路振康，吳慶智，張 建，毛曉英*

（石河子大學食品學院，新疆 石河子 832003）

近年來，化學合成防腐劑被越來越多地用于抑制食源性病原體的生長。然而，長期使用這些防腐劑可能對人體有害[1]。植物次生代謝產(chǎn)物，如植物精油、生物堿、苯丙烷類化合物和多酚表現(xiàn)出顯著的抗菌性[2-3]。因此，開發(fā)天然防腐劑以取代這些合成防腐劑至關重要。

多酚是自然界中一種復雜而重要的植物次生代謝產(chǎn)物。大量的研究表明，由于其獨特的化學結構，植物源多酚具有多種生物活性，如抗氧化和抗菌活性，以及預防慢性疾病、心血管疾病、癌癥、骨質疏松和神經(jīng)退行性疾病的能力[4-6]。隨著天然產(chǎn)物的開發(fā)，植物多酚的多種生理功能逐漸成為食品科學領域的研究熱點之一。

核桃青皮是核桃加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品，其價值沒有得到充分的利用，不僅造成了副產(chǎn)品資源浪費，而且會造成一定程度的環(huán)境污染。據(jù)報道，核桃青皮含有大量植物化學物質，如醌類、酚類、黃酮類和環(huán)二芳基庚烷[7]。目前，核桃青皮中已鑒定出13 種不同的酚類化合物，其中8 種主要化合物包括鞣花酸、沒食子酸、兒茶素、原兒茶酸、表兒茶素、香草醛、楊梅素和胡桃醌，其中胡桃醌在核桃青皮提取物中占30%[8]。核桃青皮提取物的功能已被廣泛研究，它能有效抑制血漿中低密度脂蛋白的氧化和HL-60細胞的生長，并能誘導細胞凋亡[9]。此外，核桃青皮提取物中的純胡桃醌具有明顯的抗腫瘤作用，其可以有效抑制腫瘤生長，延長荷瘤小鼠的壽命，并通過線粒體途徑誘導人胃癌SGC-7901細胞凋亡[10]。核桃青皮提取物對食源性病原體的抗菌活性和其他潛在活性鮮有研究。因此，本研究分析核桃青皮提取物中的主要酚類化合物，評價核桃青皮提取物的體外抗氧化能力，分析核桃青皮提取物的抗菌活性及潛在機理。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

核桃青皮 新疆石河子農貿市場；pBR322質粒DNA 上海保藏生物技術中心；大腸桿菌CMCC 44102北京保藏生物科技有限公司。

槲皮苷、扁蓄苷、紫云英苷、金絲桃苷、異槲皮素、槲皮素、咖啡酸、阿魏酸、胡桃醌標準品（純度≥98%）、6-磷酸葡萄糖脫氫酶試劑盒 北京索萊寶生物科技有限公司；細菌總蛋白提取試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。所有其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

THZ-98振蕩培養(yǎng)箱、BPS-50CL恒濕恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科學儀器有限公司；Cary 50紫外分光光度計上海光譜儀器有限公司；DDS-307電導率儀 上海儀電科學儀器股份有限公司；970 CRT熒光分光光度計 上海精密儀器有限公司；S400-K多功能測量儀 梅特勒托利多科技（中國）有限公司；多功能酶標儀、NanoDrop 2000c超微量分光光度計 美國Thermo公司；HT7700透射電子顯微鏡 日本日立有限公司；DYY-6C電泳儀 北京六一生物科技有限公司；VD-850無菌操作箱 浙江孚夏醫(yī)療科技有限公司；LC-2010A HT型高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC） 日本島津公司；ACQUITY超高效液相色譜儀（ultra performance liquid chromatography，UPLC）、XEVO TQ-S三重四極桿串聯(lián)質譜儀（tandem mass spectrometry，MS/MS） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃青皮提取物的制備

核桃青皮在40 ℃烘箱中干燥48 h，用多功能破碎機破碎，過120 目篩。取20 g核桃青皮粉末加入500 mL體積分數(shù)50%乙醇溶液中，室溫下250 W超聲處理1 h。將混合物過濾，濾液使用旋轉蒸發(fā)器濃縮至膏狀，然后冷凍干燥，干燥后的樣品用去離子水溶解配制質量濃度1.5 mg/mL樣品溶液，并用0.1 mol/L的鹽酸和0.1 mol/L的NaOH溶液調節(jié)至pH 3，用D-101大孔吸附樹脂進行純化。吸附條件：流速0.5 mL/min、上樣液體積為50 mL。解吸附條件：洗脫液體積分數(shù)90%乙醇溶液、流速1.5 mL/min，用0.1 mol/L的鹽酸和0.1 mol/L的NaOH溶液調整流出液至pH 4，用旋轉蒸發(fā)器濃縮至膏狀，經(jīng)冷凍干燥器干燥后，貯存在干燥器中備用。

1.3.2 總酚含量的測定

參考文獻[11]并稍作修改。將10 mg凍干樣品溶解于10 mL ddH2O中，吸取1 mL樣品溶液與2.5 mL福林-酚試劑混合，然后加入2.5 mL 15% Na2CO3溶液，40 ℃水浴60 min后，室溫靜置冷卻20 min。采用紫外-可見分光光度計測定778 nm波長處吸光度。配制不同質量濃度（0、4、8、12、20、30 mg/L）沒食子酸標準溶液制作標準曲線，得到標準曲線方程y＝0.02x＋0.046 8，R2＝0.999?？偡雍恳詻]食子酸當量表示，單位為mg/g。

1.3.3 總黃酮含量的測定

參考文獻[12]并稍作修改。取1 mL樣品溶液與0.3 mL 5% NaNO2溶液混勻，靜置6 min。然后添加0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液混勻，靜置6 min。最后，向混合物中添加4 mL 4% NaOH溶液，然后用體積分數(shù)30%乙醇溶液定容至10 mL。靜置15 min后測定510 nm波長處吸光度。采用蘆丁標準溶液（0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL）繪制總黃酮的標準曲線，得到標準曲線方程y＝11.704x－0.006 7，R2＝0.998 3?？傸S酮含量以蘆丁當量表示，單位為mg/g。

1.3.4 UPLC-MS/MS分析核桃青皮提取物

配制質量濃度10 μg/mL核桃青皮提取物進行UPLC分析：BEH C18色譜柱（50 mm×5 mm，1.7 μm）；柱溫30 ℃；流速0.8 mL/min；進樣量1.0 μL；流動相為0.1%甲醇-水溶液（A）和色譜純乙腈（B）。梯度洗脫程序：0～2.5 min，86% A、14% B；2.5～3.5 min，86%～70% A、14%～30% B；3.5～4.5 min，70%～58% A、30%～42% B；4.5～5.5 min，58%～5% A、42%～95% B；5.5～6.0 min，5%～86% A、95%～14% B。MS/MS條件：電噴霧離子源；離子源溫度200 ℃；毛細管電壓2.0 kV；離子源補償電壓50 V；脫溶劑氣體溫度450 ℃；脫溶劑氣體流速750 L/h；錐孔氣體流量150 L/h；霧化氣壓0.7 MPa；選擇多反應檢測模式進行掃描分析。根據(jù)相應化合物峰面積采用外標法計算核桃青皮提取物中不同化合物的含量。

1.3.5 高效液相色譜法測定胡桃醌的含量

采用LC-2010A HT型HPLC測定胡桃醌的含量：樣品質量濃度為1.0 μg/mL；C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相甲醇-水溶液（體積比1∶1，用體積分數(shù)0.1%磷酸溶液調節(jié)至pH 4）；流速0.2 mL/min；紫外檢測波長250 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。梯度洗脫程序：0～15 min，95% A、5% B；15～30 min，30% A、70% B；30～45 min，100% B；45～60 min，95% A、5% B。根據(jù)胡桃醌峰面積采用外標法計算核桃青皮提取物中胡桃醌的含量。

1.3.6 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率的測定

參考文獻[13]并稍作修改。配制0.1 mmol/L 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）-乙醇溶液，4 ℃貯存?zhèn)溆谩Ｈ? mL DPPH-乙醇溶液與0.2 mL不同質量濃度（0.0625、0.125、0.25、0.50、1.00 mg/mL）的樣品（核桃青皮提取物和VC）溶液在黑暗中反應30 min，然后采用紫外-可見分光光度計測定517 nm波長處的吸光度。按式（1）計算DPPH自由基清除率。采用Origin Program 9.5軟件擬合計算半抑制質量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

式中：A0為4 mL DPPH和0.2 mL無水乙醇在517 nm處的吸光度；A1表示4 mL DPPH和0.2 mL樣品溶液在517 nm處測得的吸光度；A2表示4 mL無水乙醇和0.2 mL樣品溶液在517 nm處的吸光度。

1.3.7 2,2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)陽離子自由基清除率的測定

參考文獻[14]并稍作修改。將4 mL 2,2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）溶液（734 nm波長處吸光度0.70±0.02）與0.2 mL不同質量濃度（0.0625、0.125、0.25、0.50、1.00 mg/mL）的樣品（核桃青皮提取物和VC）溶液在黑暗中混合7 min，采用紫外-可見分光光度計測定734 nm波長處的吸光度。按式（2）計算ABTS陽離子自由基清除率。

式中，A0為4 mL ABTS溶液和0.2 mL無水乙醇在734 nm處的吸光度；A1為4 mL ABTS溶液和0.2 mL樣品在734 nm處的吸光度；A2為4 mL無水乙醇和0.2 mL樣品在734 nm處的吸光度。

1.3.8 偶氮二異丁脒鹽酸鹽誘導的蛋白質氧化損傷保護實驗

參考文獻[15]并稍作修改。制備250 mmol/L偶氮二異丁脒鹽酸鹽（2,2’-azobis-2-methyl-propanimidamide，dihhydrochloride，AAPH）儲備溶液。反應前將AAPH溶液在37 ℃水浴中孵育2 min。隨后分別將10 μL不同質量濃度（0（即陰性對照組）、0.1、1、10 mg/mL）樣品溶液與50 μL終質量濃度1.0 mg/mL牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液混合，并將混合物在37 ℃水浴中孵育10 min。然后加入20 μL終濃度50 mmol/L AAPH溶液和20 μL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（20 mmol/L、pH 7.4），均勻混合后37 ℃水浴中孵育4 h，用等體積PBS替換AAPH溶液作為空白對照組。隨后，將混合物與十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液以體積比4∶1混合均勻，沸水浴5 min，將樣品貯存在－20 ℃的冰箱中備用。使用10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。凝膠用考馬斯藍R-250染液染色30 min，用脫色液（含5%甲醇和7.5%乙酸）脫色12 h，然后在化學發(fā)光成像系統(tǒng)下成像，通過Quantity One?1-D軟件分析蛋白質條帶灰度，以各組BSA灰度與空白對照組BSA灰度的比值（相對灰度）表征蛋白質水平。

1.3.9 偶氮二異丁脒鹽酸鹽誘導的質粒DNA氧化損傷保護實驗

參考文獻[16]并稍作修改。將2.5 μL不同終質量濃度（0（即陰性對照組）、0.031 3、0.062 5、0.125、0.250、0.50 mg/mL）的樣品溶液分別與2.5 μL 50 mmol/L AAPH溶液、2.5 μL pPBR322質粒DNA溶液混合均勻。使用超微量分光光度計測定260、280 nm波長處光密度OD260nm、OD280nm，計算DNA質量濃度，1.8≤OD260nm/OD280nm≤2.0表明質粒DNA純度滿足要求。然后將混合物在37 ℃下培養(yǎng)1 h。用等體積PBS替換AAPH溶液作為空白對照組。采用1%瓊脂糖凝膠電泳30 min，在化學發(fā)光成像系統(tǒng)下進行成像，使用Quantity One?1-D軟件分析pBR322質粒DNA條帶強度，以各組DNA灰度與空白對照組DNA灰度的比值（相對灰度）表征DNA水平。

1.3.10 最小抑菌質量濃度的測定

參考文獻[17]并稍作修改，測定核桃青皮提取物對大腸桿菌的最小抑菌質量濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。將保藏在甘油管中的大腸桿菌接種至LB培養(yǎng)基中，接種量為2%，37 ℃下培養(yǎng)16～18 h進行活化，活化兩代后取對數(shù)生長期大腸桿菌，4 ℃、5 000 r/min離心10 min，收集菌體沉淀備用。用含不同終質量濃度（0.063、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/mL）核桃青皮提取物的LB培養(yǎng)基調整大腸桿菌濃度為1×105CFU/mL，以LB培養(yǎng)基中加入無菌水作為對照，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，以明顯抑制大腸桿菌生長所需的最低核桃青皮提取物質量濃度作為MIC。

1.3.11 核酸和蛋白質泄漏水平測定

參考文獻[18]并稍作修改。取對數(shù)生長期的大腸桿菌6 000 r/min離心10 min，用質量分數(shù)0.85%無菌生理鹽水重懸菌體沉淀，并調整菌體濃度為1×108CFU/mL。然后將細菌懸浮液與不同終質量濃度（1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC和2 MIC）的核桃青皮提取物混合培養(yǎng)2 h，對照組用無菌水處理細胞。在4 ℃下以5 000 r/min離心10 min后，收集上清液，測定260 nm和280 nm波長處吸光度，計算上清液中核酸和蛋白質量濃度。

1.3.12 大腸桿菌蛋白質的SDS-PAGE分析

參考文獻[19]并稍作修改。取對數(shù)生長期大腸桿菌用含不同終質量濃度（1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、M I C）核桃青皮提取物的LB 培養(yǎng)基調整濃度為1×108CFU/mL，以LB培養(yǎng)基中加入無菌水作為對照，在37 ℃、120 r/min培養(yǎng)6 h，4 ℃、8 000 r/min離心10 min后，用質量分數(shù)0.85%無菌生理鹽水重懸菌體沉淀，使用細菌總蛋白提取試劑盒提取總蛋白。使用5%的濃縮膠凝膠和12%的分離凝膠進行SDS-PAGE分析。電泳結束后用考馬斯藍R-250染液染色30 min，脫色液脫色12 h后在化學發(fā)光成像系統(tǒng)下進行成像。

1.3.13 大腸桿菌胞內酶β-半乳糖苷酶活力測定

參考文獻[20]并稍作修改。收集對數(shù)生長期大腸桿菌，4 ℃、8 000 r/min離心10 min后，用0.85%無菌生理鹽水重懸菌體沉淀。用M9培養(yǎng)基調整菌體濃度1×108CFU/mL，37 ℃下培養(yǎng)6 h。4 ℃、8 000 r/min離心10 min，并用新鮮M9培養(yǎng)基重懸菌體。將900 μL細菌懸浮液轉移至離心管中，添加100 μL不同終質量濃度（1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC）的核桃青皮提取物溶液，37 ℃下培養(yǎng)1 h。對照組加入等體積無菌水。所有樣品4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，在沉淀物中加入50 μL 20 mg/mL溶菌酶和50 μL TE緩沖液，混勻后在37 ℃下培養(yǎng)10 min。然后加入100 μL PBS（50 mmol/L、pH 7.4），將混合溶液放置在200 W超聲波細胞破碎器中，在冰浴中間歇超聲作用4 min。4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液以50 μL/孔加入96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μLβ-半乳糖苷酶反應緩沖液和50 μL 10 mg/mL鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（β-D-galactopyranoside，ONPG）?；旌先芤涸?7 ℃靜置反應1 h，然后每孔加入50 μL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應，并用酶標儀檢測420 nm波長處的吸光度A420nm以表征β-半乳糖苷酶的活力。

1.3.14 大腸桿菌呼吸氧化代謝的分析

參考文獻[21]并稍作修改。取3.6 mL PBS（0.02 mol/L、pH 7.4）、0.4 mL葡萄糖溶液和1.0 mL細胞懸液（1×105CFU/mL）混勻，敞口放置5 min后，通過S400-K多功能測量儀測定此初始溶液的溶解氧含量并根據(jù)溶解氧含量計算初始呼吸速率[21]。然后將終質量濃度500 mg/L的3 種典型抑制劑（碘乙酸、丙二酸、磷酸三鈉）、核桃青皮提取物添加到初始溶液中，混勻后靜置30 min，再次測定溶解氧含量并計算呼吸速率，按式（3）計算呼吸抑制率。

式中：R0為初始呼吸速率/（μmol/（g·min））；R1為核桃青皮提取物或3 種典型抑制劑處理組的呼吸速率/（μmol/（g·min））。

隨后將終質量濃度500 mg/L的3 種不同的典型抑制劑加入含有核桃青皮提取物的細胞懸液中。30 min后測定溶解氧含量和相關呼吸速率。按式（4）計算呼吸疊加抑制率。

式中：R1為單獨核桃青皮提取物處理時的呼吸速率/（μmol/（g·min））；R2為核桃青皮提取物分別和3 種典型抑制劑共同處理時的呼吸速率/（μmol/（g·min））。

取對數(shù)生長期大腸桿菌用含MIC核桃青皮提取物的LB培養(yǎng)基調整菌體濃度1×105CFU/mL，以LB培養(yǎng)基中加入無菌水作為對照。在37 ℃、120 r/min培養(yǎng)6 h后，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，用質量分數(shù)0.85%無菌生理鹽水重懸菌體沉淀。根據(jù)6-磷酸葡萄糖脫氫酶試劑盒說明書測定關鍵限速酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活力，單位為U/104個細胞。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗重復3 次，結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，采用t檢驗進行顯著性分析，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 核桃青皮提取物中總酚和總黃酮的含量

本研究核桃青皮提取物中總酚的含量為（21.71±0.98）mg/g，總黃酮含量為（22.16±0.45）mg/g。Soto-Maldonado等[9]研究中核桃青皮提取物中總酚含量為（18.63±0.72）mg/g。通常農副產(chǎn)品是酚類和黃酮的良好來源，如甘蔗渣和石榴皮富含酚類化合物[22-23]，葡萄渣和橄欖渣也是酚類化合物的重要來源[24]。

2.2 核桃青皮提取物的化學成分

如表1所示，核桃青皮提取物中共鑒定出9 種主要化合物，通過UPLC-MS/MS鑒定出槲皮素、扁蓄苷、紫云英苷、金絲桃苷、異槲皮素、槲皮素、咖啡酸、阿魏酸，通過HPLC鑒定出胡桃醌。其中，胡桃醌的含量最高，為（283.40±10.42）μg/mg，其次是槲皮苷，含量為（77.19±6.24）μg/mg。金絲桃苷的含量為（8.82±0.29）μg/mg，槲皮素的含量為（3.26±0.17）μg/mg。這些結果表明，核桃青皮提取物富含多酚和黃酮。植物提取物中的酚類和黃酮通常具有抗氧化和抗菌活性，如Oliveira等[25]研究表明，5 種不同核桃青皮提取物均具有較好的抗氧化能力，且能抑制革蘭氏陽性細菌的生長，對金黃色葡萄球菌的抑制效果尤為明顯。

表1 UPLC和HPLC分析核桃青皮提取物中的9 種化合物含量Table 1 Contents of nine compounds in the extract of green walnut determined by UPLC and HPLC

2.3 核桃青皮提取物的抗氧化能力

DPPH自由基清除率與ABTS陽離子自由基清除率常用來反映物質的抗氧化活性[26]。如圖1所示，核桃青皮提取物在一定程度上表現(xiàn)出對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除活性。VC清除DPPH自由基的IC50為0.077 5 mg/mL，核桃青皮提取物清除DPPH自由基的IC50為0.236 mg/mL；0.5 mg/mL VC溶液的DPPH自由基清除率為（96.31±0.64）%，相同質量濃度下核桃青皮提取物的DPPH自由基清除率為（91.61±0.13）%。VC清除ABTS陽離子自由基的IC50為0.065 mg/mL，核桃青皮提取物清除ABTS陽離子自由基的IC50為0.130 mg/mL；0.25 mg/mL VC溶液的ABTS陽離子自由基清除率為（99.65±0.03）%，而相同質量濃度下核桃青皮提取物的ABTS陽離子自由基清除率為（95.59±0.55）%，VC是良好的天然抗氧化劑，以上結果表明核桃青皮提取物具有較強的體外抗氧化能力。

圖1 核桃青皮提取物和VC的DPPH自由基清除率（A）和ABTS陽離子自由基清除率（B）Fig.1 DPPH radical (A) and ABTS cation radical (B) scavenging effects of the extract of green walnut husks and VC

2.4 核桃青皮提取物對生物大分子氧化損傷的保護作用

AAPH是一種疊氮化合物，是一種自由基誘導劑。在37 ℃、pH 7.0條件下，AAPH分解生成氮、碳自由基，后者可進一步與氧反應生成活性氧，當?shù)鞍踪|受到活性氧攻擊時，會導致肽鍵斷裂[27]。從圖2A可以看出，AAPH誘導后BSA水平明顯低于空白對照組。隨著核桃青皮提取物質量濃度的增加，BSA水平逐漸增加，0.1、1.0、10 mg/mL核桃青皮提取物處理后BSA相對灰度分別為空白對照組的（71.10±3.01）%、（88.29±1.99）%和（99.28±0.72）%。結果表明，核桃青皮提取物對BSA損傷和氧化的保護作用呈劑量-效應關系。

本研究配制混合物溶液中pBR322質粒DNA 的質量濃度為56.3 ng/μL，OD260nm/OD280nm＝1.92，表明該DNA純度符合實驗條件。如圖2B所示，空白對照組凝膠電泳結果顯示超螺旋DNA的條帶為優(yōu)勢條帶，但經(jīng)AAPH處理后，該條帶消失，表明超螺旋DNA被破壞，DNA分子被氧化和破壞，形成線性或開環(huán)DNA。隨著核桃青皮提取物質量濃度的增加，超螺旋DNA水平增加，而開環(huán)DNA或線性DNA水平減少。0.50 mg/mL核桃青皮提取物可明顯保護質粒DNA免受AAPH誘導氧化損傷。以上結果表明，核桃青皮提取物對DNA的氧化損傷具有保護和修復作用，與Yates等[28]的研究結果一致。

圖2 核桃青皮提取物對BSA（A）和pBR322質粒DNA（B）氧化損傷的保護作用Fig.2 Protective effect of the extract of green walnut husks against oxidative damage to BSA (A) and pBR322 plasmid DNA (B)

2.5 核桃青皮提取物對大腸桿菌膜通透性和完整性的影響

本研究中核桃青皮提取物對大腸桿菌MIC 為2.000 mg/mL，核桃青皮提取物對大腸桿菌有抑制作用。細胞膜在調節(jié)物質進出、細胞間信息交換以及保持細胞內環(huán)境穩(wěn)定方面具有重要作用，抗菌劑會對細胞膜造成不同程度的破壞，導致細胞內容物泄漏[28]，細菌的核酸和蛋白質泄漏水平可以表征細胞膜的通透性和完整性。如圖3所示，培養(yǎng)2 h后，核桃青皮提取物處理組上清液中蛋白和核酸質量濃度明顯高于對照組。隨著核桃青皮提取物質量濃度從1/8 MIC增加到MIC，上清液中的核酸和蛋白質量濃度增加，蛋白質量濃度從（4.34±0.02）mg/mL增加到（6.55±0.06）mg/mL，核酸的質量濃度從（283.63±9.09）ng/μL增加到（427.83±8.66）ng/μL。這些結果與2R,3R-二氫楊梅素處理后金黃色葡萄球菌核酸泄漏[17]一致，該研究推測2R,3R-二氫楊梅素可能通過誘導膜損傷導致細胞內容物泄漏。類似地，Chen Hao等[29]研究表明，與相應對照組細菌相比，20 g/L甜高粱酚類提取物分別處理大腸桿菌和金黃色葡萄球菌后，兩種細菌的蛋白質泄漏水平分別增加7.0 倍和6.9 倍，核酸泄漏量分別增加3.3 倍和2.9 倍，表明甜高粱酚類提取物明顯破壞了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細胞膜完整性，導致蛋白質和核酸泄漏。結合本實驗結果推測核桃青皮提取物可能的抑制機制為破壞大腸桿菌細胞膜的完整性，導致大腸桿菌蛋白質和核酸泄漏。

圖3 核桃青皮提取物處理后大腸桿菌細胞上清液中的蛋白質（A）和核酸（B）質量濃度Fig.3 Leakage of proteins (A) and nucleic acid (B) from E.coli cells treated with the extract of green walnut husks

2.6 核桃青皮提取物對大腸桿菌蛋白質合成的影響

蛋白質在細菌細胞的生物活動中具有重要作用，蛋白質損傷可能會破壞胞內酶系統(tǒng)的完整性。如圖4A所示，與對照組相比，1/8 MIC處理6 h后，蛋白質條帶清晰且無明顯變化。隨著核桃青皮提取物質量濃度的增加，大多數(shù)蛋白質條帶發(fā)生降解甚至消失，與甘蔗渣多酚提取物處理后金黃色葡萄球菌蛋白條帶降解甚至消失的結果[30]一致，該研究還指出蛋白質降解可能是甘蔗渣提取物對蛋白合成的干擾和控制基因表達造成的。Fei Peng等[31]采用富含酚類化合物的橄欖油提取物處理阪崎克羅諾桿菌時也發(fā)現(xiàn)類似的結果，可能的原因為細菌細胞的蛋白質合成和相關基因表達會受到干擾。已有研究表明多酚可以和蛋白質形成復合物，進而改變二者的結構、功能和營養(yǎng)特性，在蛋白質沉淀和酶抑制中起著重要作用[32-33]。由以上結果推測，核桃青皮提取物富含多酚類物質，因此可通過破壞細胞蛋白質合成殺死細菌。

如圖4B所示，當核桃青皮提取物的質量濃度達到1/8 MIC時，與未經(jīng)核桃青皮提取物處理的樣品相比，大腸桿菌中的β-半乳糖苷酶的活力被抑制；隨著核桃青皮提取物的質量濃度增加至MIC，β-半乳糖苷酶的活力明顯降低至較低水平，并呈明顯劑量-效應關系，與Hou Xiaoyan等[20]發(fā)現(xiàn)川椒籽抗菌肽NP-6對β-半乳糖苷酶活力的抑制作用呈明顯劑量-效應關系相似。由此推測，核桃青皮提取物可以破壞大腸桿菌的細胞壁和細胞膜，進一步抑制胞內酶的活力，使細胞代謝紊亂，從而殺死細胞。

圖4 經(jīng)核桃青皮提取物處理的大腸桿菌全細胞蛋白質的SDS-PAGE分析結果Fig.4 SDS-PAGE analysis of whole cell proteins from E.coli treated with the extract of green walnut husks

2.7 核桃青皮提取物對大腸桿菌呼吸的抑制作用

糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)途徑和磷酸戊糖途徑是呼吸代謝的主要途徑，而碘乙酸、丙二酸和磷酸三鈉分別抑制糖酵解途徑的磷酸甘油醛脫氫酶，三羧酸循環(huán)途徑的琥珀酸脫氫酶和磷酸戊糖途徑的6-磷酸葡萄糖脫氫酶[34]。如表2所示，核桃青皮提取物處理后呼吸抑制率達60.33%，這表明核桃青皮對大腸桿菌的呼吸具有明顯的抑制作用。如表3所示，核桃青皮提取物/磷酸三鈉的疊加抑制率為24.28%，低于核桃青皮提取物/碘乙酸（47.64%）和核桃青皮提取物/丙二酸（58.84%）。由此可知，核桃青皮提取物與3 種典型的抑制劑均表現(xiàn)出協(xié)同抑制作用。

表2 代表性抑制劑和核桃青皮提取物對大腸桿菌的呼吸抑制率Table 2 Inhibitory effects of representative inhibitors and the extract of green walnut husks against respiration of E.coli

表3 核桃青皮提取物與代表性抑制劑對大腸桿菌呼吸抑制的疊加抑制率Table 3 Inhibitory effect of the extract of green walnut husks combined with representative inhibitors on respiration of E.coli

呼吸疊加抑制率越低表明抗菌物質與典型抑制劑參與抑制呼吸代謝途徑越相似[35]。本研究中核桃青皮提取物/磷酸三鈉的疊加抑制率最低，由此推測核桃青皮提取物可能通過磷酸戊糖途徑抑制大腸桿菌呼吸作用。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶是磷酸戊糖途徑中的關鍵酶，催化葡萄糖-6-磷酸氧化生成6-磷酸葡萄糖內酯（圖5）。與對照組相比，核桃青皮提取物處理6 h后，大腸桿菌的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活力極顯著降低（P＜0.01）。由此可知，核桃青皮提取物主要通過調節(jié)磷酸戊糖途徑抑制大腸桿菌的呼吸。

圖5 磷酸戊糖途徑及核桃青皮提取物對大腸桿菌葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活力的影響Fig.5 Pentose phosphate pathway and effect of the extract of green walnut husks on glucose-6-phosphate dehydrogenase of E.coli

3 結論

研究結果表明，核桃青皮提取物富含酚類化合物和黃酮類化合物，這兩類化合物具有良好的抗氧化能力和對AAPH誘導的大生物分子氧化損傷的保護作用。核桃青皮提取物對食源性致病性大腸桿菌具有抗菌活性，其作用可能與多酚和黃酮類化合物有關。核桃青皮提取物可能通過破壞大腸桿菌細胞膜并抑制其蛋白質表達發(fā)揮抑菌作用。核桃青皮提取物可能通過參與調節(jié)磷酸戊糖途徑的呼吸代謝，降低葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活力。核桃青皮提取物可以在食品工業(yè)中用作高附加值的天然食品防腐劑。