白和平，張 鹿，陳鈺斌，劉 暢，張志強，史秋梅，吳同壘

(河北科技師范學院 河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室，河北 秦皇島 066004)

腸炎沙門菌(Salmonellaenteritidis)宿主廣泛，主要分布在人與動物消化道與生殖道內(nèi)，幼齡動物感染呈敗血癥和系統(tǒng)性感染，成年動物感染呈隱性感染，造成長期排毒，且會垂直傳播；可通過污染食物與飲水進行水平傳播，其食源性感染一直居食源性細菌感染的前2位[1]。在歐洲、美國，腸炎沙門菌血清型被認為是暴發(fā)人類沙門菌病的主要原因[2]；在我國，70%～80%細菌性食物中毒是由腸炎沙門菌引起的[3]。目前為止抗生素療法依然是預防與治療腸炎沙門菌的主要手段，隨著耐藥性腸炎沙門菌的不斷出現(xiàn)，新型藥物的研發(fā)跟不上菌株耐藥性的變化，尋找有效措施抑制腸炎沙門菌的感染迫在眉睫，因此構(gòu)建腸炎沙門菌減毒活疫苗成為研究熱點[4]。相比于傳統(tǒng)抗生素療法，減毒活疫苗具有良好的免疫原性、風險低、無殘留、免疫反應持久、特異性強等優(yōu)點。

腸炎沙門菌通過食源途徑感染機體要耐受消化道的極端pH、膽鹽作用、吞噬細胞清除等多種殺傷作用，細菌的抗逆機制在這一過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。ArgG基因編碼精氨酰琥珀酸合成酶(ASS)，研究發(fā)現(xiàn)，在單核細胞增多性李斯特菌中ArgG基因轉(zhuǎn)錄和表達對酸脅迫響應有關(guān)[6]，在蠟樣桿菌中ArgG基因與生物膜形成有關(guān)[7]，因此推測其在腸炎沙門菌的侵襲和抗應激能力中具有重要作用。目前國內(nèi)外對腸炎沙門菌ArgG基因生物學特性的相關(guān)研究尚未見報道，本試驗以腸炎沙門菌ArgG基因為研究對象，采用λ-Red重組法構(gòu)建腸炎沙菌ArgG基因缺失株，并通過分析ArgG基因缺失株的生物學特性以及毒力，探索ArgG基因的功能。

1 材料與方法

1.1 主要材料質(zhì)粒pKD3、pKD46、pCP20、pBR322 由河北科技師范學院預防獸醫(yī)學重點實驗室保存；腸炎沙門菌標準菌株C50336購自中國菌種保藏中心。

細菌RNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶及T4DNA連接酶均購自NEB公司；L-阿拉伯糖購自Sigma公司；DNA回收試劑盒購自Tiangen公司。

1.2 實驗動物4～6周齡昆明鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設計根據(jù)GenBank公布的腸炎沙門菌序列(CP023475.1)，設計ArgG基因打靶引物P1、P2，P1、P2引物由兩部分組成，加下劃線部分與ArgG基因同源，未加下劃線部分與pKD3氯霉素基因同源；并設計用于構(gòu)建回補株引物P3、P4及鑒定引物P5、P6，P5、P6引物位于P1、P2引物外側(cè)用于對缺失株的鑒定，引物均由生工生物(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 PCR引物信息

1.4 腸炎沙門菌C50336ΔArgG基因缺失株及回補株構(gòu)建參照文獻[8]方法，利用λ-Red同源重組方法構(gòu)建腸炎沙門菌ArgG基因缺失株，以pKD-3質(zhì)粒為模板，P1、P2為引物，擴增ArgG基因打靶片段，將ArgG基因打靶片段電轉(zhuǎn)化入腸炎沙門菌C50336-pKD46感受態(tài)細胞，30℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆，以鑒定引物P5、P6進行PCR并測序鑒定。陽性克隆利用溫度敏感性質(zhì)粒pCP20替換氯霉素片段，將鑒定正確的ArgG基因缺失株命名為C50336ΔArgG。利用基因提取試劑盒提取野生株與ArgG基因缺失株DNA，以P5、P6鑒定引物進行擴增，根據(jù)擴增片段大小進行分析；并將ArgG基因缺失株擴增產(chǎn)物送生工生物(上海)股份有限公司進行測序。結(jié)合測序結(jié)果分析ArgG基因是否成功敲除。

以P3、P4引物擴增野生株ArgG基因，并將其克隆至pBR332質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)入缺失株感受態(tài)中，構(gòu)建回補株，利用P5、P6引物進行PCR并測序鑒定，鑒定無誤后即獲得回補株C50336ΔArgG/pBR322-ArgG。

1.5 生物學特性檢測將WT(C50336菌株，下同)、KO(C50336ΔArgG，下同)菌株、RS(C50336ΔArgG/pBR322-ArgG，下同)接種于LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)作為種子液，次日按1∶100接種于LB液體培養(yǎng)基與M9液體培養(yǎng)基，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔1 h取菌液樣品測定D600值，根據(jù)D600值繪制生長曲線。同時，利用ATB全自動微生物鑒定儀與ID 32E生化鑒定試紙條分析WT、KO及RS菌株的生物學特性，試驗操作嚴格按照相關(guān)說明書執(zhí)行。

1.6 生物被膜形成能力檢測采用結(jié)晶紫半定量染色法測定WT、KO及RS菌株的生物被膜形成能力。將按菌液1∶100轉(zhuǎn)接入LB液體培養(yǎng)基，取96孔細菌培養(yǎng)板，每孔添加200 μL，30℃孵育72 h，小心棄掉培養(yǎng)液，使用超純水清洗5次；甲醇固定10 min，小心棄掉甲醇，超純水再清洗5次；結(jié)晶紫染色10 min，超純水清洗至液體清澈透明，添加250 μL無水乙醇溶解結(jié)晶紫，及時測定D575值。

1.7 運動能力檢測配制含0.3%瓊脂的LB培養(yǎng)基，使用接種針將WT、KO及RS菌株穿刺接種于培養(yǎng)基中央，37℃正置培養(yǎng)6 h后測量運動直徑，根據(jù)運動直徑分析缺失株的運動能力。

1.8 體外應激試驗參照文獻[9]方法測定各菌株在不同條件下的生存能力，配制minimal培養(yǎng)基，分別在酸性應激條件 (pH 3.5)、堿性應激條件(pH 10)、氧化應激條件(10 mmol/L H2O2)及高滲條件(2.4 mol/L NaCl)下，37℃振蕩培養(yǎng)30 min，對細菌培養(yǎng)物進行細菌計數(shù)。計算細菌存活率，細菌存活率=(當前菌數(shù)/初始菌數(shù))×100%，同時做平行試驗。

1.9 巨噬細胞存活能力檢測將計數(shù)后的WT、KO及RS菌株，按照MOI值1∶100接種于生長良好的RAW264.7巨噬細胞培養(yǎng)孔內(nèi)，孵育1 h后將培養(yǎng)液更換為含 20 mg/L 慶大霉素的 DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，于6，24 h，使用0.5% TritonX-100裂解細胞，并計算活菌數(shù)，分析菌株在胞內(nèi)存活能力。

1.10 LD50的測定取55只小鼠隨機分為11組，每組各5只。采用滴板計數(shù)法對WT、KO菌株進行計數(shù)，計數(shù)后的菌液進行倍比稀釋，稀釋5個梯度，1～5組腹腔注射WT菌株，6～10組注射KO菌株，11組注射等體積滅菌PBS，根據(jù)寇氏改良法測定LD50。

2 結(jié)果

2.1 腸炎沙門菌C50336ΔArgG基因缺失株的構(gòu)建經(jīng)用λ-Red重組法缺失腸炎沙門菌ArgG基因，獲得ArgG基因缺失株C50336ΔArgG，并將ArgG基因電轉(zhuǎn)入C50336ΔArgG感受態(tài)中，獲得回補株C50336ΔArgG/pBR322-ArgG；利用檢測引物分別擴增C50336、C50336ΔArgG::cat、C50336ΔArgG菌株ArgG基因，分別獲得約1 400，1 400，490 bp條帶(圖1)，符合預期。將擴增產(chǎn)物進行測序，結(jié)果顯示，WT菌株攜帶ArgG基因，KO菌株不攜帶ArgG基因，綜合分析表明成功構(gòu)建了不攜帶ArgG基因缺失株腸炎沙門菌。

M.DL5000 DNA Marker;1.C50336;2.C50336ΔArgG::cat；3.C50336ΔArgG

2.2ArgG基因缺失后生化特性檢測結(jié)果根據(jù)D600值繪制WT、KO及RS菌株在LB、M9培養(yǎng)基中生長曲線，結(jié)果顯示，在37℃培養(yǎng)條件下，各菌株在LB培養(yǎng)基中生長速度無明顯變化(圖2A)，但在M9培養(yǎng)基中，KO菌株不生長，WT與RS菌株生長速度無明顯變化(圖2B)，表明缺失ArgG基因?qū)δc炎沙門菌的生長有一定的影響。

經(jīng)ABI自動微生物鑒定系統(tǒng)檢測各菌株的生化特性，結(jié)果顯示，ArgG基因缺失后腸炎沙門菌生化特性無變化(表2)。

2.3 生物被膜檢測結(jié)果通過結(jié)晶紫半定量染色法測定WT、KO及RS菌株生物被膜形成能力，定量檢測結(jié)果顯示，WT菌株D575值為3.4(±0.2)，KO菌株D575值為1.6(±0.2)，RS菌株D575值為3.2(±0.2)，KO菌株比WT菌株生物膜形成能力下降60%，表明缺失ArgG基因后腸炎沙門菌生物被膜形成能力顯著下降(圖3)。

A.WT、KO及RS菌株在LB培養(yǎng)基的生長曲線測定；B.WT、KO及RS菌株在M9培養(yǎng)基的生長曲線測定

表2 生化鑒定試驗結(jié)果

注：***表示P<0.001

2.4 缺失株運動能力檢測取經(jīng)37℃、6 h培養(yǎng)的半固體培養(yǎng)基，根據(jù)WT、KO及RS菌株的運動直徑評估各菌株運動能力的變化。結(jié)果顯示，WT菌株運動直徑為(2.4±0.2)cm(圖4A)，KO菌株運動直徑為(2.2±0.2)cm(圖4B)，RS菌株運動直徑為(1.7±0.2)cm(圖4C)，表明ArgG基因缺失后對腸炎沙門菌運動能力的影響不明顯。

圖4 WT(A)、KO(B)及RS(C)菌株的運動能力的測定

2.5 抗pH、氧化應激、高滲能力檢測檢測腸炎沙門菌野WT、KO及RS菌株對抗pH、氧化應激、高滲能力，結(jié)果顯示，與WT菌株相比,KO菌株抵抗氧化應激、高滲能力變化不明顯，但抗酸應激、堿應激能力分別下降約12%，10%，結(jié)果表明，ArgG基因參與腸炎沙門菌抵抗酸、堿應激環(huán)境(圖5)。

2.6 巨噬細胞存活能力檢測測定腸炎沙門菌WT、KO及RS在鼠源巨噬細胞RAW264.7的增殖能力。結(jié)果顯示,WT菌株的胞內(nèi)存活率(24 h/6 h)為64%，KO菌株胞的內(nèi)存活率(24 h/6 h)為30%，與WT菌株相比下降了約34%(圖6)，表明缺失ArgG基因后腸炎沙門菌胞內(nèi)存活能力下降明顯。

A～D.酸性應激、堿性應激、高滲應激、氧化應激對ArgG基因缺失株生長的影響。**表示0.001

**表示0.001

2.7 LD50試驗取攻毒死亡小鼠脾臟、肝臟劃線于HE瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，在平板上生長出形態(tài)均一、中等大小、金屬光澤的菌落，生化鑒定結(jié)果顯示為腸炎沙門菌。采用寇氏改良法計算菌株的LD50，結(jié)果顯示，WT菌株LD50為3.54×105CFU/mL，KO菌株的LD50為5.43×106CFU/mL，毒力下降約15倍。結(jié)果表明，在動物個體水平上，缺失ArgG基因后影響腸炎沙門菌的毒力。

3 討論

在減毒活疫苗的研究中，廣泛使用基因編輯技術(shù)，λ-Red重組系統(tǒng)是近些年發(fā)展起來的一種敲除系統(tǒng)，1998年，MURPHY等[10]首次利用λ-Red重組系統(tǒng)在大腸桿菌中進行基因敲除，由此在原核生物中建立了新的基因編輯技術(shù)，成為大腸桿菌基因敲除最常用的方法之一。近年來，也有報道其用于腸炎沙門菌、雞白痢沙門菌、鼠傷寒沙門菌等菌株的基因敲除。 2009年，GERLACH等[11]提出的改進后Red同源重組方案，改進λ-Red同源重組法相比與傳統(tǒng)的λ-Red同源重組法，該方法操作簡單、周期短、無片段殘留，不影響下一次同源重組效率。目前已廣泛應用于易制作感受態(tài)的細菌如大腸桿菌的基因敲除，但在沙門菌中此方法尚未完全建立。本研究采用改進后λ-Red同源重組法成功構(gòu)建了不含ArgG基因的腸炎沙門菌，為建立腸炎沙門菌特定靶基因無痕敲除方法提供科學參考。

本研究構(gòu)建腸炎沙門菌ArgG基因缺失株并對其部分生物學特性進行研究，結(jié)果表明，野生株、缺失株與回補株32項生理生化特性指標并無明顯差異，但缺失了ArgG基因的腸炎沙門菌在M9培養(yǎng)基中不生長，而野生株與回補株在M9培養(yǎng)基中生長曲線相同。表明ArgG基因影響腸炎沙門菌的生長和營養(yǎng)代謝過程，更間接說明了M9培養(yǎng)基中缺乏腸炎沙門菌生長代謝所必需的元素，這可能是敲除L-精氨酸合成途徑ArgG基因后，導致L-精氨酸營養(yǎng)缺陷型，LB培養(yǎng)基中含有一定量的酵母粉，能夠提供少量相應的氨基酸，但在M9培養(yǎng)基中L-精氨酸供應不足，影響KO菌株的正常生長和產(chǎn)物的積累。后續(xù)試驗可以對對數(shù)期野生株與缺失株在M9培養(yǎng)基中增長差率為切入點，提取不同時間段野生菌株與缺失菌株的RNA，并以氨基酸代謝相關(guān)基因組件為靶基因，研究野毒株與缺失株在氨基酸轉(zhuǎn)錄水平上的差異[12]。

細菌對宿主細胞的黏附、侵襲在細菌定植過程中至關(guān)重要，并且生物被膜的形成與黏附有關(guān)。本研究中對腸炎沙門菌野生株、回補株、缺失株進行生物被膜形成能力的檢測，結(jié)果顯示缺失ArgG基因后腸炎沙門菌生物被膜形成能力顯著下降。細菌的生物被膜由細菌及其分泌的糖、蛋白質(zhì)和核酸等多種基質(zhì)組成的細菌群落[13-14]，缺失ArgG基因影響腸炎沙門菌的生物被膜形成能力的機制需要進一步研究。通過體外應激試驗發(fā)現(xiàn)，腸炎沙門菌ArgG基因缺失后對體外環(huán)境的高滲、氧化應激抵抗能力下降不明顯；但抗堿應激能力下降約10%，抗酸應激能力下降約12%。低pH是巨噬細胞殺傷病原的重要手段[15]，為進一步驗證ArgG缺失是否影響了腸炎沙門菌抵抗巨噬細胞殺傷能力，本試驗采用鼠源巨噬細胞RAW264.7進行胞內(nèi)存活和增殖試驗，結(jié)果表明ArgG基因缺失能顯著影響腸炎沙門菌在細胞內(nèi)增殖，以上結(jié)果說明缺失ArgG基因可以抑制腸炎沙門菌侵襲、黏附、胞內(nèi)增殖能力。

綜上所述，本研究結(jié)果表明ArgG基因與腸炎沙門菌生長速度、生物被膜形成能力密切相關(guān)，在腸炎沙門菌致病過程中發(fā)揮重要作用。但本研究還有諸多需完善之處，如精氨酰琥珀酸合成酶為尿素循環(huán)的限速酶，也是瓜氨酸NO循環(huán)與合成的限速酶，通過影響哪些代謝途徑進而影響細菌的生物表型發(fā)生改變？而每個代謝途徑都有不同的底物、代謝產(chǎn)物、終產(chǎn)物，ArgG基因影響具體哪些物質(zhì)的合成代謝？此外，腸炎沙門菌的ArgG缺失株對小鼠毒力有所下降，是否與生物學特性相關(guān)的毒力基因表達量有關(guān)。目前尚不明確，需進一步開展相關(guān)試驗進行ArgG基因調(diào)控腸炎沙門菌生物表型的具體分子機制的研究。