陶 琦，劉希望，秦 哲，李世宏，白莉霞，楊亞軍，李劍勇

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050)

腸炎的發(fā)病率很高，嚴(yán)重危害養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展與人類(lèi)健康。目前，對(duì)腸炎的治療方法主要依靠抗生素，但這些藥物常常造成腸道菌群失調(diào)、抗生素殘留、環(huán)境污染等問(wèn)題，且效果并不理想[1-2]。Caco-2細(xì)胞系(human colon adenocarcinoma cell line)是一種人結(jié)腸腺癌細(xì)胞，最早由美國(guó)堪薩斯大學(xué)藥學(xué)院Ronald T.Borchardt 實(shí)驗(yàn)室，以及英國(guó)的Ciba-Geigy實(shí)驗(yàn)室在20世紀(jì)80年代后期建立的，是第一個(gè)被國(guó)外制藥企業(yè)以及實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用的腸道吸收細(xì)胞模型[3-4]。2002年被國(guó)際認(rèn)定為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法，已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)[5]。

腸炎是指腸壁表層和深層組織的炎癥，由于致病因素的刺激導(dǎo)致腸道發(fā)生不同程度的水腫、充血、出血、潰瘍、化膿、壞死等病變，臨床以消化紊亂、腹痛、腹瀉以及發(fā)熱為特征[6]。腸炎一般分為2種：感染性腸炎和非感染性腸炎。感染性腸炎常由病原微生物或其他因素誘發(fā)，常見(jiàn)的病原主要有細(xì)菌(致病性大腸桿菌、魏氏梭菌、痢疾桿菌等)、病毒(犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒、輪狀病毒等)、寄生蟲(chóng)(鞭毛蟲(chóng)、球蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)等)、真菌(藻狀菌、曲霉菌、白念珠菌等)，其中以大腸桿菌導(dǎo)致的細(xì)菌性腸炎最為普遍[7]；非感染性腸炎多與環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)、免疫等應(yīng)激因素有關(guān)[6]。而炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一種病因未明的慢性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn's disease,CD)，其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，因此臨床上治療和預(yù)防腸炎仍是待解決的難題[8]。腸道也是機(jī)體免疫的重要器官[9]，腸道免疫在人類(lèi)炎性腸病、肥胖、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、過(guò)敏性疾病及結(jié)腸癌中起著關(guān)鍵性作用[10-12]。在機(jī)體正常條件下，細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子參與機(jī)體固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)，促進(jìn)損傷組織的修復(fù)，參與細(xì)胞間的調(diào)控[13]。然而當(dāng)機(jī)體被微生物入侵時(shí)，多種細(xì)胞因子在短期內(nèi)快速分泌，超出機(jī)體免疫調(diào)節(jié)范圍，造成局部炎癥反應(yīng)，損傷機(jī)體組織和器官[14]。促炎細(xì)胞因子是炎癥反應(yīng)早期產(chǎn)物，已證實(shí)，IBD患者的腸道中分泌大量促炎細(xì)胞因子[15]，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17 和IFN-γ。

阿司匹林丁香酚酯(aspirin eugenol ester,AEE)是利用結(jié)構(gòu)拼合的前藥原理，以丁香酚(eugenol,EUG)對(duì)阿司匹林(aspirin,ASP)進(jìn)行酯化修飾而合成的一種新型藥用化合物，其降低了阿司匹林對(duì)胃腸道的刺激性，同時(shí)增強(qiáng)了揮發(fā)油丁香酚的穩(wěn)定性。研究表明，AEE具有確切的抗炎、抗氧化、降血脂、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和預(yù)防血栓形成和抗急性肝損傷等作用[16-18]，效果優(yōu)于前體藥物ASP和EUG，具有很好的成藥性?；谝陨涎芯砍晒?，推測(cè)AEE可能對(duì)IBD有一定的作用效果。鑒于此，本試驗(yàn)以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)Caco-2形成細(xì)胞炎癥模型，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化該炎癥模型，通過(guò)對(duì)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響，探討AEE對(duì)該炎癥模型的治療、預(yù)防和保護(hù)作用，以及與其前體藥物藥效的差異，為AEE在腸炎防治方面的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料人結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、胰酶購(gòu)自Gibco公司；LPS(Sigma-Aldrich，批號(hào)L4391)；阿司匹林丁香酚酯(含量99.8%，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所自制)；阿司匹林(含量99.8%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；丁香酚(含量99.95%，北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司)；CCK-8(Sigma-Aldrich，批號(hào)96992)；IL-1β、IL-6和TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)；酶標(biāo)儀(Thermo Multiskan GO)。

1.2 藥物配制將AEE溶解在DMSO中，配制成濃度為256 mmol/L的溶液作為母液，每種濃度用DMSO倍比稀釋后備用。將不同樣品中DMSO的最終濃度控制在0.5%以下；ASP及EUG操作同上；LPS用PBS溶解，配制成10 g/L的母液備用。

1.3 Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)于MEM培養(yǎng)液(含20% FBS，1%非必需氨基酸，1%L-谷氨酰胺，1%丙酮酸鈉)中，接種于T-25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning?)中，置于37℃、5% CO2、90%相對(duì)濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔日換液。在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)瓶中細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到90%左右時(shí)，用PBS洗滌除去非貼壁細(xì)胞，然后加入0.8 mL胰酶消化液進(jìn)行消化傳代，進(jìn)行以下試驗(yàn)。

1.4 Caco-2細(xì)胞毒性試驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Caco-2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL，于96孔板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h，棄掉培養(yǎng)液。試驗(yàn)組：各孔加入100 μL不同質(zhì)量濃度的LPS溶液(0.3，0.75，1.5，3，6，12，25，50，100 mg/L)，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置6個(gè)平行的重復(fù)孔；正常組：加入100 μL 不含LPS的細(xì)胞培養(yǎng)基，設(shè)置6個(gè)平行的重復(fù)孔；空白組：不含細(xì)胞的孔中，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，設(shè)置6個(gè)平行的重復(fù)孔。將細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)量D450 nm值。相同方法檢測(cè)AEE、ASP、EUG、ASP+EUG(1∶1)對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性。計(jì)算細(xì)胞活力公式如下：細(xì)胞活力=(試驗(yàn)組-空白組)/(正常組-空白組)×100%。

1.5 基于響應(yīng)面優(yōu)化LPS誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞炎癥的作用濃度和時(shí)間以IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量為指標(biāo)，采用響應(yīng)面分析法中的User-Design，優(yōu)化LPS的質(zhì)量濃度和作用時(shí)間。將濃度和作用時(shí)間的參數(shù)范圍輸入Design-Expert 軟件，生成User-Design響應(yīng)面試驗(yàn)表，即LPS對(duì)Caco-2細(xì)胞的作用濃度和時(shí)間(表1)，依此安排試驗(yàn)。加入LPS后，于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)從6孔板中取300 μL細(xì)胞上清液，再補(bǔ)充300 μL的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)以移取上清液。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)處理上清液樣品，檢測(cè)IL-1β、IL-6和TNF-α的生成量；將結(jié)果帶入軟件分析，得出LPS誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞炎癥模型的最佳時(shí)間和最佳濃度。

1.6 AEE對(duì)LPS誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞炎癥模型作用方式將Caco-2細(xì)胞分為空白組和試驗(yàn)組，空白組不經(jīng)任何處理，正常培養(yǎng)；試驗(yàn)組進(jìn)行以下處理。同時(shí)檢測(cè)不同處理組IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

1.6.1AEE預(yù)防作用 用不同濃度的AEE(4，16，32 μmol/L)孵育24 h后，棄上清，加入最佳濃度的LPS孵育至最佳時(shí)間后取樣檢測(cè)。

1.6.2AEE保護(hù)作用 將前述不同濃度的AEE與最佳濃度的LPS混合，孵育至最佳時(shí)間后取樣檢測(cè)。

1.6.3AEE治療作用 以最佳濃度的LPS孵育至最佳時(shí)間后，棄上清，加入前述不同濃度的AEE孵育24 h后取樣檢測(cè)。

1.7 AEE與其前體藥作用效果對(duì)比根據(jù)1.6的結(jié)果得出AEE的最佳作用濃度，然后配制相同濃度的ASP、EUG、ASP+EUG(1∶1)溶液，以相同方法進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)，對(duì)比作用效果。

2 結(jié)果

2.1 藥物對(duì)Caco-2細(xì)胞活性的影響CCK-8法檢測(cè)LPS對(duì)Caco-2細(xì)胞活力的影響(圖1),AEE、ASP、EUG和ASP+EUG(1∶1)對(duì)Caco-2細(xì)胞活力的影響(圖2)。結(jié)果顯示，LPS質(zhì)量濃度在0.3～25 mg/L時(shí)，細(xì)胞活力隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，說(shuō)明在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)LPS對(duì)Caco-2細(xì)胞活力有促進(jìn)作用。隨著質(zhì)量濃度的繼續(xù)增加，細(xì)胞活力又有一定的下降，但細(xì)胞活力仍在95%以上。在所選的濃度范圍內(nèi)，AEE和ASP對(duì)Caco-2細(xì)胞活力的影響較小，無(wú)顯著性差異。但256 μmol/L 的EUG及ASP+EUG(1∶1)，對(duì)Caco-2細(xì)胞活力有顯著影響(P<0.001)；故其濃度選定在0～128 μmol/L。

與空白對(duì)照組相比***P<0.001

2.2 基于響應(yīng)面優(yōu)化LPS誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞炎癥的作用濃度和時(shí)間

2.2.1試驗(yàn)方案及結(jié)果 如表1所示。

表1 User-Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

2.2.2響應(yīng)面模型的擬合 基于表1所示的模擬響應(yīng)結(jié)果，建立IL-1β、TNF-α和IL-6分泌量與時(shí)間和濃度之間的回歸模型：IL-1β=18.897 1- 0.028 8A+0.044 7B-2.506 6E-004AB+2.751 2E-004A2+0.010 3B2;TNF-α=8.495 1+0.027 7A+0.274 8B-3.224 2E-004AB-2.484 7E-004A2;IL-6=9.943 1-0.019 7A-0.124 5B+3.790 2E-004AB+2.999 2E-004A2+8.426 9E-003B2。

對(duì)IL-1β、TNF-α和IL-6分泌量與時(shí)間和濃度之間的回歸方程進(jìn)行方差分析(表2)，結(jié)果顯示，3個(gè)指標(biāo)回歸模型的P值均小于0.05，說(shuō)明該模型顯著，可進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

A.AEE；B.ASP；C.EUG；D.ASP+EUG(1∶1)。與空白對(duì)照組相比***P<0.001，*P<0.05

2.2.3響應(yīng)曲面分析 為了更加直觀地表示各因素與響應(yīng)目標(biāo)之間的關(guān)系，利用三維曲面圖進(jìn)一步分析各因素對(duì)IL-1β、TNF-α和IL-6分泌量的影響。由Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行優(yōu)化分析得到IL-1β、TNF-α和IL-6分泌量的最佳條件是LPS質(zhì)量濃度為100 mg/L，LPS作用時(shí)間為24 h，在此條件下，預(yù)測(cè)IL-1β、TNF-α和IL-6分泌量能達(dá)到最大(圖3)。

表2 回歸方程的方差分析

2.3 LPS及受試藥物的細(xì)胞毒性作用CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS在所選的濃度范圍內(nèi)對(duì)Caco-2細(xì)胞活力無(wú)影響，甚至低濃度的LPS對(duì)其還有一定的促進(jìn)作用。響應(yīng)面分析的結(jié)果顯示，LPS最佳質(zhì)量濃度為100 mg/L，作用最佳時(shí)間為24 h。與正常組比較，LPS組IL-1β、TNF-α和IL-6的濃度顯著升高，表明Caco-2細(xì)胞炎癥模型誘導(dǎo)成功。

A.IL-1β;B.TNF-α;C.IL-6

受試藥物的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，EUG和ASP+EUG(1∶1)的濃度為256 μmol/L時(shí)，可致細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05)，可能與丁香酚的性質(zhì)有關(guān)[19-20]；而AEE和ASP的濃度為256 μmol/L時(shí)，對(duì)Caco-2的細(xì)胞活力無(wú)顯著影響(P>0.05)，且AEE濃度為32 μmol/L時(shí)，對(duì)Caco-2細(xì)胞活力有促進(jìn)作用(P<0.05)。因此，本研究中受試藥物濃度為4，16，32 μmol/L。

2.4 AEE對(duì)LPS誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞炎癥模型的作用不同濃度AEE的作用結(jié)果如圖4所示。在各作用方式下，高濃度AEE組的細(xì)胞因子水平均低于低、中濃度組(P<0.05)，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。在該細(xì)胞模型上，AEE治療后IL-6水平顯著低于AEE預(yù)防和保護(hù)后的水平(P<0.05)(圖4A)，而細(xì)胞因子IL-1β則與AEE預(yù)防和保護(hù)后的水平無(wú)顯著性差異(P>0.05)(圖4B)；AEE治療后的TNF-α水平顯著低于AEE保護(hù)后的水平(P<0.05)，而與AEE預(yù)防后的TNF-α水平無(wú)顯著性差異(P>0.05)(圖4C)。以上結(jié)果說(shuō)明，AEE對(duì)LPS誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞炎癥模型治療效果較好。

A.IL-6；B.IL-1β；C.TNF-α。與空白對(duì)照組相比**P<0.01，*P<0.05；與LPS組相比###P<0.001，##P<0.01

2.5 AEE與其前體藥作用效果的對(duì)比在治療作用的條件下，AEE及前體藥物的濃度均為32 μmol/L，各細(xì)胞因子的生成量見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示，AEE治療后，細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的量均低于ASP、EUG和ASP+EUG(1∶1)(P<0.05)，表明AEE的治療效果優(yōu)于其前體藥物。

與空白對(duì)照組相比***P<0.001,**P<0.01，*P<0.05；與LPS組相比###P<0.001，##P<0.01

3 討論

炎癥是機(jī)體的正常防御活動(dòng)，是先天免疫系統(tǒng)針對(duì)組織損傷、感染或刺激做出的復(fù)雜生物反應(yīng)[21]。然而，過(guò)度和不受控制的炎癥反應(yīng)可能會(huì)對(duì)身體造成損害。腸上皮細(xì)胞(IEC)被認(rèn)為是腸黏膜屏障的重要組成部分，IEC的物理屏障在腸道炎癥期間起著重要作用，可有效防止病原體進(jìn)入，并通過(guò)分泌多種炎癥介質(zhì)積極參與先天性和獲得性免疫反應(yīng)[22-23]。

多項(xiàng)研究證明，Caco-2細(xì)胞適用于腸道炎癥的相關(guān)研究，通過(guò)相關(guān)細(xì)胞因子或LPS誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞的炎癥模型是最常用的體外腸道炎癥模型[24-25]。促炎細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)腸道免疫中起到重要作用，其中，IL-1β、TNF-α和IL-6異常被視為IBD的重要發(fā)病機(jī)制。IL-1β是炎癥反應(yīng)的重要因子，并參與多種細(xì)胞活動(dòng)，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡。TNF-α是由157個(gè)氨基酸組成的肽類(lèi)促炎因子，相對(duì)分子質(zhì)量為17 kDa[26]，主要作用是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。IL-6是由184個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為26 kDa的糖蛋白[27]，是一種重要的促炎細(xì)胞因子，其表達(dá)主要受到IL-1β和TNF-α的誘導(dǎo)。因此，本試驗(yàn)采用LPS誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞炎癥模型來(lái)模擬腸炎的發(fā)生，通過(guò)對(duì)IL-1β、TNF-α和IL-6產(chǎn)生的影響，反映Caco-2細(xì)胞炎癥模型造模是否成功。通常IL-1β、TNF-α和IL-6的分泌量顯著上升，說(shuō)明造模成功[28- 29]。

響應(yīng)面法是優(yōu)化造模條件的常用方法，其使用特定點(diǎn)的函數(shù)值，用多項(xiàng)式表達(dá)來(lái)逼近極限狀態(tài)函數(shù)，與正交試驗(yàn)相比，更加接近最優(yōu)值[30]。因此，本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化LPS誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞炎癥模型的作用濃度與時(shí)間。據(jù)此確定的最佳條件為L(zhǎng)PS質(zhì)量濃度100 mg/L、作用時(shí)間24 h，此結(jié)果與吳喜喜等[24]結(jié)果一致。當(dāng)LPS質(zhì)量濃度為100 mg/L，作用Caco-2細(xì)胞24 h后，LPS組的IL-1β、TNF-α和IL-6水平顯著高于空白對(duì)照組(P<0.001)。結(jié)果顯示，Caco-2細(xì)胞炎癥模型誘導(dǎo)成功。

大鼠體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果已表明，AEE可以顯著降低與炎癥形成相關(guān)的5種關(guān)鍵內(nèi)源性生物活性酶(環(huán)氧合酶-1、環(huán)氧合酶-2、C-反應(yīng)蛋白、凝血酶原和花生四烯酸 5-脂肪氧化酶)的活性[31]。然而，AEE對(duì)損傷條件下IEC炎癥反應(yīng)的影響尚不清楚。因此，本試驗(yàn)首次通過(guò)LPS誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞形成炎癥模型來(lái)探討AEE防治腸炎的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AEE治療Caco-2細(xì)胞炎癥模型后，IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌水平均顯著地下降(P<0.05)，這類(lèi)似于多種中藥單體抗炎作用，例如，槲皮素[32]、木犀草素[33]和枸杞多糖[34]。AEE治療Caco-2細(xì)胞炎癥模型后IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌量顯著低于前體藥物ASP、EUG和ASP+EUG(1∶1)的治療(P<0.05)，說(shuō)明AEE治療Caco-2細(xì)胞炎癥模型的效果優(yōu)于前體藥物ASP、EUG和ASP+EUG(1∶1)，這可能與EUG對(duì)ASP進(jìn)行酯化修飾后二者發(fā)揮協(xié)同作用或產(chǎn)生了新的作用機(jī)制有關(guān)。

研究表明，NF-κB信號(hào)通路激活I(lǐng)EC產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子[35]。NF-κB是一種在炎癥、細(xì)胞分化和惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和存活中具有關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞外來(lái)刺激的反應(yīng)[36-37]。在正常狀態(tài)下，NF-κB通常通過(guò)與IκB蛋白結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)中沒(méi)有活性。但當(dāng)受到外源性刺激物(例如IL-1β、TNF-α、LPS和細(xì)菌等)刺激時(shí)，NF-κB被激活并與IκB分離。然后NF-κB被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，調(diào)節(jié)許多與炎癥相關(guān)基因的表達(dá)[38]，包括 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和IL-12。大量研究表明，NF-κB通路在IBD的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用[39-40]。TNF-α、IL-1β和IL-6分泌異常被視為IBD的重要發(fā)病機(jī)制，抑制這些促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生是評(píng)估抗炎藥療效的關(guān)鍵因素[41]。AEE可顯著地降低Caco-2細(xì)胞炎癥模型中的TNF-α、IL-1β和IL-6分泌量，說(shuō)明AEE可能也是通過(guò)抑制NF-κB通路達(dá)到治療腸炎的效果。

綜上所述，AEE作用于Caco-2細(xì)胞炎癥模型時(shí)，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。AEE可顯著減少I(mǎi)L-1β、TNF-α和IL-6細(xì)胞因子的表達(dá)與分泌，緩解炎癥反應(yīng)，且AEE的治療效果要顯著優(yōu)于其前體化合物；AEE對(duì)Caco-2細(xì)胞炎癥模型的治療作用優(yōu)于預(yù)防和保護(hù)作用，具體抗炎機(jī)制有待進(jìn)一步研究。