入5 μL 酶，在酶的最適溫度和pH 下反應(yīng)5 min，以不加酶液的反應(yīng)體系作空白對(duì)照[22]。酶活力單位定義參照文獻(xiàn)[22]。pNP 標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=2.376x+0.048，決定系數(shù)R2=0.999 0。酶活計(jì)算公式為：

式中：E 為α-L-鼠李糖苷酶酶活力，U/mL；c 為酶反應(yīng)后的pNP 濃度，μmol/L；t 為酶與底物反應(yīng)時(shí)間，min；Vs為反應(yīng)體系的體積，mL；Ve為反應(yīng)體系中酶液的體積，mL；N 為酶液的稀釋倍數(shù)。

1.5.3 重組酶SisRha 的表達(dá)條件優(yōu)化 首先優(yōu)化TB 培養(yǎng)基的碳源種類，將復(fù)蘇菌液500 μL 分別接種至5 瓶50 mL 含質(zhì)量濃度1.00 g/dL 不同碳源（葡萄糖、蔗糖、甘油、菊粉、麥芽糊精）的TB 培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，于0.02 mmo/L IPTG 中誘導(dǎo)，28 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)48 h 后分別測定粗酶酶活力，酶活力測定方法見1.5.2。然后對(duì)TB 培養(yǎng)基的碳源質(zhì)量濃度（0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 g/dL）、誘導(dǎo)溫度（20、25、28、32、37、42 ℃）以及IPTG 濃度（0、0.005、0.010、0.050、0.100、0.250 mmol/L）進(jìn)行優(yōu)化。重組菌的培養(yǎng)與酶活力測定方法與上述一致。

1.5.4 重組酶SisRha 的純化 粗酶液置于60 ℃水浴鍋內(nèi)熱處理30 min，10 000 r/min、16 ℃離心15 min 后留上清液。采用鎳離子親和層析柱純化上清液，用含不同濃度咪唑的磷酸緩沖液洗脫并收集洗脫液，再經(jīng)透析后得到純酶。采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析純酶，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量。

1.5.5 重組酶SisRha 的酶學(xué)性質(zhì)

1）最適溫度和最適pH 分別將重組酶置于70～100 ℃（不同溫度間隔5 ℃）的水浴溫度和pH 為4.0～8.0（不同pH 間隔0.5）的緩沖液中反應(yīng)后測定吸光度，并計(jì)算相對(duì)酶活力，每次只改變一個(gè)變量，以測得的最高酶活力為100%，確定最適溫度和最適pH。

2）熱穩(wěn)定性和pH 穩(wěn)定性 將重組酶分別置于80、85、90 ℃水浴鍋 中分別保溫5、10、15、30、60、90、120 min 后，在其最適溫度和最適pH 下測定剩余酶活力（相對(duì)酶活力），探究其熱穩(wěn)定性；70 ℃下將酶置于pH 為4.0～7.5（不同pH 間隔0.5）的緩沖溶液保溫1 h 測定剩余酶活力（相對(duì)酶活力），探究其pH 穩(wěn)定性。

3）金屬離子耐受性 向反應(yīng)體系中分別添加終濃度為1 mmol/L 和3 mmol/L 的Fe3+、Ca2+、Na+、K+、Mg2+、Zn2+等金屬離子鹽溶液，以不含金屬離子的酶活力為100%，計(jì)算不同金屬離子體系的相對(duì)酶活力。

4）有機(jī)溶劑和鼠李糖耐受性 向反應(yīng)體系添加體積分?jǐn)?shù)0、1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%的甲醇、乙醇、二甲基亞砜（DMSO），以不含有機(jī)溶劑的酶活力為100%，測定有機(jī)溶劑對(duì)酶活力的影響；添加濃度0、25、50、100、150、200、250 mmol/L 的鼠李糖，以不加鼠李糖的酶活力為100%，探究鼠李糖（即產(chǎn)物）對(duì)酶活力的影響。

5）動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定和底物特異性分析 將重組酶加至濃度0.2～1.0 mmol/L（不同濃度間隔0.1 mmol/L）的人工底物pNPR 中反應(yīng)5 min 后測定其吸光度，按照米氏動(dòng)力學(xué)方程計(jì)算其Vmax、Km及kcat；再分別以50 mmol/L 的蘆丁、淫羊藿苷、朝藿定C、橘皮苷、柚皮苷為底物，于最適條件下測定重組酶SisRha 的酶活力，以底物pNPR 的酶活力為100%，探究該酶對(duì)不同天然底物的底物特異性。

1.5.6 產(chǎn)物HPLC 檢測 所用色譜柱為Agilent E clipse XDB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），流量0.8 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長368 nm，柱溫40 ℃；流動(dòng)相為甲醇與0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）甲酸水混合液（體積比為40∶60）。蘆丁出峰時(shí)間為13.091 min，異槲皮素為14.545 min[11]。以不同質(zhì)量濃度異槲皮素及相對(duì)應(yīng)的色譜峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，為y=21 456 x-245.42，決定系數(shù)R2=0.999 5。

1.5.7 重組酶SisRha 轉(zhuǎn)化蘆丁的條件優(yōu)化

1）轉(zhuǎn)化溫度和pH 優(yōu)化 構(gòu)建100 μL 的反應(yīng)體系，底物蘆丁為2 mmol/L，加酶量0.1 U/mL，檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液濃度50 mmol/L，去離子水補(bǔ)足至100 μL。分別在70～90 ℃（不同溫度間隔5 ℃）的水浴鍋和pH 4.5～7.0（不同pH 間隔0.5）的緩沖液中反應(yīng)2 h 后，加入400 μL 甲醇終止反應(yīng)，樣品離心后，由0.22 μm 濾膜過濾，HPLC 檢測異槲皮素的濃度并計(jì)算其產(chǎn)率，確定最適轉(zhuǎn)化溫度和pH。

2）加酶量優(yōu)化 在最適轉(zhuǎn)化溫度和pH 下，加入0、0.02、0.04、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 U/mL 的重組酶SisRha，反應(yīng)2 h 后HPLC 檢測，確定最適加酶量。

3）反應(yīng)歷程檢測 在最適轉(zhuǎn)化溫度、pH 和加酶量的條件下，分別于0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、120 min 時(shí)取樣，加入400 μL 甲醇終止反應(yīng)，樣品離心后，由0.22 μm 濾膜過濾后，HPLC 檢測，探究底物濃度與轉(zhuǎn)化時(shí)間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組酶SisRha 的表達(dá)條件優(yōu)化

重組菌目的蛋白質(zhì)的表達(dá)量條件優(yōu)化的結(jié)果如圖1 所示。通過對(duì)比不同碳源培養(yǎng)條件下SisRha的相對(duì)酶活力，發(fā)現(xiàn)菊粉為最合適的碳源（見圖1（a））；在對(duì)碳源含量進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，培養(yǎng)基中菊粉的質(zhì)量濃度為0.50 g/dL 和1.00 g/dL 時(shí)，重組酶SisRha 的相對(duì)酶活力最高且二者幾乎相同（見圖1（b））；當(dāng)誘導(dǎo)溫度為37 ℃（見圖1（c））且不添加誘導(dǎo)劑時(shí)（圖1（d）），重組酶的酶活力最高，即使極微量的IPTG（0.005 mmol/L）都會(huì)降低目的蛋白質(zhì)的表達(dá)量，這可能是由于培養(yǎng)基中微量的乳糖足以啟動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄，其本底表達(dá)即可獲得極高的表達(dá)。說明該酶的表達(dá)不需要依賴誘導(dǎo)劑IPTG，這在實(shí)際應(yīng)用中更有前景。綜上所述，重組酶SisRha 的最佳表達(dá)條件為：以0.50 g/dL 的菊粉作TB 培養(yǎng)基的碳源，不添加誘導(dǎo)劑，于37 ℃搖床培養(yǎng)48 h，表達(dá)量最高可至0.92 U/mL，為LB 培養(yǎng)基中的最佳表達(dá)量（0.16 U/mL）的5.75 倍。

圖1 重組酶SisRha 在TB 培養(yǎng)基中的表達(dá)條件優(yōu)化Fig.1 Optimization of expression conditions for recombinant enzyme SisRha in TB medium

2.2 重組酶SisRha 的純化及SDS-PAGE 分析

通過超聲破碎、熱處理、親和層析等方法對(duì)重組酶SisRha 進(jìn)行了純化，并對(duì)粗酶液（超聲破碎）、熱處理的酶液以及親和層析后的純酶進(jìn)行SDSPAGE 分析，結(jié)果如圖2 所示，通過熱處理，能去除大量非目的蛋白質(zhì)，很大程度上降低了目的蛋白質(zhì)后續(xù)的純化難度，通過親和層析，獲得了較純的目的蛋白質(zhì)，在1.0×105左右有單一的目的條帶。如表1 所示，純酶的比活力為10.76 U/mg，純化倍數(shù)是粗酶的12.92 倍，得率（純酶總酶活力/粗酶總酶活力×100%）為44.35%。獲得的純酶可應(yīng)用于后續(xù)的酶學(xué)性質(zhì)測定及蘆丁的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

圖2 重組酶SisRha 的SDS-PAGE 分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant enzyme SisRha

表1 重組酶SisRha 的純化及蛋白質(zhì)質(zhì)量Table 1 Purification and protein content of recombinant enzyme SisRha

2.3 重組酶SisRha 的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 重組酶SisRha 的反應(yīng)條件測定

1）最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性 重組α-L-鼠李糖苷酶SisRha 來源于嗜熱菌Sulfolobus islandicus，其最適生長溫度在80 ℃以上，該重組酶很有可能為高溫酶。因而本研究中使用人工底物pNPR 對(duì)重組酶SisRha 的最適溫度進(jìn)行測定，結(jié)果表明，重組酶SisRha 最適溫度為90 ℃（見圖3（a）），比重組α-L-鼠李糖苷酶PRHA2 的最適溫度高出30 ℃[27]。

在實(shí)際應(yīng)用中確定催化反應(yīng)溫度時(shí)，除了考慮酶能保持較高的反應(yīng)速率外，還應(yīng)考慮該溫度下是否具有較為優(yōu)良的熱穩(wěn)定性，其熱穩(wěn)定性結(jié)果如圖3（b）所示，重組酶SisRha 在80 ℃下保溫2 h 后酶活力幾乎沒有改變，而嗜熱菌來源的α-L-鼠李糖苷酶TpeRha 在同樣溫度下保溫2 h 后酶活力損失50%左右[26]，說明該酶具備優(yōu)異的熱穩(wěn)定性。

圖3 重組酶SisRha 的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性Fig.3 Optimum temperature and thermostability of recombinant enzyme SisRha

2）最適反應(yīng)pH 及pH 穩(wěn)定性 pH 環(huán)境的不同，不僅會(huì)很大程度上影響酶的催化反應(yīng)速率，還會(huì)對(duì)酶蛋白的穩(wěn)定性產(chǎn)生一定的影響。因此，本研究中對(duì)重組酶SisRha 的最適反應(yīng)pH 和該酶在不同pH 條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行了測定，結(jié)果如圖4 所示。與RhmA 最適反應(yīng)pH 7.8 不同[23]，重組酶SisRha 的最適pH 為5.5（見圖4（a）），且該酶在pH 4.5～6.5 時(shí)相對(duì)酶活力保持在80%以上。70 ℃下，重組酶SisRha 在pH 4.5～7.0 的緩沖體系中孵育1 h，均保留80%以上的殘余酶活力（見圖4（b）），這與該酶最適pH 測定曲線的趨勢相同，進(jìn)一步證實(shí)該酶在弱酸環(huán)境下穩(wěn)定性較好。

圖4 重組酶SisRha 的最適pH 和pH 穩(wěn)定性Fig.4 Optimum pH and pH stability of recombinant enzyme SisRha

2.3.2 金屬離子對(duì)重組酶SisRha 催化活性的影響部分金屬離子和螯合劑對(duì)重組酶SisRha 酶活力的影響如表2 所示，少數(shù)金屬離子對(duì)重組酶SisRha 具有微弱的激活作用，Mn2+具有相對(duì)明顯的激活作用，Cu2+和Zn2+則一定程度上抑制SisRha 的酶活力；螯合劑EDTA 對(duì)重組酶SisRha 的酶活力沒有顯著的影響，因此金屬離子對(duì)重組酶SisRha 的催化活性和三維結(jié)構(gòu)不起作用[28]。

表2 金屬離子對(duì)重組酶SisRha 的影響Table 2 Effects of metal ions on recombinant enzymes SisRha

2.3.3 重組酶SisRha 的有機(jī)溶劑和鼠李糖耐受性在工業(yè)生產(chǎn)過程中，常添加一定濃度的有機(jī)溶劑增加底物的溶解度，常用的助溶劑如甲醇、乙醇、二甲基亞砜（DMSO）等。本研究中以pNPR 為底物，在反應(yīng)體系中分別加入不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇、乙醇、DMSO 測定了重組酶SisRha 的有機(jī)溶劑耐受性。結(jié)果如圖5（a）所示，重組酶SisRha 對(duì)DMSO 的耐受性優(yōu)于甲醇和乙醇，DMSO 體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，殘余酶活力（相對(duì)酶活力）大于50%。

在糖苷水解酶反應(yīng)過程中，產(chǎn)物糖的積累會(huì)對(duì)酶的催化效率產(chǎn)生一定程度的抑制作用，因此，對(duì)產(chǎn)物糖的耐受能力的大小，一定程度上決定了糖苷水解酶能水解的底物濃度大小以及催化效率的高低。為確定重組酶SisRha 對(duì)產(chǎn)物鼠李糖的耐受能力，本研究中以pNPR 為底物，在反應(yīng)體系中分別加入不同終濃度的L-鼠李糖，測定重組酶SisRha 的鼠李糖耐受性。結(jié)果顯示，約添加20 mmol/L 鼠李糖時(shí)，該酶保留有50%左右的殘余酶活力（相對(duì)酶活力，見圖5（b））。

圖5 重組酶SisRha 的有機(jī)溶劑和鼠李糖耐受性Fig.5 Tolerance of organic solvent and rhamnose on recombinant enzyme SisRha

2.3.4 重組酶SisRha 的動(dòng)力學(xué)參數(shù)及底物特異性分析 為確定重組酶SisRha 的底物特異性，首先選取人工底物pNPR、pNPG、pNPX、pNPAraf、pNPArap作為底物進(jìn)行反應(yīng)，以確定重組酶SisRha 能切除的糖苷類型，結(jié)果如表3 所示。重組酶SisRha 僅作用于人工底物pNPR（與鼠李糖相連），比活力為25.06 U/mg，而對(duì)pNPG（與葡萄糖相連）、pNPX（與木糖相連）、pNPAraf（與阿拉伯呋喃糖相連）和pNPArap（與阿拉伯吡喃糖相連）等其他人工底物無作用。由此可以確定重組酶SisRha 為鼠李糖苷酶，僅專一識(shí)別鼠李糖苷鍵，而對(duì)其他種類的糖苷鍵沒有催化作用。

表3 重組酶SisRha 的底物特異性Table 3 Substrate specificity of recombinant enzyme SisRha

隨后測定了重組酶SisRha 對(duì)幾種典型的含有鼠李糖基的黃酮類化合物的催化能力，相較于人工底物pNPR（100%），重組酶SisRha 對(duì)蘆?。é?1，6-鼠李糖苷鍵）的催化效率最高，表現(xiàn)出47.45%的相對(duì)酶活力，朝藿定C（α-1，2-鼠李糖苷鍵）次之，對(duì)橘皮苷（α-1，6-鼠李糖苷鍵）和柚皮苷（α-1，2-鼠李糖苷鍵）只有大約10%的相對(duì)酶活力，對(duì)淫羊藿苷（α-1-鼠李糖苷鍵）幾乎無酶活力。這是由于不同的糖苷鍵類型及與母核連接的位置會(huì)影響酶的催化活性中心與底物的結(jié)合，從而影響酶的催化活性[29]。蘆丁和橘皮苷都通過α-1，6-鼠李糖苷鍵與β-D-葡萄糖連接，蘆丁的糖基連在黃酮的C3 位，而橘皮苷的糖基連在C7 位，兩者的空間結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致酶的催化活性有所不同。相較于切除α-1，2-鼠李糖苷鍵，重組酶SisRha 對(duì)α-1，6-鼠李糖苷鍵的切除能力更強(qiáng)，并對(duì)連在C3 位置的糖基的切除效果更好，這與RhmA 的底物特異性結(jié)果剛好相反[23]。隨后又進(jìn)一步研究了重組酶SisRha 對(duì)pNPR 的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，以確定其底物親和力和催化效率。結(jié)果如表4所示，重組鼠李糖苷酶SisRha 對(duì)人工底物pNPR 親和力較好，Km值為（0.15±0.03）mmol/L，Vmax值為（6.26±0.51）U/mg，Kcat值為（10.48±0.86）s-1；Kcat/Km為（73.28±11.56）L/（s·mmol）。

表4 重組酶SisRha 的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 4 Kinetic parameters of recombinant enzyme SisRha

2.4 重組酶SisRha 轉(zhuǎn)化蘆丁的條件優(yōu)化

由2.3.4 的結(jié)果可知，在天然底物的催化中，重組酶SisRha 對(duì)蘆丁的催化能力最強(qiáng)，因此本研究中選取蘆丁作為轉(zhuǎn)化底物，對(duì)該酶水解蘆丁制備異槲皮素的反應(yīng)條件進(jìn)行進(jìn)一步探究。首先優(yōu)化了重組酶SisRha 轉(zhuǎn)化蘆丁的反應(yīng)溫度、pH 以及加酶量，結(jié)果如圖6 所示。當(dāng)反應(yīng)溫度為85 ℃（見圖6（a）），反應(yīng)pH 為5.0 時(shí)（見圖6（b）），蘆丁的轉(zhuǎn)化效率最高。這與重組酶SisRha 的最適反應(yīng)溫度和pH 相比均有所下降，主要是由于蘆丁轉(zhuǎn)化時(shí)間比pNPR 反應(yīng)時(shí)間長，轉(zhuǎn)化過程中既要使酶發(fā)揮最佳的催化活性，又要確保酶的穩(wěn)定性不能太差。而該酶的酶學(xué)性質(zhì)表明85 ℃時(shí)既能發(fā)揮相對(duì)較高的催化活性還能避免酶活力的大量損失；另一方面，不同底物與酶的催化活性中心結(jié)合情況不同，導(dǎo)致最適反應(yīng)pH 也有所差異。在此基礎(chǔ)上又探究了重組酶SisRha 的加酶量對(duì)蘆丁轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果表明僅添加0.40 U/mL 重組酶SisRha，可將2 mmol/L 底物蘆丁幾乎完全轉(zhuǎn)化，摩爾轉(zhuǎn)化率高達(dá)98.56%（見圖6（c）），相較于酸水解法轉(zhuǎn)化率提高了50%左右[30]。

為探究重組酶SisRha 轉(zhuǎn)化蘆丁生成異槲皮素的反應(yīng)中底物與產(chǎn)物的變化趨勢，對(duì)反應(yīng)歷程進(jìn)行了監(jiān)測。結(jié)果如圖6（d）所示，反應(yīng)初始時(shí)，反應(yīng)體系內(nèi)僅有2 mmol/L 蘆丁存在，隨著反應(yīng)時(shí)間的不斷增加，底物蘆丁的濃度逐漸減少，同時(shí)伴隨著產(chǎn)物異槲皮素濃度的逐漸上升。至反應(yīng)60 min 左右，產(chǎn)物異槲皮素的濃度達(dá)到最高水平，并保持穩(wěn)定，而底物蘆丁則幾乎完全轉(zhuǎn)化（見圖6（d））。

圖6 重組酶SisRha 轉(zhuǎn)化蘆丁的條件優(yōu)化與反應(yīng)歷程Fig.6 Optimization of conversion conditions for rutin with recombinant enzyme SisRha and the reaction process

3 結(jié)語

作者表達(dá)定性了一種嗜熱菌Sulfolobus islandicus來源的α-L-鼠李糖苷酶SisRha，重組酶SisRha 最適反應(yīng)溫度為90 ℃，具有優(yōu)異的熱穩(wěn)定性，并且在pH 4.5～7.0 的環(huán)境下能保持優(yōu)良的穩(wěn)定性。重組酶SisRha 具有切除α-L-鼠李糖苷鍵（與苷元直接相連）、α-1，6-鼠李糖苷鍵、α-1，2-鼠李糖苷鍵的能力。該酶對(duì)天然底物蘆丁的催化效率較高，利用該酶水解蘆丁制備異槲皮素的適宜反應(yīng)條件為用酶量0.40 U/mL，在85 ℃、pH 為5.0 的反應(yīng)體系中反應(yīng)60 min。此條件下，可將2 mmol/L 底物蘆丁幾乎完全轉(zhuǎn)化，摩爾轉(zhuǎn)化率可達(dá)98.56%。本研究不僅豐富了現(xiàn)有α-L-鼠李糖苷酶資源，為嗜熱菌來源的α-L-鼠李糖苷酶的研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)還提供了一種高溫條件下轉(zhuǎn)化蘆丁制備異槲皮素的方法，為生物酶法制備異槲皮素的研究提供了技術(shù)支撐。