鐘菁華，王中亮，武 涌，高金燕，陳紅兵,*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)食品學(xué)院，江西 南昌 330047；3.江西省食物過敏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；4.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

食物過敏是影響人體健康的特異性免疫性疾病之一，表現(xiàn)為機(jī)體在攝入某些食物蛋白后會(huì)產(chǎn)生一系列不良反應(yīng)。臨床癥狀主要有嘔吐、腹瀉、便血、濕疹等，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致休克和死亡[1]。大量的研究表明，在過去20～30 年中，食物過敏的發(fā)病率逐漸上升，且呈現(xiàn)出每10 年增加1.2 個(gè)百分點(diǎn)的趨勢(shì)[2-3]。環(huán)境因素似乎是導(dǎo)致最近食物過敏患病率增加的主要因素，而環(huán)境因素中飲食習(xí)慣的改變被認(rèn)為是這種流行趨勢(shì)的潛在驅(qū)動(dòng)因素[4]。西方飲食成分以高脂、高糖、高鹽、深加工以及低纖維為特點(diǎn)，高脂和低纖維飲食已被明確證實(shí)可以影響食物過敏的發(fā)病進(jìn)程[5-7]。而高鹽飲食對(duì)食物過敏的影響尚不清楚。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，成年人每天對(duì)于食鹽的生理需求量?jī)H為4 g，世界衛(wèi)生組織建議成年人每天攝鹽量不應(yīng)超過5 g[8]。但調(diào)査發(fā)現(xiàn)，部分國家人均每日攝鹽量超過了10 g。中國是傳統(tǒng)的高鹽飲食國家，中國北方仍然是世界上鹽攝入量最高的地區(qū)之一（每天11.2 g），甚至以清淡飲食著稱的南方，其居民日均食鹽攝入量已從1980年代的8.8 g，大幅增加到2010年代的10.2 g[9]。高鹽是否是誘發(fā)食物過敏患病率上升的原因有待研究。

食物過敏主要是由輔助性Th2細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的，具體而言，Th2細(xì)胞產(chǎn)生的白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-4促使B細(xì)胞發(fā)生類別轉(zhuǎn)換，進(jìn)而分泌大量的抗原特異性免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）E，最終介導(dǎo)肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的效應(yīng)反應(yīng)[10-11]。在早期的研究中，嗜堿性粒細(xì)胞是晚期的效應(yīng)細(xì)胞，當(dāng)致敏機(jī)體再次攝入過敏原后，抗原會(huì)迅速與致敏的嗜堿性粒細(xì)胞表面的特異性IgE結(jié)合，使嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒[12]；最近的研究表明嗜堿性粒細(xì)胞是產(chǎn)生IL-4的主要來源之一，在誘導(dǎo)Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[13-14]。此外，嗜堿性粒細(xì)胞在外周血中循環(huán)并遷移到炎癥部位，可以通過調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞（包括T細(xì)胞、B細(xì)胞或肥大細(xì)胞）來促進(jìn)食物過敏的發(fā)生[15-16]。因此，嗜堿性粒細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4可能是前期初始T細(xì)胞活化進(jìn)而向Th2方向分化的重要因素，然而嗜堿性粒細(xì)胞產(chǎn)生IL-4的條件及免疫機(jī)制尚不清楚。

近年來，越來越多的研究表明，過量攝入食鹽可以顯著影響機(jī)體的免疫系統(tǒng)[17-19]。例如，Wu Chuan等[19]發(fā)現(xiàn)高鹽飲食可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞反應(yīng)，特別是可以激活血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶1（serum and glucocorticoidregulated kinase 1，SGK1）通路來誘導(dǎo)致病性Th17細(xì)胞的產(chǎn)生，進(jìn)而加重自身免疫性疾病。另一項(xiàng)獨(dú)立研究也表明，高鹽誘導(dǎo)致病性Th17細(xì)胞的產(chǎn)生依賴于P38及其下游靶點(diǎn)SGK1的激活[20]。進(jìn)一步的研究也證實(shí)高鹽會(huì)促進(jìn)促炎性Th細(xì)胞的產(chǎn)生，其機(jī)制可能是通過抑制調(diào)節(jié)性T（regulatory T，Treg）細(xì)胞的免疫抑制功能從而發(fā)揮作用[21]。針對(duì)過敏性疾病，Matthias等[22]發(fā)現(xiàn)NaCl可以在體外誘導(dǎo)Th2細(xì)胞極化（顯著增加Th2細(xì)胞因子IL-4和IL-13的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)錄因子GATA3的表達(dá)），進(jìn)而調(diào)節(jié)過敏性皮炎微環(huán)境，而這也與SGK1信號(hào)通路有關(guān)。本研究聚焦食物過敏的重要效應(yīng)細(xì)胞——嗜堿性粒細(xì)胞，探究高鹽條件下KU812細(xì)胞脫顆粒及相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生情況，隨后，重點(diǎn)探究高鹽條件下是否會(huì)促進(jìn)嗜堿性粒細(xì)胞產(chǎn)生IL-4，及其產(chǎn)生IL-4細(xì)胞因子的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人外周血嗜堿性白細(xì)胞株（KU812） 中國科學(xué)院上海生化與細(xì)胞研究所；雞蛋過敏患者血清 江西省兒童醫(yī)院；1640培養(yǎng)基、胎牛血清 北京CellMax公司；CCK-8試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；IL-6試劑盒、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α試劑盒、TRIzol 美國Thermo Fisher公司；組胺試劑盒、β-氨基己糖苷酶（β-hexaminosidase，β-HEX）試劑盒上海撫生實(shí)業(yè)有限公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、TB Green Premix ExTaqII（Tli RNaseH Plus） 日本TaKaRa公司；P38抑制劑SB202190、SGK1抑制劑GSK650394 美國MCE公司；無酶無菌水、青鏈霉素混合液（100×） 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀、超低溫冰箱、高速冷凍離心機(jī)、Applied Biosystems QuantStudioTM3、超微量核酸蛋白測(cè)定儀 美國Thermo Fisher公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀日本Biometra 公司；CKX41 倒置熒光顯微鏡美國Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

KU812細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液（100×）的1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.2 不同濃度NaCl干預(yù)后KU812細(xì)胞存活率的測(cè)定

取對(duì)數(shù)期的KU812細(xì)胞以每孔100 μL加入96 孔板中，保證每孔細(xì)胞數(shù)2×105個(gè)/mL，空白組加入等量培養(yǎng)基，96 孔板外圈加入一圈磷酸鹽緩沖液，次日每孔分別加入10 μL不同濃度的NaCl，使其終濃度分別為10、20、30、40、50、60 mmol/L，對(duì)照組和空白組加入等量磷酸鹽緩沖液，24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，2 h后于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。根據(jù)下式計(jì)算不同濃度NaCl干預(yù)后KU812細(xì)胞的存活率。

1.3.3 高鹽條件下卵白蛋白誘導(dǎo)的KU812細(xì)胞脫顆粒模型的構(gòu)建

1.3.3.1 雞蛋過敏血清池的構(gòu)建

雞蛋過敏患者血清池是由雞蛋過敏患者的血清等體積混合制備而成（n＝10），患者的血清信息如表1所示。

表1 雞蛋過敏患者信息Table 1 Information of egg allergic patients

1.3.3.2 IgE介導(dǎo)的KU812細(xì)胞體外活化實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)期的KU812細(xì)胞以每孔300 μL加入48 孔板中，保證每孔細(xì)胞數(shù)2×106個(gè)/mL；次日，每孔加入30 μL雞蛋過敏血清池與細(xì)胞共孵育24 h；24 h后，陽性組加入終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的卵白蛋白（ovalbumin，OVA），實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為40 mmol/L的NaCl和終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的OVA，對(duì)照組加入等量磷酸鹽緩沖液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，常溫下1 000 r/min離心10 min，收集上清液并分裝（用來測(cè)定組胺、β-HEX、IL-6、TNF-α水平），置于－20 ℃凍存?zhèn)溆茫皇占募?xì)胞立即加入TRIzol，吹打均勻后置于－80 ℃凍存以備后續(xù)提取RNA。

1.3.3.3 組胺、β-HEX質(zhì)量濃度的測(cè)定

按相應(yīng)試劑盒的說明書測(cè)定組胺、β-HEX質(zhì)量濃度。

1.3.3.4 IL-6、TNF-α質(zhì)量濃度的測(cè)定

按相應(yīng)試劑盒的說明書測(cè)定IL-6、TNF-α質(zhì)量濃度。

1.3.4 NaCl刺激KU812細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)期的KU812細(xì)胞以每孔1 mL加入2 孔板中，保證每孔細(xì)胞數(shù)106個(gè)/mL；次日，實(shí)驗(yàn)組每孔加入終濃度為40 mmol/L的NaCl，對(duì)照組加入等量的無菌水。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，提取RNA。

取對(duì)數(shù)期的KU812細(xì)胞以每孔1 mL加入12 孔板中，保證每孔細(xì)胞數(shù)106個(gè)/mL；次日，實(shí)驗(yàn)組每孔加入終濃度為5 μmol/L的SGK1抑制劑或終濃度為10 μmol/L的P38抑制劑刺激0.5 h，對(duì)照組加入等量的二甲基亞砜刺激，0.5 h后兩組再加入終濃度為40 mmol/L的NaCl刺激。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，提取RNA。

1.3.5 KU812細(xì)胞RNA的提取

根據(jù)TRIzol試劑說明書進(jìn)行操作，步驟如下：在加入1 mL TRIzol的KU812細(xì)胞中加入200 μL的氯仿，混勻，劇烈渦旋15 s，冰上靜置3 min；4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上層液體400 μL后加入等量異丙醇，輕輕混勻，冰上靜置10 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min；去上清液，加入500 μL的體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液，混勻使沉淀懸浮，4 ℃、7 500 r/min離心10 min，重復(fù)此步驟一次；去上清液，倒扣離心管3 min左右來簡(jiǎn)單干燥RNA，吸取適量的無酶水溶解RNA，電泳檢測(cè)提取RNA的質(zhì)量并測(cè)定樣品的OD260nm/280nm比值和RNA濃度，樣品于－80 ℃保存。

1.3.6 KU812細(xì)胞RNA的反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR

將RNA反轉(zhuǎn)錄成DNA：1）在0.2 mL無酶管中加入2 μL的5×gDNA Eraser Buffer和1 μL的gDNA Eraser，再加入RNA，最后加無酶水至總體系為10 μL，置于42 ℃反應(yīng)2 min。2）再配制10 μL的Master Mix（1 μL Prim eScript RT Enzyme Mix I、1 μL RT Primer Mix 4、4 μL 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）、4 μL RNase Free dH2O），再分別加入至步驟1中的反應(yīng)液中，放入PCR儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；最后結(jié)束溫度設(shè)為4 ℃。反應(yīng)結(jié)束后樣品置于－20 ℃保存。

在美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）網(wǎng)站查找相應(yīng)的引物序列，進(jìn)行篩選后由上海生工公司進(jìn)行合成，引物信息如表2所示。

表2 qPCR相關(guān)引物信息Table 2 Primer sequences used for qPCR

PCR條件：采用20 μL的體系，在八連管中分別加入10 μL TB Green Premix ExTaqII（Tli RNaseH Plus）（2×）、0.8 μL PCR正向引物（10 μmol/L）、0.8 μL PCR反向引物（10 μmol/L）、0.4 μL ROX Reference Dye II（50×）、2 μL的cDNA溶液和6 μL滅菌水，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃34 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)分析及圖表繪制均采用GraphPad Prism 8.3.0軟件進(jìn)行，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NaCl對(duì)KU812細(xì)胞增殖的影響

使用細(xì)胞存活率這一指標(biāo)來表征KU812細(xì)胞受NaCl濃度影響下的增殖能力變化，一般認(rèn)為，樣品對(duì)細(xì)胞無毒性時(shí)細(xì)胞存活率不低于95%。通過CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著NaCl濃度的升高，細(xì)胞存活率下降（圖1）。在設(shè)置的6 個(gè)NaCl濃度中，10～40 mmol/L NaCl濃度下細(xì)胞存活率能保持在95%以上，說明此濃度范圍對(duì)細(xì)胞無毒性；而50 mmol/L和60 mmol/L的NaCl使細(xì)胞的存活率低于95%，說明該濃度NaCl對(duì)細(xì)胞有毒性。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，選取40 mmol/L作為NaCl作用細(xì)胞的最大無毒終濃度，這也與之前Kleinewietfeld[20]和Hernandez[21]等探究T細(xì)胞分化時(shí)所選取的NaCl濃度一致。

圖1 不同濃度NaCl對(duì)KU812細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of different concentrations of NaCl on KU812 cell proliferation

2.2 NaCl對(duì)KU812細(xì)胞脫顆粒釋放生物活性介質(zhì)組胺和β-HEX的影響

雞蛋過敏患者血清池與KU812細(xì)胞共孵育時(shí)，血清中的抗原特異性IgE會(huì)與嗜堿性粒細(xì)胞表面高親和力的FcεRI受體結(jié)合，使細(xì)胞處于致敏狀態(tài)，再加入OVA（在有無高鹽條件下）激發(fā)后，OVA與IgE特異性結(jié)合，引起FcεRI交聯(lián)并觸發(fā)致敏的KU812細(xì)胞脫顆粒。KU812細(xì)胞在脫顆粒時(shí)會(huì)釋放預(yù)合成的生物活性介質(zhì)（組胺和β-HEX），兩者是嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒的標(biāo)志性檢測(cè)物，其釋放水平的高低直接影響過敏癥狀的嚴(yán)重程度[23]。本實(shí)驗(yàn)通過ELISA檢測(cè)KU812細(xì)胞脫顆粒產(chǎn)生的生物活性介質(zhì)，如圖2所示，對(duì)照組、OVA組和OVA＋NaCl組釋放的組胺質(zhì)量濃度分別為45.98、47.69、46.91 ng/mL；釋放的β-HEX質(zhì)量濃度分別為69.68、70.52、71.01 ng/mL。最終結(jié)果表明OVA組和OVA＋NaCl組釋放的組胺和β-HEX質(zhì)量濃度并沒有顯著性差異（P＞0.05），說明NaCl并不能促進(jìn)KU812細(xì)胞脫顆粒產(chǎn)生生物活性介質(zhì)。

圖2 NaCl對(duì)KU812細(xì)胞脫顆粒釋放生物活性介質(zhì)的影響Fig.2 Effect of NaCl on the release of bioactive mediators by KU812 cells after degranulation

2.3 NaCl對(duì)KU812細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的影響

IL-6和TNF-α是常見的促炎細(xì)胞因子，有研究表明在食物過敏患者的血清中IL-6和TNF-α水平顯著上升，它們能作為食物過敏患者后期隨訪的標(biāo)志性檢測(cè)物[24]。本實(shí)驗(yàn)通過ELISA檢測(cè)KU812細(xì)胞脫顆粒產(chǎn)生的炎癥因子，如圖3所示，對(duì)照組、OVA組和OVA＋NaCl組釋放的IL-6質(zhì)量濃度分別931.58、1 015.91、1 255.69 pg/mL；釋放的TNF-α質(zhì)量濃度分別為3.46、5.71、7.51 pg/mL。結(jié)果表明OVA＋NaCl組比OVA組更能促進(jìn)KU812細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和TNF-α（P＜0.05）。進(jìn)一步通過qPCR進(jìn)行驗(yàn)證，同樣也發(fā)現(xiàn)OVA＋NaCl組中KU812細(xì)胞的IL-6和TNF-α基因相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。這些結(jié)果揭示NaCl雖然不能調(diào)節(jié)KU812細(xì)胞產(chǎn)生生物活性介質(zhì)，但是可以促進(jìn)KU812產(chǎn)生相關(guān)的促炎細(xì)胞因子?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，NaCl是Th2細(xì)胞的離子檢查點(diǎn)，能夠促進(jìn)T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化并產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞因子[22]。因此推測(cè)，NaCl可能也是促進(jìn)KU812細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的離子檢查點(diǎn)。

圖3 ELISA和qPCR檢測(cè)40 mmol/L NaCl對(duì)KU812細(xì)胞脫顆粒相關(guān)細(xì)胞因子分泌的影響Fig.3 Effect of 40 mmol/L NaCl on the secretion of degranulationrelated cytokines by KU812 cells detected by ELISA and qPCR

2.4 NaCl對(duì)KU812細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-4的影響

IL-4是由過敏反應(yīng)中Th2細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞產(chǎn)生的促炎因子和多效性細(xì)胞因子在初始T細(xì)胞分化成Th2細(xì)胞和過敏反應(yīng)的發(fā)生中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。嗜堿性粒細(xì)胞能分泌大量的IL-4，通過嗜堿性粒細(xì)胞-IL-4-肥大細(xì)胞軸來促進(jìn)食物過敏的產(chǎn)生[14]。Matthias等[22]在過敏性皮炎患者的皮膚活檢標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)嗜堿性粒細(xì)胞，且過敏性皮炎患者受損皮膚鈉濃度是未受損皮膚和健康對(duì)照組皮膚的30 倍，表明皮膚中的鈉積累與這種Th2介導(dǎo)的疾病有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)NaCl可以高度顯著促進(jìn)嗜堿性粒細(xì)胞KU812細(xì)胞釋放IL-4（P＜0.001）（圖4A）。而IL-4是促進(jìn)和維持Th2型細(xì)胞免疫的關(guān)鍵細(xì)胞因子，NaCl很可能促進(jìn)食物過敏的產(chǎn)生。

研究表明NaCl濃度的增加伴隨著高滲透性的增加，可以誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的激活[25]。且在其他細(xì)胞中SGK1基因可以調(diào)節(jié)Na＋運(yùn)輸和鹽穩(wěn)態(tài)[26]。SGK1在NaCl轉(zhuǎn)運(yùn)的背景下被廣泛研究，NaCl濃度的適度升高可以誘導(dǎo)T細(xì)胞中SGK1的表達(dá)，從而促進(jìn)致病性Th17細(xì)胞的產(chǎn)生[20]。同樣地，本研究也發(fā)現(xiàn)高鹽條件下會(huì)高度顯著促進(jìn)KU812細(xì)胞SGK1基因的表達(dá)（P＜0.001）（圖4B）。綜上，是否是由于SGK1的高表達(dá)從而導(dǎo)致高鹽條件下KU812細(xì)胞產(chǎn)生IL-4，仍需后續(xù)繼續(xù)研究。

圖4 NaCl對(duì)KU812細(xì)胞IL-4和SGK1基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of NaCl on IL-4 and SGK1 gene expression in KU812 cells detected by qPCR

2.5 NaCl促進(jìn)KU812產(chǎn)生IL-4的分子機(jī)制

為了進(jìn)一步探究在嗜堿性粒細(xì)胞KU812細(xì)胞中SGK1和IL-4表達(dá)間的靶向關(guān)系，本研究在40 mmol/L的NaCl條件下，利用SGK1的特異性抑制劑GSK650394處理KU812細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SGK1抑制劑可以極顯著降低KU812細(xì)胞中SGK1的表達(dá)（P＜0.01）（圖5A），并可以顯著降低IL-4基因的表達(dá)（P＜0.05）（圖5B）。這一結(jié)果揭示NaCl調(diào)節(jié)KU812細(xì)胞產(chǎn)生IL-4是由滲透敏感轉(zhuǎn)錄因子SGK1所介導(dǎo)的。

此外，哺乳動(dòng)物的高滲應(yīng)激是通過P38感知的，其下游靶標(biāo)是滲透敏感轉(zhuǎn)錄因子SGK1[27]。P38信號(hào)可以調(diào)節(jié)SGK1激活，高濃度的NaCl可以促進(jìn)P38磷酸化，從而激活SGK1[20]。在T細(xì)胞活化的相關(guān)研究中，NaCl通過P38-SGK1信號(hào)通路來促進(jìn)Th17和Th2細(xì)胞的產(chǎn)生[22,28]。Guo Hongxia等[29]也發(fā)現(xiàn)，高濃度NaCl加重結(jié)腸炎的機(jī)制依賴于P38和SGK1的上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究NaCl調(diào)節(jié)KU812細(xì)胞產(chǎn)生IL-4是否受到P38-SGK1通路的調(diào)控。為了證實(shí)SGK1受P38信號(hào)的調(diào)控，本實(shí)驗(yàn)在有無P38抑制劑（SB202190）的情況下，測(cè)定了NaCl刺激下KU812細(xì)胞中SGK1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，P38抑制劑可以高度顯著抑制SGK1的表達(dá)（P＜0.001）（圖5C），這與許多文獻(xiàn)中的結(jié)果[20,30]一致。此外，P38抑制劑可以高度顯著降低NaCl刺激下KU812細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4含量（P＜0.001）（圖5D）。Kleinewietfeld等[20]研究NaCl調(diào)節(jié)初始T細(xì)胞分化時(shí)發(fā)現(xiàn)，葡萄糖酸鈉與NaCl效果一樣，可以促進(jìn)致病性Th17細(xì)胞的產(chǎn)生，而甘露醇和氯化鎂卻不能，這揭示了NaCl起作用的因素是鈉離子。在本實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)體系中，具體是Na＋還是Cl－產(chǎn)生作用并不能夠確定，仍需要進(jìn)一步研究。綜合以上結(jié)果，本研究初步揭示NaCl可以通過P38-SGK1信號(hào)通路來調(diào)節(jié)KU812細(xì)胞產(chǎn)生IL-4，具體的機(jī)制示意圖如圖6所示。

圖5 qPCR檢測(cè)SGK1抑制劑和P38抑制劑對(duì)NaCl刺激KU812相關(guān)基因SGK1和IL-4表達(dá)的影響Fig.5 Effect of SGK1 inhibitor and p38 inhibitor on the expression of SGK1 and IL-4 in KU812 stimulated by NaCl detected by qPCR

圖6 NaCl對(duì)KU812細(xì)胞產(chǎn)生IL-4的影響機(jī)制示意圖Fig.6 Schematic diagram of the mechanism of the effect of sodium chloride on IL-4 production by KU812 cells

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)高濃度的NaCl并不能促進(jìn)嗜堿性粒細(xì)胞（KU812）脫顆粒產(chǎn)生生物活性介質(zhì)組胺和β-HEX，但可以調(diào)節(jié)KU812細(xì)胞的炎癥因子反應(yīng)。值得注意的是，NaCl可以促進(jìn)KU812細(xì)胞產(chǎn)生食物過敏重要調(diào)控因子IL-4，其產(chǎn)生機(jī)制依賴于P38-SGK1信號(hào)通路。因此，本研究結(jié)果提示NaCl可能是嗜堿性粒細(xì)胞炎癥因子反應(yīng)的離子檢查點(diǎn)，然而高鹽飲食是否增加食物過敏的風(fēng)險(xiǎn)，仍需要進(jìn)一步研究。