王 靜,徐 鵬,王夢媛,孫 宇,孟令帥,李世杰,馬興紅*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省動(dòng)物細(xì)胞與遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 心肌缺血省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150001)

早期妊娠的質(zhì)量對(duì)妊娠晚期的事件和妊娠結(jié)局有重要影響。在小鼠早期妊娠中，最重要的事件包括胚胎著床和蛻膜化。胚胎著床是指具有著床能力的囊胚與處于接受態(tài)的子宮建立緊密聯(lián)系的過程[1]。在小鼠中，根據(jù)早期妊娠子宮對(duì)胚胎著床敏感性和類固醇激素需求的不同，可以將子宮的狀態(tài)分為3個(gè)主要時(shí)期：接受前期(妊娠1～3 d)、接受期(妊娠4 d)和非接受期(妊娠5 d以后)[2]。在小鼠中，卵巢分泌的甾類激素孕酮(P4)和雌激素(E2)通過結(jié)合各自的受體(P4受體：PR-A與PR-B；E2受體：ERα與ERβ)，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖和分化[3]。其中，ERα、PR-A是參與調(diào)節(jié)小鼠子宮接受態(tài)和著床的主要受體[4-5]。小鼠胚胎著床發(fā)生在妊娠第4天晚上22:00點(diǎn)左右。著床的胚胎進(jìn)一步刺激圍繞其周圍的基質(zhì)細(xì)胞分化為不同形態(tài)和功能的蛻膜細(xì)胞，此過程稱為蛻膜化。蛻膜提供給妊娠早期胚胎營養(yǎng)，限制胚胎過度侵入子宮，保護(hù)胚胎免于母體免疫攻擊[6]。

胚胎著床前后，子宮上皮細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞骨架重塑的過程，而維持上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性和免受外部壓力的蛋白可能參與妊娠過程。哺乳動(dòng)物胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞骨架由微絲、微管和中間絲構(gòu)成，每一種成分都具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能[7-8]。角蛋白是一種主要表達(dá)于上皮細(xì)胞的中間絲，作為細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)中的一員，參與細(xì)胞的分裂、遷移以及分化、凋亡等過程[9]，對(duì)維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性具有重要作用[10]。人類功能性角蛋白有54種，即28種Ⅰ型和26種Ⅱ型角蛋白。角蛋白19(Keratin19，Krt19)，相對(duì)分子質(zhì)量為40 kDa，屬于Ⅰ型角蛋白，其是腸、腎集合管、膽囊、間皮和分泌腺等上皮細(xì)胞中最具代表性的蛋白質(zhì)之一[11-12]，還作為多種癌癥的預(yù)后標(biāo)志物[13-14]。鑒于Krt19在正常和癌變的上皮細(xì)胞中均表達(dá)，參與細(xì)胞骨架的形成，而胚胎著床前后涉及子宮上皮細(xì)胞骨架的重塑，推測Krt19可能參與該過程的調(diào)節(jié)。

為了探索在小鼠早期妊娠子宮中Krt19的表達(dá)與調(diào)節(jié)，本研究利用原位雜交、免疫組織化學(xué)、Western blot、real-time PCR等技術(shù)，結(jié)合小鼠早期妊娠模型、激素處理模型、延遲著床與激活模型和人工誘導(dǎo)蛻膜化模型，研究了Krt19 mRNA以及蛋白在小鼠子宮中的表達(dá)情況。研究結(jié)果可為深入了解Krt19在胚胎著床及蛻膜化過程中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室所用的ICR品系小鼠(6～8周齡)購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司?？刂破滹曫B(yǎng)環(huán)境，室溫22℃，交替光照環(huán)境(12 h光照，12 h黑暗)，自由攝食及飲水。

1.2 主要試劑Krt19抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG購自Abclonal公司；GAPDH抗體購自Proteintech公司。

1.3 早期妊娠將健康性成熟的雄鼠與雌鼠按1∶2合籠，次日見栓并且陰道涂片發(fā)現(xiàn)精子的雌鼠記為妊娠第1天，分別在每日8:30完成妊娠1～8 d的小鼠子宮組織的收集。

1.4 類固醇激素處理切除健康性成熟雌鼠的雙側(cè)卵巢，恢復(fù)2周后皮下注射。對(duì)照組(Oil，Sigma)：芝麻油，0.1 mL/只；E2處理組(E2，Sigma)：100 ng E2，0.1 mL/只；P4處理組(P4，Sigma)：1 mg P4，0.1 mL/只；E2與P4共處理組(E2+P4)：(100 ng E2+1 mg P4)，0.1 mL/只。以上試劑均以芝麻油為溶劑進(jìn)行配制，24 h后取材。

1.5 延遲著床與激活妊娠4 d的雌鼠切除雙側(cè)卵巢，分別做以下處理。延遲著床：妊娠5～7 d注射1 mg P4，0.1 mL/只，8 d取材。激活：7 d，皮下注射(25 ng E2+1 mg P4)，0.1 mL/只，終止延遲著床。8 d，通過尾靜脈注射1%芝加哥藍(lán)以確定激活成功。

1.6 人工誘導(dǎo)蛻膜化結(jié)扎性成熟雄鼠恢復(fù)后，與雌鼠1∶2合籠，見栓當(dāng)天的雌鼠記為假孕第1天(PD1)。給PD4雌鼠的一側(cè)子宮角注射25 μL芝麻油，另一側(cè)不做任何處理作為對(duì)照，PD8完成取材。

1.7 原位雜交從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取小鼠Krt19基因的mRNA序列設(shè)計(jì)引物。Krt19引物為F：5′-GGTCAGTGTGGAGGTGGATTC-3′；R：5′-GGTGGGCAGATTGTTGTAGTG-3′,以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增并純化產(chǎn)物，連接T載體，探針利用地高辛標(biāo)記試劑盒(Roche公司)進(jìn)行標(biāo)記。

1.8 免疫組織化學(xué)石蠟切片于60℃烘片30 min。脫蠟，酒精梯度入水，抗原修復(fù)并冷卻至室溫，3%雙氧水處理10 min，馬血清室溫避光封閉1 h。4℃過夜避光孵育兔源Krt19多克隆抗體(1∶100)。HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶200)室溫避光孵育1 h。水洗，DAB顯色(中山金橋)，水洗，蘇木精對(duì)染1 min。氨水返藍(lán)、酒精梯度脫水和透明后封片。

1.9 Western blot檢測根據(jù)蛋白濃度，按照所需蛋白量進(jìn)行點(diǎn)樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，37℃搖床振蕩封閉1 h;使用Krt19多克隆抗體(1∶1 000)，4℃過夜避光孵育。配制PBST用于洗膜，山羊抗兔IgG(1∶1 000)37℃振蕩孵育1 h;PBST洗膜，使用增強(qiáng)型ECL發(fā)光液曝光拍攝，Image J軟件掃描條帶，計(jì)算灰度值。

1.10 real-time PCR檢測使用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。以小鼠子宮組織的cDNA為模板，使用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用Amplied Biosystems?7500 real-time PCR System(Amplied Biosystems)儀器收集熒光信號(hào)，并利用2-ΔΔCt法分析結(jié)果。

表1 引物信息

2 結(jié)果

2.1 小鼠早期妊娠子宮中Krt19 mRNA和蛋白的表達(dá)原位雜交結(jié)果顯示，妊娠1～3 d，Krt19 mRNA在子宮上皮中表達(dá)比較強(qiáng)烈，且1 d信號(hào)最強(qiáng),妊娠4 d的表達(dá)有所降低。與著床前相比，妊娠5～8 d的Krt19表達(dá)顯著降低。妊娠5 d，其在上皮中也有表達(dá)，但是比前4 d信號(hào)弱，并且微弱表達(dá)于胚胎周圍的子宮基質(zhì)細(xì)胞中。妊娠6～8 d，Krt19 mRNA在胚胎周圍的初級(jí)蛻膜區(qū)以及次級(jí)蛻膜區(qū)也有表達(dá)。此外，在6～8 d的胚胎中也有表達(dá)(圖1A)。免疫組織化學(xué)結(jié)果與原位雜交結(jié)果基本一致，Krt19蛋白在小鼠早期妊娠1～4 d子宮腔上皮和腺上皮中的表達(dá)比較強(qiáng)烈，并且1 d表達(dá)最強(qiáng)。在5 d的子宮腔上皮和腺上皮以及在胚胎周圍的基質(zhì)細(xì)胞中也檢測到微弱的表達(dá)。妊娠6～8 d，在殘余的腔上皮中仍然檢測到了其表達(dá)，在胚胎周圍形成的初級(jí)蛻膜區(qū)以及次級(jí)蛻膜區(qū)也有表達(dá)，但是相比于1～4 d，著床后其表達(dá)較弱(圖1B)。real-time PCR結(jié)果與原位雜交結(jié)果一致(圖1C)。Western blot結(jié)果顯示，Krt19蛋白在小鼠早期妊娠1～8 d子宮中的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，其中1 d表達(dá)最高。胚胎著床后，Krt19蛋白表達(dá)相對(duì)于著床前較低，結(jié)果與免疫組織化學(xué)結(jié)果基本一致(圖1D，E)。

A.原位雜交結(jié)果；B.免疫組織化學(xué)結(jié)果；C.real-time PCR結(jié)果；D.Western blot結(jié)果(1～8.早期妊娠1～8 d);E.(D)中的灰度掃描結(jié)果。比例尺.100 μm；*** P<0.001

2.2 類固醇激素處理小鼠子宮中Krt19 mRNA和蛋白的表達(dá)原位雜交結(jié)果顯示，在4組模型中，Krt19 mRNA在子宮腔上皮和腺上皮中均有表達(dá)。但是，與對(duì)照組相比，Krt19 mRNA在E2處理子宮的腔上皮與腺上皮中的表達(dá)比較強(qiáng)烈(圖2A)。免疫組織化學(xué)結(jié)果與原位雜交結(jié)果相似(圖2B)。real-time PCR結(jié)果與原位雜交結(jié)果相符，Krt19 mRNA在E2處理組中表達(dá)顯著上調(diào)，差異極顯著(P<0.001)，在其他組無明顯變化(圖2C)。Western blot結(jié)果顯示，Krt19蛋白的表達(dá)情況與免疫組織化學(xué)結(jié)果基本一致(圖2D，E)。

A.原位雜交結(jié)果；B.免疫組織化學(xué)結(jié)果；C.real-time PCR結(jié)果；D.Western blot結(jié)果；E.(D)中的灰度掃描結(jié)果。比例尺.100 μm；** P<0.01；*** P<0.001

2.3 延遲著床與激活子宮中Krt19蛋白的表達(dá)為了進(jìn)一步檢測Krt19的表達(dá)是否受著床胚胎活性狀態(tài)的影響，因此，建立了延遲著床與激活模型。延遲著床狀態(tài)子宮中的胚胎處于休眠狀態(tài)，被E2重新激活進(jìn)而著床。利用免疫組織化學(xué)和Western blot技術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在延遲著床模型的子宮中，Krt19蛋白高表達(dá)于腔上皮與腺上皮中。當(dāng)胚胎被E2激活發(fā)生著床后，在著床位點(diǎn)處腔上皮、腺上皮中表達(dá)相對(duì)較弱，并且著床位點(diǎn)周圍的基質(zhì)細(xì)胞中也出現(xiàn)微弱表達(dá)。在非著床位點(diǎn)的上皮中，Krt19蛋白表達(dá)較強(qiáng)(圖3A)。Western blot結(jié)果與免疫組織化學(xué)的結(jié)果相一致，Krt19蛋白在延遲著床模型中的表達(dá)顯著高于激活模型中著床位點(diǎn)處(P<0.000 1)，同時(shí)，非著床位點(diǎn)的表達(dá)也顯著高于著床位點(diǎn)處(P<0.001；圖3B，C)。

A.免疫組織化學(xué)結(jié)果；B.Western blot結(jié)果；C.(B)中的灰度掃描結(jié)果。Activated-NI.激活模型的非著床位點(diǎn)；Activated-IS.激活模型的著床位點(diǎn)；Delayed.延遲模型子宮；比例尺.100 μm；*** P<0.001；**** P<0.000 1

2.4 人工誘導(dǎo)蛻膜化子宮中Krt19蛋白的表達(dá)為了進(jìn)一步檢測Krt19在小鼠子宮中的表達(dá)是否受蛻膜化的調(diào)節(jié)，使用芝麻油誘導(dǎo)蛻膜化來制備人工誘導(dǎo)蛻膜化模型。為了對(duì)其進(jìn)行定位和相對(duì)定量檢測，利用免疫組織化學(xué)和Western blot技術(shù)進(jìn)行檢測。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在對(duì)照組中，Krt19蛋白強(qiáng)表達(dá)于腔上皮和腺上皮細(xì)胞中，基質(zhì)細(xì)胞中未見表達(dá)。而在人工誘導(dǎo)蛻膜化小鼠子宮中，Krt19蛋白在蛻膜區(qū)表達(dá)(圖4A)。Western blot結(jié)果與免疫組織化學(xué)結(jié)果一致，蛻膜子宮中的Krt19蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照子宮中，差異極顯著(P<0.000 1；圖4B，C)。

A.免疫組織化學(xué)結(jié)果；B.Western blot結(jié)果；C.(B)中的灰度掃描結(jié)果。Decidualized.蛻膜子宮；Control.對(duì)照子宮；比例尺.100 μm；**** P<0.000 1

3 討論

本研究運(yùn)用原位雜交、real-time PCR、免疫組織化學(xué)、Western blot技術(shù)檢測幾種小鼠模型中Krt19的表達(dá)模式，進(jìn)而判斷其在小鼠妊娠過程中是否參與了胚胎著床過程以及是否受卵巢類固醇激素的調(diào)控。

子宮腔上皮細(xì)胞在正確的時(shí)間里進(jìn)行增殖、分化和凋亡，才有利于滋養(yǎng)層細(xì)胞與母體子宮相互接觸，并發(fā)生著床[15]。隨著胚胎在子宮內(nèi)的遷移和侵襲，這些機(jī)械應(yīng)力會(huì)導(dǎo)致子宮上皮細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。角蛋白是細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的主要成員之一，可維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整和穩(wěn)定[16]。本試驗(yàn)首先檢測了Krt19在早期妊娠子宮中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)模式與上皮細(xì)胞的狀態(tài)有關(guān)。妊娠1～2 d的小鼠子宮上皮細(xì)胞在排卵前卵巢分泌的E2的作用下進(jìn)行增殖。結(jié)果表明，Krt19在妊娠1～2 d子宮的腺上皮與腔上皮中高表達(dá)，妊娠第1天表達(dá)量最高。妊娠第3天，新形成的黃體分泌的P4會(huì)刺激基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行增殖，同時(shí)也會(huì)拮抗上皮細(xì)胞的增殖作用。妊娠第4天，著床前的E2會(huì)出現(xiàn)一個(gè)小峰值，而在該E2峰與P4共同的作用下，基質(zhì)細(xì)胞的增殖作用更加明顯。同時(shí)，上皮細(xì)胞也是在這二者的作用下停止增殖進(jìn)入分化狀態(tài)。而Krt19在接受期(第4天)的子宮中的表達(dá)有所下降。我們發(fā)現(xiàn)，上皮細(xì)胞停止增殖開始分化的同時(shí)，Krt19表達(dá)下降了。相關(guān)研究已表明，Krt19可以作為多種細(xì)胞的分化標(biāo)志物[17-19]，與本試驗(yàn)結(jié)果相符，提示Krt19可以作為子宮腔上皮分化的標(biāo)志物。

胚胎著床過程中，E2和P4起著非常重要的作用。在妊娠過程中，很多基因的表達(dá)都受E2的上調(diào)，而E2是通過結(jié)合ER受體來發(fā)揮相應(yīng)的作用。本研究結(jié)果顯示，Krt19在E2處理子宮中高表達(dá)。已有研究表明，在乳腺癌上皮細(xì)胞以及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中[20-23]，E2結(jié)合ER可以促進(jìn)Krt19的表達(dá)。因此，推測Krt19在接受前期上皮中強(qiáng)烈的表達(dá)，可能是E2通過結(jié)合ER進(jìn)行調(diào)節(jié)的。

隨著胚胎在子宮中繼續(xù)侵入，胚胎周圍的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞分化為更大的圓形蛻膜細(xì)胞，此過程叫做蛻膜化[24-25]。蛻膜細(xì)胞也經(jīng)歷廣泛的重塑以控制胚胎侵襲并適應(yīng)不斷生長的胚胎[26]。6～8 d，隨著蛻膜化的進(jìn)行，胚胎著床處的腔上皮逐漸凋亡，Krt19在子宮腔上皮仍然有表達(dá)，相比妊娠1～4 d較弱。并且在初級(jí)蛻膜區(qū)開始表達(dá)，繼而擴(kuò)展到次級(jí)蛻膜區(qū)。人工誘導(dǎo)蛻膜化模型進(jìn)一步驗(yàn)證Krt19的表達(dá)是否受蛻膜化的影響。盡管Western blot結(jié)果表明，整個(gè)子宮組織Krt19蛋白在對(duì)照中的表達(dá)明顯強(qiáng)于蛻膜子宮。但免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在蛻膜化的基質(zhì)細(xì)胞中Krt19的表達(dá)比未發(fā)生蛻膜化的對(duì)照基質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)增強(qiáng)。以上說明，Krt19在小鼠子宮蛻膜化過程中可能起一定的作用。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)，在6～8 d胚胎也檢測到了Krt19的表達(dá)。此前也有研究表明，在小鼠胚胎中，Krt19可能在交配后9.5 d之前就能檢測到[27]，而本試驗(yàn)在更早的時(shí)間(6～8 d)就檢測到了Krt19的表達(dá)。TAMAI等[27]建立了Krt19基因敲除鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此鼠可育，并且胚胎發(fā)育與子代數(shù)目均正常，其又構(gòu)建了Krt19和Krt8基因雙敲除小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(Krt19-/-，Krt8-/-)其胚胎在E9.5～E10.5致死在子宮中。HESSE等[28]建立了Krt19和Krt18基因雙敲除鼠，同樣發(fā)現(xiàn)(Krt19-/-，Krt18-/-)其胚胎在E9.5左右死在子宮中，致死率高達(dá)100%。這2種基因敲除鼠胚胎致死的原因可能是由于小鼠胚胎發(fā)生過程中角蛋白細(xì)胞骨架缺乏，使滋養(yǎng)層細(xì)胞變得脆弱。由此我們發(fā)現(xiàn)，Krt19敲除鼠沒有出現(xiàn)任何明顯的表型，可能是Krt18補(bǔ)償?shù)脑?。而Krt19和Krt8或者Krt19和Krt18同時(shí)敲除，胚胎則會(huì)致死。這可能又提供了早期流產(chǎn)可能性的線索，即角蛋白表達(dá)異常，細(xì)胞骨架可能無法形成，導(dǎo)致滋養(yǎng)層缺陷以及母體和胚胎組織之間失去聯(lián)系，從而導(dǎo)致流產(chǎn)。

妊娠成功需要處于接受態(tài)的子宮和活性狀態(tài)的胚胎，才可以打開子宮的著床窗口，使得胚胎著床[29-30]。在延遲著床子宮中，Krt19蛋白僅高表達(dá)于腔上皮與腺上皮中，當(dāng)胚胎被E2激活發(fā)生著床后，除在腔上皮、腺上皮中表達(dá)外，著床位點(diǎn)周圍的基質(zhì)細(xì)胞中也出現(xiàn)微弱表達(dá)。Western blot定量檢測表明，Krt19蛋白在延遲著床中的表達(dá)顯著高于激活模型中著床位點(diǎn)，同時(shí)，非著床位點(diǎn)處的表達(dá)也顯著高于著床位點(diǎn)。以上結(jié)果提示，著床胚胎的活性狀態(tài)可能會(huì)影響Krt19在子宮中的分布。

綜上，本研究結(jié)果表明，Krt19在小鼠早期妊娠過程中可能參與胚胎著床與蛻膜化過程，并且受E2以及子宮內(nèi)著床胚胎的活性狀態(tài)的調(diào)節(jié)，本研究為胚胎著床分子機(jī)理的研究提供了新的視角，也為臨床IVF胚胎著床失敗的原因提供了一定的線索。