孫雨昕，溫 冉，宮英闌，包佳鷺，張偉偉，趙俊芳，王曉丹,3*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 中獸醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北象大合眾生物科技有限公司，河北 正定 050800;3.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071000)

代森錳鋅(mancozeb，MCZ)屬于二硫代氨基甲酸乙二醇酯(EBDC)類農(nóng)藥，是一種乙烯-二硫代氨基甲酸錳和鋅鹽的混合物，因其低毒性、短期環(huán)境持久性的特點(diǎn)[1]，自1948年以來一直在多種農(nóng)作物、觀賞植物上作為常用的廣譜殺菌劑使用[2]。MCZ因其殺菌譜廣、作用位點(diǎn)多、無抗藥性、能為植物補(bǔ)充微量元素鋅的特性，從而提高農(nóng)作物的免疫力，改善農(nóng)作物的品質(zhì)，因此被廣泛用于防治蔬菜和果樹等作物中真菌引起的多種病害[3]。然而MCZ及其代謝產(chǎn)物乙撐硫脲[4]可以在對人體有致畸、致癌、影響胚胎著床[5]作用，又在土壤中持久存在，在水中迅速分解，具有高危害潛力，引起了外界的關(guān)注。

近年來，對在實(shí)驗(yàn)動物中產(chǎn)生的MCZ毒性的研究表明，MCZ的EBDC部分導(dǎo)致大鼠肝臟和腎臟中谷胱甘肽狀態(tài)和必需金屬銅穩(wěn)態(tài)改變[6]。有研究發(fā)現(xiàn)MCZ對實(shí)驗(yàn)動物的毒性與生殖毒性、神經(jīng)毒性、內(nèi)分泌干擾[7]以及睡眠障礙[8]等有關(guān)，對人類也有一定的致癌性[9]。國內(nèi)有研究表明，甘草多糖(Glycyrrhizapolysaccharide，GP)對于緩解MCZ毒性的效果較好[10]，如誘導(dǎo)細(xì)胞生成活性氧(ROS)[11]，增強(qiáng)雞免疫球蛋白IgA和IgG水平[12]、減少肝臟中IL-1β和IFN-γ的升高[13]等提高毒性抵抗力。在MCZ帶來的潛在危害中，農(nóng)業(yè)和工業(yè)工人是發(fā)生MCZ中毒的高風(fēng)險人群，對一般人群也有一定危害性。為此，本試驗(yàn)初步探索妊娠期暴露MCZ對其子代45日齡仔鼠腎臟損傷及GP對妊娠期暴露MCZ誘導(dǎo)子代小鼠腎臟損傷的影響，為人類及動物的健康成長提供相應(yīng)的幫助，為中藥的治療作用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑MCZ(商品級Dithane-M45，80%)、GP(30%)購自西安圣青生物科技有限公司； EastepTMSuper 總RNA 提取試劑盒(LS1040)購自Promega公司；HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) 南京諾唯贊生物科技股份有限公司(R323-01)；TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)購自 TaKaRa公司 (RR820A)；總蛋白定量、總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；谷胱甘肽過氧化酶4(GPX4)、鐵死亡抑制蛋白 1 (FSP1)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理方法分別選用50只雌性、10只雄性7周齡SPF級昆明小鼠，購自斯貝福實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司，常規(guī)雌、雄分籠飼養(yǎng)，自由飲水，1周后合籠飼養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)雌鼠陰栓當(dāng)日定為孕0 d 并換籠單獨(dú)飼養(yǎng)。將50只孕鼠隨機(jī)分為空白對照組(K組)、MCZ對照組(M組)、GP低(D組)、中(Z組)、高(G組)劑量組，每組10只。空白對照組早晚各灌服1次0.1 mL生理鹽水；MCZ對照組每天早上灌服150 mg/kg的MCZ，晚上灌服0.1 mL生理鹽水；GP低(D組)、中(Z組)、高(G組)劑量組早上灌服150 mg/kg的MCZ、晚上分別灌服50，100，200 mg/kg的GP，所有孕鼠單獨(dú)喂養(yǎng)，產(chǎn)后與仔鼠同窩喂養(yǎng)，仔鼠21 d時斷奶，泌乳期不飼喂母鼠MCZ。本試驗(yàn)動物處理過程通過河北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的動物倫理學(xué)審查。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1仔鼠體質(zhì)量及腎臟指數(shù)測定 稱取45日齡仔鼠體質(zhì)量，斷頸處死后摘取腎臟組織，記錄不同組仔鼠腎臟質(zhì)量。腎臟指數(shù)=腎臟質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%。

1.3.2仔鼠腎臟組織形態(tài)觀察 將仔鼠腎臟置于4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)制備石蠟切片，厚度為5 μm，常規(guī)HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察仔鼠腎臟組織形態(tài)變化。

1.3.3仔鼠血清中尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)含量測定 仔鼠血液3 000 r/min離心，取上清，分裝，-20℃ 保存待測。取上清液分別用BUN、Cr試劑盒測定仔鼠血清中BUN和Cr含量。

1.3.4仔鼠腎臟組織勻漿中T-AOC、GSH-Px、SOD、MDA含量測定 取仔鼠腎臟按試劑盒說明書制備10%組織勻漿，提取其上清液，分裝，-20℃保存待測。取組織勻漿上清液，按照說明書分別用T-AOC、GSH-Px、SOD、MDA試劑盒測定腎臟組織中T-AOC、GSH-Px、SOD、MDA含量。

1.3.5仔鼠腎臟組織勻漿中GPX4、FSP1、TGF-β1含量測定 取仔鼠腎臟按ELISA試劑盒說明書制備10%組織勻漿，提取其上清液，分裝，-20℃保存待測。取10%組織勻漿上清液，按照說明書分別用ELISA試劑盒測定腎臟組織勻漿中GPX4、FSP1、TGF-β1的含量。

1.3.6仔鼠腎臟組織中GPX4、NADPH氧化酶4(NOX4)、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(NF-κB)p65 mRNA轉(zhuǎn)錄水平測定 用總RNA提取試劑盒提取仔鼠腎臟中總RNA，再用反轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃保存。采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測目的基因GPX4、NOX4、NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平，引物由大連寶生物有限公司設(shè)計合成(表1)。反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，39個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，用2-△△Ct表示目的基因的相對表達(dá)量。

表1 引物信息

1.4 數(shù)據(jù)分析應(yīng)用Excle整合數(shù)據(jù)，SPSS進(jìn)行單因素方差分析，Graphpad Prism 9.0繪圖，差異比較通過One-Way ANOVA評估，*表示MCZ對照組與空白對照組相比，#代表GP組與MCZ對照組相比，*/#P<0.05表示為差異顯著，**/##P<0.01表示為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 對45日齡仔鼠腎臟組織形態(tài)的影響HE染色結(jié)果顯示，空白對照組，腎小球大小正常，周圍界限清晰，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，管腔大小正常；MCZ組腎小囊囊腔變小，周圍界限不清晰，腎小管上皮細(xì)胞部分脫落，腎小管腔里充有均質(zhì)紅染的不等量蛋白性物質(zhì)，管腔堵塞；與MCZ組相比，GP組腎小球形狀較正常，腎小囊囊腔結(jié)構(gòu)較清晰，管腔大小較正常(圖1)。

A.空白對照組；B.MCZ對照組；C.GP低劑量組；D.GP中劑量組；E.GP高劑量組。紅色箭頭.腎小囊囊腔變小，周圍界限不清晰；綠色箭頭.腎小管腔里充有均質(zhì)紅染的不等量蛋白性物質(zhì)；黑色箭頭.腎小管上皮細(xì)胞部分脫落

2.2 對45日齡仔鼠體質(zhì)量及腎臟指數(shù)的影響如圖2所示，在體質(zhì)量方面，MCZ組與空白對照組相比下降，且差異極顯著(P<0.01)，用GP與MCZ聯(lián)合處理后差異不顯著；在腎臟指數(shù)方面，MCZ組與空白對照組相比上升，且差異顯著(P<0.05)，用GP與MCZ聯(lián)合處理后均低于MCZ組，且高劑量組差異極顯著(P<0.01)。

圖2 GP對妊娠期暴露MCZ的45日齡仔鼠體質(zhì)量和腎臟指數(shù)的影響

2.3 對45日齡仔鼠血清中Cr、BUN的影響如圖3所示，在Cr方面，MCZ組與空白對照組相比上升，且差異極顯著(P<0.01)，用GP與MCZ聯(lián)合處理后均低于MCZ組，且中、高劑量組差異極顯著(P<0.01)；在BUN方面，MCZ組與空白對照組相比上升，且差異顯著(P<0.05)，用GP與MCZ聯(lián)合處理后均低于MCZ組，且低、中、高劑量組差異均極顯著(P<0.01)。

圖3 GP對妊娠期暴露MCZ的45日齡仔鼠Cr和BUN的影響

2.4 對45日齡仔鼠腎臟組織中T-AOC、MDA、SOD、GSH-Px水平的影響如圖4所示，在T-AOC方面，MCZ組與空白對照組相比下降，且差異顯著(P<0.05)，用GP與MCZ聯(lián)合處理后均高于MCZ組，且高劑量組差異極顯著(P<0.01)；在MDA方面，MCZ組與空白對照組相比上升，且差異極顯著(P<0.01)，用GP與MCZ聯(lián)合處理后均低于MCZ組，且中、高劑量組差異極顯著(P<0.01)；在SOD方面，MCZ組與空白對照組相比差異不顯著，用GP與MCZ聯(lián)合處理后均高于MCZ組，且高劑量組差異極顯著(P<0.01)；在GSH-Px方面，MCZ組與空白對照組相比差異不顯著，用GP與MCZ聯(lián)合處理后均高于MCZ組，且低劑量組差異顯著(P<0.05)。

圖4 GP對妊娠期暴露MCZ的45日齡仔鼠T-AOC、MDA、SOD、GSH-Px水平的影響

2.5 對45日齡仔鼠腎臟組織中GPX4、FSP1、TGF-β1的影響如圖5所示，在GPX4方面，MCZ組與空白對照組相比差異不顯著，用GP與MCZ聯(lián)合處理后均高于MCZ組，且中劑量組差異顯著(P<0.05)；在FSP1方面，MCZ組與空白對照組相比下降，且差異顯著(P<0.05)，用GP與MCZ聯(lián)合處理后均高于MCZ組，且低、中劑量組差異極顯著(P<0.01)；在TGF-β1方面，MCZ組與空白對照組相比上升，且差異顯著(P<0.05)，用GP與MCZ聯(lián)合處理后均低于MCZ組，且高劑量組差異顯著(P<0.05)。

2.6 對45日齡仔鼠腎組織中GPX4、NOX4、NF-κB p65 mRNA相對表達(dá)量的影響如圖6所示，在GPX4 mRNA相對表達(dá)量方面，MCZ組與空白對照組相比差異不顯著，用GP與MCZ聯(lián)合處理后均高于MCZ組，且低、高劑量組差異極顯著(P<0.01)；在NF-κB p65 mRNA相對表達(dá)量方面，MCZ組與空白對照組相比差異不顯著，用GP與MCZ聯(lián)合處理后，中劑量組差異顯著(P<0.05)；在NOX4 mRNA相對表達(dá)量方面，MCZ組與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)，用GP與MCZ聯(lián)合處理后均低于MCZ組，且中劑量組差異極顯著(P<0.01)，高劑量組差異顯著(P<0.05)。

圖6 GP對妊娠期暴露MCZ的45日齡仔鼠GPX4、NOX4、NF-κB p65 mRNA相對表達(dá)量的影響

3 討論

MCZ對雌性生殖器官的特異性作用機(jī)制尚不完全清楚，但體內(nèi)試驗(yàn)研究表明，該殺菌劑會損害小鼠胚胎發(fā)育和減數(shù)分裂紡錘體組裝[14]，MCZ可能在細(xì)胞水平上間接干擾或損害生殖，并應(yīng)視為生殖毒物，這一點(diǎn)具有高度至中度的可信度[15]，除影響本代接觸者的健康外，MCZ還能通過血-胎盤和血-乳屏障[16]影響到子代的健康。MCZ帶來的生殖毒性在卵巢功能方面表現(xiàn)為通過抑制顆粒細(xì)胞活力，減少卵丘擴(kuò)張，抑制中期板形成，誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞分泌孕酮，可能抑制排卵過程中的垂體激增過程來實(shí)現(xiàn)[7]，在子宮方面表現(xiàn)為通過調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的基因表達(dá)譜和降低雌激素受體β和整合素β3的表達(dá)來減少球體附著[17]，調(diào)節(jié)蛻膜化而影響胚胎著床，并需要進(jìn)一步研究確切的作用模式[18]，在中醫(yī)理論中腎臟與生殖息息相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，GP可以抑制MCZ處理后小鼠體質(zhì)量的下降和腎指數(shù)的上升。

腎臟損傷引起體內(nèi)的氧化與抗氧化過程失衡造成氧化應(yīng)激狀態(tài)，且腎臟對氧化應(yīng)激高度敏感[19]。血清里的Cr[20]、BUN水平作為高效的腎功能生物標(biāo)志物，被廣泛的用于腎病的診斷與評價。對于母胎，氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化和DNA損傷等可能會造成自然流產(chǎn)[21]等，對體內(nèi)的胚胎也會產(chǎn)生毒性，造成出生體質(zhì)量降低、免疫低下等狀態(tài)[22]。氧化應(yīng)激狀態(tài)時一方面刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的ROS，引起機(jī)體的ROS積累，組織脂質(zhì)過氧化程度升高，MDA水平升高[23]，損傷腎臟細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞凋亡、腎臟纖維化、炎癥[24]等；另一方面機(jī)體清除自由基的能力下降，表現(xiàn)為T-AOC、SOD、GSH-Px活性下降。T-AOC體現(xiàn)機(jī)體各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成總抗氧化水平；SOD可以及時修復(fù)受損細(xì)胞[25]，將超氧化物自由基轉(zhuǎn)化成過氧化氫和氧分子達(dá)到清除自由基的效果[26]，所以SOD活性可以間接體現(xiàn)機(jī)體清除自由基的能力；谷胱甘肽是一種主要的抗氧化劑，可以直接清除自由基，機(jī)體產(chǎn)生的過量的過氧化氫可以被GSH-Px代謝成水分子[27]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，GP可以抑制MCZ導(dǎo)致的Cr、BUN和 MDA水平的升高，抑制T-AOC、SOD、GSH-Px活性的下降，降低腎臟損傷和脂質(zhì)過氧化程度。

鐵死亡有3種主要調(diào)節(jié)機(jī)制：脂質(zhì)過氧化、鐵離子蓄積和氨基酸代謝紊亂。GPX4和FSP1[28]共同構(gòu)成鐵死亡防御系統(tǒng)[29]，ROS等的存在會促進(jìn)鐵死亡的發(fā)展。研究表明，GPX4能降解部分脂質(zhì)過氧化物，從而抑制脂質(zhì)過氧化過程，如果上調(diào)了GPX4的表達(dá)會使機(jī)體對鐵死亡更加不敏感[30]。除此之外，誘導(dǎo)機(jī)體鐵死亡時會導(dǎo)致體內(nèi)ROS升高，促進(jìn)脂質(zhì)過氧化。本試驗(yàn)結(jié)果表明，GP可以抑制MCZ帶來的GPX4、FSP1水平的降低，增加機(jī)體對鐵死亡的耐受性。

TGF-β1參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、組織纖維化[31]、腫瘤和免疫等過程的雙向調(diào)節(jié)因子，廣泛參與體內(nèi)各種病理生理過程，在腫瘤細(xì)胞中，早期抑制細(xì)胞增殖從而達(dá)到抗腫瘤作用，在晚期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以達(dá)到抗腫瘤作用[32]，TGF-β1在炎性環(huán)境中發(fā)揮抗炎作用，而TGF-β1的過度生產(chǎn)則又會導(dǎo)致急性腎小管損傷；NOX4是NADPH氧化酶，其主要在腎臟組織表達(dá)，催化氧生成ROS，對ROS含量敏感[33]；NF-κB作為核轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控多種與炎癥、抗凋亡和腫瘤等有關(guān)的基因表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，GP在仔鼠45日齡時抑制TGF-β1水平，另外，GP還抑制MCZ導(dǎo)致的NOX4、NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄水平的升高，從而降低腎臟氧化應(yīng)激程度。

綜上所述，GP通過提高45日齡仔鼠的抗氧化能力和對鐵死亡的耐受力而減輕腎臟損傷對機(jī)體帶來的影響，GP低、中、高劑量均對MCZ誘導(dǎo)的45日齡仔鼠的腎臟損傷有一定的抑制效果，其中以中劑量的GP(100 mg/kg)對45日齡仔鼠腎臟的保護(hù)作用最為明顯。