王乾芬 李 鵬 徐 萍 徐小博

（新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003）

金銀花（Lonicera japonicaThunb.）是忍冬科忍冬屬植物忍冬的干燥花蕾或初開(kāi)的花，性甘、寒，味淡、微苦，具有清熱解毒、消炎退腫的功效，是一種傳統(tǒng)的中藥材［1-3］。研究分析發(fā)現(xiàn)，金銀花中的活性物質(zhì)主要有木犀草苷、肌醇、咖啡酸、綠原酸以及黃酮類(lèi)等，藥理實(shí)驗(yàn)證明其具有抗菌及抗氧化的作用［4-5］。

金銀花的枝葉產(chǎn)量遠(yuǎn)大于花，藥用資源豐富，成本更為低廉。有研究表明，金銀花枝葉中活性成分及作用與花相似，具有較好的抑菌和抗氧化效果［6-9］。但是，金銀花枝葉常常被廢棄，并未發(fā)揮出其有效的藥用價(jià)值。發(fā)酵提取法對(duì)藥用植物中多種活性成分有較高的提取率，發(fā)酵后金銀花浸提液抗氧化性及抑菌性有所提高［10-12］。微生物發(fā)酵研究主要集中于金銀花，綜合比較不同微生物發(fā)酵金銀花枝葉的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文分別利用酵母菌、乳酸菌、雙歧桿菌及枯草芽孢桿菌對(duì)金銀花枝葉進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)比了發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及枯草芽孢桿菌的抑菌效果，并通過(guò)測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物清除ABTS+自由基、DPPH自由基的能力及對(duì)FRAP亞鐵離子的還原能力來(lái)評(píng)估發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化能力，為提高金銀花枝葉的利用價(jià)值以及合理利用金銀花枝葉提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料金銀花枝葉由新鄉(xiāng)市博凱生物技術(shù)有限公司提供，脫水烘干后進(jìn)行粉碎，濾篩棄去濾渣保存?zhèn)溆?。雙歧桿菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌由新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵產(chǎn)物制備 分別將1 g乳酸菌、酵母菌、雙歧桿菌、枯草芽孢桿菌加水溶解，并定容至10 mL。菌種按照要求接種于含6 mL MRS及1 g金銀花枝葉粉的三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。乳酸菌接種量為7%，38 ℃培養(yǎng)15 h；雙歧桿菌接種量為5%，44 ℃培養(yǎng)6 h；酵母菌接種量為6%，37 ℃培養(yǎng)5 h；枯草芽孢桿菌接種量為7%，38 ℃培養(yǎng)4 h。利用70%的乙醇進(jìn)行超聲提?。?50 W、35 kHz、30 min），重復(fù)3次。提取液繼續(xù)進(jìn)行離心（4 000 r/min、5 min）濃縮。

1.2.2 抑菌能力測(cè)定 分別將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌100 μL、106個(gè)/mL的菌懸液均勻涂布于培養(yǎng)基上，使用打孔器均勻打孔，取50 μL發(fā)酵產(chǎn)物至孔中，37 ℃培養(yǎng)24 h。以無(wú)菌水為陰性對(duì)照，青霉素溶液（0.05 g青霉素溶于2 mL蒸餾水中，稀釋10-2）為陽(yáng)性對(duì)照。

配制濃度為225、200、175、150、125 mg/mL的樣品液。取0.10 mL菌懸液加4.90 mL培養(yǎng)基為對(duì)照組；取4.80 mL培養(yǎng)基和0.10 mL菌懸液，加入0.10 mL待測(cè)樣品為樣品組。混勻后恒溫培養(yǎng)24 h，于600 nm處測(cè)OD值，試驗(yàn)重復(fù)3次，以青霉素溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。按照公式（1）計(jì)算抑菌率，并計(jì)算出抑菌率為50%時(shí)所用物質(zhì)的濃度值即為半抑制濃度（IC50值）。

1.2.3 抗氧化能力測(cè)定

1.2.3.1 發(fā)酵產(chǎn)物配制 配制發(fā)酵產(chǎn)物濃度梯度為0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20及0.23 mg/mL的樣品液。

1.2.3.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定 DPPH自由基清除能力的測(cè)定參考文獻(xiàn)［6、13、14］。取發(fā)酵產(chǎn)物和DPPH溶液各1.0 mL，以1.0 mL10% DMSO水溶液和1.0 mL 95%乙醇混合液為參比，于517 nm處測(cè)定吸光度，為樣品組；取1.0 mL 10%DMSO加入1.0 mL DPPH溶液為對(duì)照組；取1.0 mL供試溶液加入1.0 mL 95%乙醇為空白對(duì)照。以未發(fā)酵的金銀花枝葉為對(duì)照，以BHT為陽(yáng)性對(duì)照，按公式（2）計(jì)算清除率。

并計(jì)算出清除率為50%時(shí)所用物質(zhì)的濃度值即為IC50值。

1.2.3.3 ABTS+自由基清除能力的測(cè)定 ABTS+自由基清除能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)［6、13］。100 μL發(fā)酵產(chǎn)物加入900 μL ABTS+·溶液為樣品組，100 μL 10% DMSO水溶液和900 μL ABTS+·溶液為對(duì)照組，100 μL供試溶液和900 μL乙醇為空白組。室溫放置10 min，于734 nm測(cè)定吸光度，以未發(fā)酵的提取物為對(duì)照，以BHT為陽(yáng)性對(duì)照，按公式（2）計(jì)算清除率，并計(jì)算出清除率為50%時(shí)所用物質(zhì)的濃度值即為IC50值。

1.2.3.4 FRAP亞鐵離子還原能力的測(cè)定 FRAP亞鐵離子還原能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)［15-16］。以10 μL發(fā)酵產(chǎn)物加200 μL FRAP工作液為樣品組，10 μL 10% DMSO水溶液和200 μL FRAP工作液為對(duì)照組，10 μL供試溶液加200 μL乙醇為空白組?；旌暇鶆颍?7 ℃溫育適宜時(shí)間，于593 nm測(cè)定吸光度，以未發(fā)酵的提取物為對(duì)照，以BHT、BHA及PG為陽(yáng)性對(duì)照，按照公式（2）計(jì)算清除率，并計(jì)算出清除率為50%時(shí)所用物質(zhì)的濃度值即為IC50值。測(cè)定0.1～1.6 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)FeSO4溶液的OD值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用0.5 mmol/L FeSO4為對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)樣品抗氧化活性與其達(dá)到同一吸光度值時(shí)得到一個(gè)FRAP值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)3種致病菌的抑菌能力發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及枯草芽孢桿菌均產(chǎn)生了抑菌圈，這表明發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)3種致病菌有一定的抑菌效果，圖1列出了4種發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圖片。

圖1 發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌情況

發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)細(xì)菌的IC50對(duì)比結(jié)果見(jiàn)圖2，發(fā)酵產(chǎn)物抑菌率與提取物濃度呈負(fù)相關(guān)。由圖2可知，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制能力最強(qiáng)，酵母菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)枯草芽孢桿菌抑制能力最強(qiáng)?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌抑制能力最弱，酵母菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌抑制能力最弱。

圖2 發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)細(xì)菌的半抑制濃度對(duì)比

2.2 不同發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化能力

2.2.1 不同發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力 圖3為不同樣品IC50值的對(duì)比，IC50值越小，發(fā)酵產(chǎn)物清除相同數(shù)量的DPPH自由基所需樣品液就越少。由圖3可知，4種發(fā)酵產(chǎn)物中，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物清除DPPH能力最強(qiáng)（0.07 mg/mL），枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物清除DPPH能力最弱（0.09 mg/mL），且4種發(fā)酵產(chǎn)物比未發(fā)酵提取物的清除DPPH能力更強(qiáng)（未發(fā)酵提取物的IC50值為0.16 mg/mL）。

圖3 樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力對(duì)比

2.2.2 不同發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)ABTS+自由基的清除能力 圖4為不同樣品IC50值的對(duì)比，IC50值越小，發(fā)酵產(chǎn)物清除相同數(shù)量的ABTS+自由基所需樣品液就越少。由圖4可知，4種發(fā)酵產(chǎn)物中，酵母菌發(fā)酵產(chǎn)物清除ABTS+能力最強(qiáng)（IC50為0.06 mg/mL），雙歧桿菌發(fā)酵產(chǎn)物清除ABTS+能力最弱（IC50為0.10 mg/mL），但4種發(fā)酵產(chǎn)物均比未發(fā)酵提取物的清除ABTS+能力強(qiáng)（IC50為0.14 mg/mL）。

圖4 樣品對(duì)ABTS+自由基的清除能力對(duì)比

2.2.3 不同發(fā)酵產(chǎn)物還原亞鐵離子的能力 不同濃度FeSO4溶液在593 nm處與其吸光值呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=1.462 7x+0.258 0（R2=0.998 9），x為FeSO4溶液濃度，y為吸光值。

根據(jù)回歸方程，計(jì)算可得不同發(fā)酵產(chǎn)物和抗氧化劑BHT、BHA、PG以及未發(fā)酵提取物的IC50值，結(jié)果對(duì)比見(jiàn)圖5。發(fā)酵產(chǎn)物亞鐵離子還原能力與提取物濃度呈負(fù)相關(guān)。由圖5可知，4種發(fā)酵產(chǎn)物中，酵母菌發(fā)酵產(chǎn)物的亞鐵離子還原能力最強(qiáng)（IC500.44 mg/mL），乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物的亞鐵離子還原能力最弱（IC500.49 mg/mL），且發(fā)酵產(chǎn)物比未發(fā)酵產(chǎn)物（IC500.50 mg/mL）對(duì)于亞鐵離子的還原能力更強(qiáng)。

圖5 樣品對(duì)亞鐵離子的還原能力對(duì)比

當(dāng)FRAP值為0.5 mmol/L時(shí)，酵母菌發(fā)酵產(chǎn)物、乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物、枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物、雙歧桿菌發(fā)酵產(chǎn)物、BHT、BHA、PG及未發(fā)酵提取物的濃度分別為0.258、0.366、0.487、0.599、0.669、0.064、0.059及0.844 mg/mL。當(dāng)達(dá)到同一FRAP值時(shí)，物質(zhì)的濃度與其抗氧化活性成反比，因此，酵母菌發(fā)酵產(chǎn)物還原亞鐵離子能力最強(qiáng)，雙歧桿菌發(fā)酵產(chǎn)物還原亞鐵離子能力最弱，且4種發(fā)酵產(chǎn)物均比未發(fā)酵提取物還原亞鐵離子能力強(qiáng)。

單一的抗氧化試驗(yàn)不能完全地反映發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化能力，本文將DPPH自由基和ABTS+自由基的清除能力與亞鐵離子還原能力相結(jié)合來(lái)反映發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化能力。綜合以上數(shù)據(jù)，4種發(fā)酵產(chǎn)物的DPPH自由基和ABTS+自由基及亞鐵離子IC50值均比未發(fā)酵產(chǎn)物的IC50值更低，這表明金銀花枝葉發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化能力比未發(fā)酵產(chǎn)物有較大的提高，即發(fā)酵過(guò)程可以有效提高金銀花枝葉的抗氧化能力，這與徐文流等的研究結(jié)果一致［10-11，17-18］。

3 結(jié)論與討論

利用酵母菌、乳酸菌、雙歧桿菌及枯草芽孢桿菌分別發(fā)酵金銀花枝葉，并進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，4種發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及枯草芽孢桿菌均表現(xiàn)出一定的抑制作用，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌及大腸桿菌抑制能力均為最強(qiáng)，酵母菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制能力最強(qiáng)。在4種發(fā)酵產(chǎn)物中，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物清除DPPH自由基能力最強(qiáng)，酵母菌發(fā)酵產(chǎn)物清除ABTS+自由基能力及還原亞鐵離子能力最強(qiáng)，且發(fā)酵產(chǎn)物比未發(fā)酵提取物的抗氧化能力更強(qiáng)。

紅曲霉發(fā)酵金銀花后酚酸和黃酮化合物含量都有不同程度地提高，發(fā)酵后的紅曲金銀花ABTS+和DPPH自由基清除能力均高于未發(fā)酵金銀花［11］。植物乳桿菌和釀酒酵母混合發(fā)酵金銀花后黃酮的含量提升了10%，多酚的含量提升了24%，DPPH自由基清除率由55%提升到71%，ABTS+自由基清除率由59%提升到64%［10］。藥理學(xué)研究表明，酚類(lèi)及黃酮類(lèi)物質(zhì)具有抗氧化和抑菌作用，在微生物發(fā)酵過(guò)程中代謝分泌的水解酶類(lèi)能促進(jìn)酚類(lèi)物質(zhì)的釋放，可以有效地提高金銀花的總酚和總黃酮含量。因此，金銀花枝葉發(fā)酵產(chǎn)物呈現(xiàn)出抑菌效果，且比未發(fā)酵提取液的抗氧化能力更強(qiáng)。根據(jù)研究結(jié)果，金銀花在采摘過(guò)程中產(chǎn)生的枝葉可以經(jīng)過(guò)發(fā)酵來(lái)提高浸提液的品質(zhì)，同時(shí)為提高金銀花枝葉的利用價(jià)值以及合理利用金銀花枝葉提供理論依據(jù)。