行倩文，吳 華，劉嘉華，劉 波，張龍飛，陳鑫磊，王文勝

(青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016)

氧氣為動(dòng)物機(jī)體所必需的物質(zhì)，參與ATP合成，為維持動(dòng)物機(jī)體正常生命活動(dòng)及新陳代謝過(guò)程提供能量[1]。低氧適應(yīng)是動(dòng)物機(jī)體克服低氧，在低氧適應(yīng)環(huán)境中最大程度的從體內(nèi)和外界的環(huán)境中充分?jǐn)z取并能夠充分利用低氧環(huán)境空氣中的水分和氧氣，保證正常的機(jī)體自然生理功能的正常進(jìn)行[2]。

菊苣酸(chicoric acid，CA)是一種天然酚類化合物，在植物中的分布比較廣，主要存在于紫錐菊、菊苣等天然植物中[3]，具有抗氧化及清除自由基、抗炎、提高免疫力等作用[4]。本課題組前期研究表明，CA可加強(qiáng)放牧牦牛對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝，提高低氧條件下放牧牦牛線粒體活性，增強(qiáng)牦牛高海拔低氧適應(yīng)性[5]。吳華等[6]研究發(fā)現(xiàn)添加CA能對(duì)牦牛機(jī)體適應(yīng)高海拔、低氧環(huán)境，提高免疫力和抵抗炎性反應(yīng)具有積極作用。

低氧是臨床許多疾病共同的病理生理因素，長(zhǎng)期慢性低氧對(duì)機(jī)體的損害是多方位的，其對(duì)機(jī)體的危害逐漸引起人們的重視。研究發(fā)現(xiàn)慢性低氧時(shí)機(jī)體可表現(xiàn)為脂肪代謝異常。然而，目前關(guān)于低氧環(huán)境下CA對(duì)SD大鼠脂肪組織抗氧化能力、炎性及能量代謝影響的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?；诖?，本試驗(yàn)擬在低氧環(huán)境下對(duì)SD大鼠飼喂不同濃度的CA，研究CA對(duì)于SD大鼠不同部位脂肪組織抗氧化能力、炎性及能量代謝水平的影響。以期為CA作為高海拔地區(qū)治療炎癥、提高抗氧化能力和作為維持能量代謝的飼料添加劑應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)的開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料CA提取物購(gòu)自西安銳博生物科技有限公司，為黃綠色精細(xì)粉末,成分：CA含量4%，其中CA(2.0%～2.2%)+咖啡酸(1.0%～1.5%)+綠原酸(0.5%～1.0%)+紫錐菊甙(0.3%～0.5%)；超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒、超微量Ca2+-ATP酶測(cè)試盒、超微量Na+K+-ATP酶測(cè)試盒、總蛋白(TP)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；大鼠白細(xì)胞介素-6(IL-6)測(cè)定試劑盒、大鼠白細(xì)胞介素-10(IL-10)測(cè)定試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)測(cè)定試劑盒、脂聯(lián)素(ADP)、干擾素-γ(IFN-γ)購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取60只健康雄性SD大鼠(6～8周齡，170～220 g)購(gòu)自青海喜馬拉雅動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心有限公司(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(陜)2018-001)，試驗(yàn)大鼠于青海省河南蒙古族自治縣畜牧獸醫(yī)工作站(海拔3 500 m，氧濃度13.65%[7])進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.3 試驗(yàn)分組與處理將60只大鼠于室溫(21±2)℃、正常光照周期條件下進(jìn)行飼養(yǎng)。將大鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為4組(P>0.05)，每組15只。預(yù)飼2 周后，進(jìn)行正式試驗(yàn)。第1組為對(duì)照組，每天上午9:00灌胃0.5 mL生理鹽水，第2,3,4 組根據(jù)大鼠體質(zhì)量分別灌胃0.5 mL含10，20，40 mg/kg CA的生理鹽水。4組大鼠均自由采食和飲水。連續(xù)灌胃49 d后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4 樣品采集飼養(yǎng)結(jié)束后，禁食24 h，每組大鼠分別隨機(jī)抽取6只，用10%水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉。采集肝臟、皮下脂肪和附睪脂肪組織，分別放入2 mL凍存管，迅速置于液氮中，后移置-80℃保存，待測(cè)。

1.5 抗氧化能力指標(biāo)、炎性因子含量及能量代謝水平指標(biāo)的測(cè)定取SD大鼠肝臟、皮下脂肪和附睪脂肪組織，按每克待測(cè)組織加入9 mL生理鹽水的比例處理，然后使用超聲細(xì)胞破碎儀在冰水浴條件下制備勻漿，4℃、2 500 r/min離心10 min，取上清液分裝，4℃保存，隨后參照ELISA試劑盒說(shuō)明測(cè)定抗氧化能力指標(biāo)、炎性因子含量、能量代謝水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析經(jīng)Excel初步處理數(shù)據(jù)后，采用統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS 23.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果采用Duncan's法進(jìn)行多重比較，GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 低氧環(huán)境下CA對(duì)SD大鼠抗氧化能力的影響如圖1所示，肝臟組織：與對(duì)照組相比，10，20，40 mg/kg組CAT含量顯著升高(P<0.05)，MDA含量極顯著降低(P<0.01)，20，40 mg/kg組GSH-Px含量極顯著升高(P<0.01)，SOD含量極顯著升高(P<0.01)；與10 mg/kg組相比，20，40 mg/kg組GSH-Px含量極顯著升高(P<0.01)，20 mg/kg組SOD含量極顯著升高(P<0.01)，40 mg/kg組SOD含量顯著升高(P<0.05)；與20 mg/kg組相比，40 mg/kg組CAT含量極顯著升高(P<0.01)；其余各組間差異不顯著(P>0.05)。皮下脂肪組織：與對(duì)照組相比，10 mg/kg組CAT含量顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)，20，40 mg/kg 組CAT、GSH-Px含量極顯著升高(P<0.01)，MDA含量極顯著降低(P<0.01)，10，20，40 mg/kg 組SOD含量極顯著升高(P<0.01)；與10 mg/kg組相比，20，40 mg/kg組CAT含量顯著升高(P<0.05)，GSH-Px含量極顯著升高(P<0.01)，MDA含量顯著降低(P<0.05)；與20 mg/kg組相比，40 mg/kg組CAT、SOD含量顯著升高(P<0.05)；其余各組間差異不顯著(P>0.05)。附睪脂肪組織：與對(duì)照組相比，10，20，40 mg/kg組GSH-Px、SOD含量極顯著升高(P<0.01)，10 mg/kg組MDA含量顯著降低(P<0.05)，20，40 mg/kg組CAT含量極顯著升高(P<0.01)，MDA含量極顯著降低(P<0.01)；與10 mg/kg組相比，20，40 mg/kg 組GSH-Px、SOD含量極顯著升高(P<0.01)，40 mg/kg組CAT含量極顯著升高(P<0.01)，MDA含量顯著降低(P<0.05)；與20 mg/kg相比，40 mg/kg組CAT含量極顯著升高(P<0.01)，40 mg/kg組MDA含量顯著降低(P<0.05)；其余各組間差異不顯著(P>0.05)。

不同小寫(xiě)字母表示 P<0.05，不同大寫(xiě)字母表示 P<0.01。下同

2.2 低氧環(huán)境下CA對(duì)SD大鼠炎性因子的影響如圖2所示，肝臟組織：與對(duì)照組相比，10，20，40 mg/kg 組IL-10含量極顯著升高(P<0.01)，IFN-γ含量極顯著降低(P<0.01)，20，40 mg/kg組TNF-α含量極顯著降低(P<0.01)，40 mg/kg組IL-6含量極顯著降低(P<0.01)；與10 mg/kg組相比，20，40 mg/kg組IL-10含量極顯著升高(P<0.01)，TNF-α含量極顯著降低(P<0.01)，40 mg/kg組IL-6、IFN-γ含量極顯著降低(P<0.01)；與20 mg/kg 組相比，TNF-α、IL-6、IFN-γ含量極顯著降低(P<0.01)；其余組間差異不顯著(P>0.05)。皮下脂肪組織：與對(duì)照組相比，10，20，40 mg/kg組IL-10含量極顯著升高(P<0.01)，TNF-α、IL-6含量極顯著降低(P<0.01)，10 mg/kg組IFN-γ含量顯著降低(P<0.05)，20，40 mg/kg組IFN-γ含量極顯著降低(P<0.01)；與10 mg/kg組相比，40 mg/kg 組IL-10含量極顯著升高(P<0.01)，20，40 mg/kg組TNF-α、IL-6、IFN-γ含量極顯著降低(P<0.01)；與20 mg/kg組相比，40 mg/kg組IFN-γ含量顯著降低(P<0.05)；其余組間差異不顯著(P>0.05)。附睪脂肪組織：與對(duì)照組相比，10，20，40 mg/kg組IL-10含量極顯著升高(P<0.01)，40 mg/kg 組TNF-α含量顯著降低(P<0.05)，20，40 mg/kg組IL-6、IFN-γ含量極顯著降低(P<0.01)；與10 mg/kg組相比，20 mg/kg組IFN-γ含量極顯著降低(P<0.01)，40 mg/kg組TNF-α、IFN-γ含量顯著降低(P<0.05)；與20 mg/kg組相比，40 mg/kg組TNF-α含量顯著降低(P<0.05)；其余組間差異不顯著(P>0.05)。

圖2 低氧環(huán)境下CA對(duì)SD大鼠炎性因子的影響

2.3 低氧環(huán)境下CA對(duì)SD大鼠能量代謝水平的影響如圖3所示，肝臟組織：與對(duì)照組相比，40 mg/kg組Ca2+-ATP酶含量極顯著升高(P<0.01)，20，40 mg/kg組Na+K+-ATP酶、ADP含量極顯著升高(P<0.01)；與10 mg/kg組相比，40 mg/kg組Ca2+-ATP酶含量極顯著升高(P<0.01)，20，40 mg/kg 組Na+K+-ATP酶、ADP含量極顯著升高(P<0.01)；與20 mg/kg組相比，40 mg/kg組Ca2+-ATP酶、ADP含量極顯著升高(P<0.01)；其余組間差異不顯著(P>0.05)。皮下脂肪組織：與對(duì)照組相比，40 mg/kg組Ca2+-ATP酶含量極顯著升高(P<0.01)，Na+K+-ATP酶含量顯著升高(P<0.05)，10，40 mg/kg組ADP含量顯著升高(P<0.05)，20 mg/kg組ADP含量極顯著升高(P<0.01)；與10 mg/kg組相比，40 mg/kg組Ca2+-ATP酶含量極顯著升高(P<0.01)，Na+K+-ATP酶含量顯著升高(P<0.05)，20 mg/kg組ADP含量極顯著升高(P<0.01);與20 mg/kg組相比，40 mg/kg 組Ca2+-ATP酶含量極顯著升高(P<0.01)，Na+K+-ATP酶含量顯著升高(P<0.05);其余組間差異不顯著(P>0.05)。附睪脂肪組織：與對(duì)照組相比，10，20，40 mg/kg組Ca2+-ATP酶含量極顯著升高(P<0.01)，20，40 mg/kg組Na+K+-ATP酶、ADP含量極顯著升高(P<0.01)；與10 mg/kg 組相比，20，40 mg/kg組ADP含量極顯著升高(P<0.01);其余組間差異不顯著(P>0.05)。

圖3 低氧環(huán)境下CA對(duì)SD大鼠能量代謝水平的影響

3 討論

氧氣作為生命之源，維持動(dòng)物機(jī)體正常生命活動(dòng)及新陳代謝過(guò)程，在內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的作用。有研究表明海拔3 000 m以上的地區(qū)為高原低氧環(huán)境，地區(qū)氧濃度低于正常水平，對(duì)動(dòng)物機(jī)體的血液、呼吸系統(tǒng)造成嚴(yán)重的影響，甚至引起機(jī)體組織器官損傷[8]。

3.1 低氧環(huán)境下CA對(duì)SD大鼠脂肪組織抗氧化能力的影響正常情況下，體內(nèi)氧化體系與抗氧化體系維持著動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)機(jī)體在某種刺激的影響下，細(xì)胞內(nèi)活性氮簇、活性氧簇等高活性分子生成增多,使抗氧化和氧化機(jī)制之間的平衡狀態(tài)被打破，導(dǎo)致組織損傷[9]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化作用的主要產(chǎn)物之一，能夠反映脂質(zhì)過(guò)氧化作用的水平。SOD能清除超氧化自由基，防止細(xì)胞損傷，其活性可以直接反映細(xì)胞對(duì)氧自由基的清除能力，在維持組織細(xì)胞氧化和抗氧化平衡中起關(guān)鍵作用[10-11]。SOD和CAT是生物體應(yīng)對(duì)氧化損傷的重要抗氧化酶，SOD將生物自身代謝或外界脅迫下產(chǎn)生的一系列有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫，而CAT作為過(guò)氧化氫的清除劑，可將過(guò)氧化氫還原成氧分子和水[12]，從而維持細(xì)胞和機(jī)體的正常生理活動(dòng)。GSH-Px特異催化GSH對(duì)H2O2的還原反應(yīng)，起保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[13]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，低氧環(huán)境下對(duì)SD大鼠灌喂不同濃度的CA，與對(duì)照組相比，在肝臟、皮下脂肪、附睪脂肪組織中，20，40mg/kg組CAT、SOD、GSH-Px含量均顯著升高(P<0.05)，MDA含量均顯著降低(P<0.05)。不同試驗(yàn)組比較，20 mg/kg組肝臟組織GSH-Px含量均顯著增加(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)，皮下脂肪組織GSH-Px含量均顯著增加(P<0.05)，附睪脂肪組織SOD含量顯著增加(P<0.05)，20，40 mg/kg組肝臟組織CAT、SOD含量顯著增加(P<0.05)，皮下脂肪組織MDA含量顯著降低(P<0.05)，附睪脂肪組織GSH-Px含量顯著增加(P<0.05)，40 mg/kg皮下脂肪組織CAT、SOD含量均顯著增加(P<0.05)，附睪脂肪組織CAT含量顯著增加(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)。說(shuō)明低氧環(huán)境下，CA通過(guò)清除SD大鼠脂肪組織超氧化自由基，加快過(guò)氧化氫還原成氧分子和水，降低脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)脂肪組織的損傷，提高SD大鼠肝臟、皮下脂肪、附睪脂肪組織抗氧化能力，進(jìn)而維持低氧環(huán)境下SD大鼠體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡，且40 mg/kg組作用效果最好。

3.2 低氧環(huán)境下CA對(duì)SD大鼠脂肪組織炎性因子的影響低氧可以誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)，分泌大量炎癥因子，如促炎因子TNF-α、IL-6及抑炎因子IL-10等。其中IL-6是重要的促炎因子，其由巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生[14]，是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子，是機(jī)體發(fā)生感染的重要指標(biāo)[15]。TNF-α是機(jī)體炎癥反應(yīng)的起始因子，是激活細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)的主要介質(zhì)，一旦釋放很快引起次級(jí)因子IL-6的大量產(chǎn)生[16-17]。IL-10主要由輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)2細(xì)胞產(chǎn)生，介導(dǎo)調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡[18]，抑制促炎因子合成釋放，促炎因子與抑炎因子相互作用，維持體內(nèi)炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)平衡[19]。IFN-γ同TNF-α是炎癥反應(yīng)激活的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[20]。低氧刺激下，IFN-γ和TNF-α可以激活細(xì)胞質(zhì)中的NF-κB復(fù)合物易位至細(xì)胞核，并參與眾多促炎基因的表達(dá)[21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，在肝臟、皮下脂肪、附睪脂肪組織中，不同CA濃度組均顯著升高IL-10含量(P<0.05)；20，40 mg/kg 組均顯著降低IL-6、TNF-α、IFN-γ含量(P<0.05)。不同試驗(yàn)組比較，20，40 mg/kg組肝臟組織IL-10含量顯著增加(P<0.05)，皮下脂肪組織TNF-α、IL-6含量顯著降低(P<0.05)，附睪脂肪組織IL-6、IFN-γ含量顯著降低(P<0.05)；40 mg/kg組肝臟組織TNF-α、IL-6、IFN-γ含量顯著降低(P<0.05)，皮下脂肪組織IL-10含量顯著增加(P<0.05)，IFN-γ含量顯著降低(P<0.05)，附睪脂肪組織IL-10含量顯著增加(P<0.05)，TNF-α含量顯著降低(P<0.05)。說(shuō)明低氧環(huán)境下，CA通過(guò)增加SD大鼠脂肪組織抑炎因子IL-10含量，降低促炎因子TNF-α、IL-6含量和IFN-γ表達(dá)量，提高SD大鼠肝臟、皮下脂肪、附睪脂肪抗炎能力，保護(hù)SD大鼠肝臟、皮下脂肪、附睪脂肪組織因低氧而造成的炎性反應(yīng)，且40 mg/kg組作用效果最好。

3.3 低氧環(huán)境下CA對(duì)SD大鼠脂肪組織能量代謝的影響脂聯(lián)素(ADP)在細(xì)胞葡萄糖和脂肪酸等能量代謝過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，并參與細(xì)胞增殖肥大和免疫功能的調(diào)控[22]。其還在內(nèi)分泌、代謝和炎癥信號(hào)方面起作用，并控制能量的穩(wěn)態(tài)[23]。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶是細(xì)胞膜上重要的酶蛋白，這兩種蛋白酶基因起源相同，此外還有相似的結(jié)構(gòu)功能，能主動(dòng)將Ca2+、Na+運(yùn)送到細(xì)胞外，攝入K+。Na+-K+-ATP酶是將細(xì)胞膜內(nèi)Na+移到細(xì)胞外，同時(shí)將細(xì)胞外的K+移入膜內(nèi)，從而形成2種離子的分布不平衡；Ca2+-Mg2+-ATP酶的作用是將Mg2+移入胞內(nèi)，將Ca2+移到細(xì)胞外，維持內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定[24]。大鼠在低氧暴露環(huán)境訓(xùn)練，骨骼肌線粒體產(chǎn)生的大量氧自由基作用于線粒體膜引起膜脂質(zhì)過(guò)氧化，影響Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，導(dǎo)致其活性下降[25]。也有研究表明，急性低氧應(yīng)激使大鼠線粒體游離鈣濃度下降[26]，并使大鼠心肌線粒體Ca2+-Mg2+-ATP酶的活力較正常大鼠顯著降低[27]。線粒體內(nèi)Ca2+增加會(huì)激活線粒體脫氫酶和刺激線粒體呼吸，從而產(chǎn)生ATP以滿足能量的需求[28]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的鈣儲(chǔ)存庫(kù)，線粒體膜上的ATP酶是調(diào)節(jié)和維持細(xì)胞內(nèi)線粒體鈣穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素。Na+-Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是利用Na+-K+-ATP酶產(chǎn)生的電化學(xué)梯度作為能源。低氧可抑制線粒體的氧化磷酸化過(guò)程,使能量代謝發(fā)生障礙，同時(shí)線粒體攝鈣能力下降，導(dǎo)致胞質(zhì)中Ca2+濃度升高,最終引起心肌損傷[29]。線粒體內(nèi)Ca2+增加會(huì)激活線粒體脫氫酶和刺激線粒體呼吸,從而產(chǎn)生ATP以滿足能量的需求[28]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，在肝臟、皮下脂肪、附睪脂肪組織中20 mg/kg組均顯著升高ADP含量(P<0.05)，40 mg/kg組均顯著升高Na+K+-ATP 酶、Ca2+-ATP酶含量(P<0.05)。不同試驗(yàn)組間比較，20，40 mg/kg組肝臟組織Na+K+-ATP酶含量顯著增加(P<0.05)，皮下脂肪組織ADP含量顯著增加(P<0.05)，附睪脂肪組織Ca2+-ATP酶、Na+K+-ATP酶、ADP含量顯著增加(P<0.05)，40 mg/kg組肝臟組織Ca2+-ATP酶、ADP含量顯著增加(P<0.05)，皮下脂肪組織Ca2+-ATP酶、Na+K+-ATP酶含量顯著增加(P<0.05)。說(shuō)明低氧環(huán)境下，CA通過(guò)升高ADP的含量維持SD大鼠脂肪組織內(nèi)能量的穩(wěn)態(tài)，升高Na+K+-ATP 酶、Ca2+ATP 酶的含量，激活線粒體脫氫酶和刺激線粒體呼吸，產(chǎn)生較多的ATP以滿足能量的需求，促進(jìn)脂肪組織中線粒體的氧化磷酸化過(guò)程，使SD大鼠脂肪組織能量代謝恢復(fù)至正常水平，維持內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定。從而維持SD大鼠肝臟、皮下脂肪、附睪脂肪組織在低氧環(huán)境下的能量代謝平衡，且40 mg/kg組作用效果最好。

綜上所述，CA通過(guò)提高低氧環(huán)境下SD大鼠肝臟、皮下脂肪和附睪脂肪組織GSH-Px、CAT、SOD含量，降低MDA含量，增強(qiáng)其抗氧化能力，提高脂肪組織IL-10含量，降低IL-6、TNF-α、IFN-γ含量，抑制機(jī)體炎癥的發(fā)生以及升高脂肪組織Ca2+-ATP酶、Na+K+-ATP酶、ADP含量，加強(qiáng)其能量代謝水平，進(jìn)而提高SD大鼠低氧適應(yīng)能力，且以40 mg/kg組作用最佳。為CA作為高海拔地區(qū)治療炎癥、提高抗氧化能力和作為維持能量代謝的飼料添加劑應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)的開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。