王 妍，文美齡，王仁鈴，王蓬琨，關(guān)繼羽，宋德光，陸慧君

(吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 人獸共患病研究所，吉林 長(zhǎng)春 130062)

羊口瘡是由羊口瘡病毒(orf virus，ORFV)引起的一種高度接觸性人獸共患傳染病，主要感染山羊和綿羊，其病變部位多位于皮膚黏膜和口腔，會(huì)形成紅斑、膿皰和結(jié)痂，羔羊致死率可達(dá)90%[1]，雖然該病對(duì)成年羊致死率低，但因繼發(fā)感染和進(jìn)食困難，會(huì)導(dǎo)致羊只消瘦，肉品質(zhì)量下降，嚴(yán)重影響?zhàn)B羊業(yè)的發(fā)展。ORFV是痘病毒科(Poxviridae)，副痘病毒屬(Parapoxvirus)代表性成員，具有獨(dú)特的免疫逃逸特性，可以反復(fù)感染羊群，使得羊口瘡成為傳播最廣的動(dòng)物病毒性傳染病之一。 ORFV是線性雙股DNA病毒，長(zhǎng)度為134～140 kb，編碼約132個(gè)基因。其中ORFV的B2L基因大小為1 137 bp。研究表明，將B2L基因與流感疫苗共同免疫小鼠，可以顯著提升流感疫苗對(duì)小鼠的免疫保護(hù)力，證明B2L蛋白是一種高免疫原性蛋白[2]。

綿羊痘是由綿羊痘病毒(sheep pox virus，SPPV)引起的一種急性、接觸性傳染病。SPPV在自然情況下僅感染綿羊，可在口腔、鼻腔、耳朵、乳房、尾巴腹側(cè)等處會(huì)由最初的紅斑發(fā)展成丘疹，最終形成隆起的球狀結(jié)節(jié)。其發(fā)病率可達(dá)100%，成年羊致死率達(dá)50%，而羔羊的致死率可高達(dá)100%[3]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，臨床上SPPV經(jīng)常與ORFV發(fā)生混合感染[4]。SPPV 是一種大于200 nm線性雙股DNA包膜病毒，長(zhǎng)約150 kb，編碼至少147個(gè)基因。其中SPPV的P32基因大小為972 bp，可編碼P32蛋白，約為36 kDa。P32蛋白已用于開發(fā)ELISA試劑盒，以檢測(cè)血清中的SPPV抗體，P32基因也是診斷試劑和疫苗的熱門靶點(diǎn)[5]。

因此，開發(fā)一種既可同時(shí)預(yù)防上述2種疾病，又易于生產(chǎn)、運(yùn)輸和保存的二聯(lián)疫苗具有重要的臨床意義和應(yīng)用價(jià)值。DNA疫苗屬于基因工程疫苗，是通過分子克隆技術(shù)將病原中的免疫原性基因整合至表達(dá)載體。在真核啟動(dòng)子的作用下，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗原，從而激發(fā)宿主的免疫應(yīng)答，目前已有一些獸用基因工程疫苗得到了批號(hào)和量產(chǎn)[6]。DNA疫苗具有易于開發(fā)、批次之間穩(wěn)定性好、無需冷鏈運(yùn)輸、可推廣性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。大量臨床試驗(yàn)表明，DNA疫苗免疫效果和安全性較好[7]。

本研究基于ORFV的B2L基因與SPPV的P32基因，構(gòu)建了二聯(lián)重組DNA疫苗，并通過免疫小鼠對(duì)疫苗的免疫效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 毒株、質(zhì)粒和細(xì)胞羊口瘡病毒株、綿羊痘病毒株、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體、293T細(xì)胞以及原代胎羊鼻甲骨細(xì)胞(OFTu)由吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑PrimeSTAR Max DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker以及限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠DNA/PCR產(chǎn)物小量回收試劑盒和去內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技公司；innuPREP Virus DNA Kit購自Analytik Jena公司；同源重組酶購自全式金生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購自美侖生物技術(shù)公司；胎牛血清購自Biological Industries生物科技公司；LipoFiter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自漢恒生物技術(shù)有限公司；IL-4和IFN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒購自Biolegend公司；抗Myc標(biāo)簽單克隆抗體、抗Flag標(biāo)簽單克隆抗體及抗HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG購自Proteintech公司。

1.3 ORFV和SPPV全基因組DNA提取取適量實(shí)驗(yàn)室預(yù)先保存的病毒液，按照innuPREP Virus DNA Kit說明書進(jìn)行全基因組DNA的提取。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成參考GenBank：MG712417.1中的B2L基因序列與GenBank：AY077834.1中的P32基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列如表1所示，引物均由長(zhǎng)春庫美生物公司合成。

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.5.1融合基因片段的擴(kuò)增與純化 首先以O(shè)RFV的B2L基因區(qū)域?yàn)槟０?，引物F1與R1為上、下游引物，擴(kuò)增出1 227 bp的Flag-B2L-P2A片段；以SPPV 的P32基因區(qū)域?yàn)槟０?，引物F2與R2為上、下游引物，擴(kuò)增1 059 bp的P2A-P32-Myc片段。反應(yīng)條件：98℃ 2 min；98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 10 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。以Flag-B2L-P2A片段和P2A-P32-Myc片段為模板，引物F1和R2為上、下游引物，進(jìn)行重疊延伸PCR，擴(kuò)增2 263 bp的Flag-B2L-P2A-P32-Myc片段。反應(yīng)條件：98℃ 2 min;98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 20 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。以Flag-B2L-P2A-P32-Myc片段為模板，引物F3與R3，擴(kuò)增出2 209 bp的B2L-P2A-P32片段。反應(yīng)條件：98℃ 2 min；98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 20 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。上述所有PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，純化回收。

1.5.2連接和轉(zhuǎn)化反應(yīng) pcDNA3.1(+)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、ApaⅠ及BamHⅠ、HindⅢ分別于37℃水浴作用2 h，對(duì)載體進(jìn)行線性化處理，酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定后回收；將回收的線性化載體與擴(kuò)增出來的Flag-B2L-P2A-P32-Myc和B2L-P2A-P32基因進(jìn)行同源重組；隨后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂到氨芐固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)。

表1 PCR引物信息

1.5.3陽性克隆檢測(cè) 挑取單個(gè)菌落做菌液PCR鑒定，PCR陽性菌液擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-B2L-P2A-P32-Myc用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和ApaⅠ進(jìn)行消化，pcDNA3.1-B2L-P2A-P32用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行消化，37℃水浴2 h；1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察、保存酶切鑒定結(jié)果。將鑒定正確的菌液送至吉林生工生物公司測(cè)序,測(cè)序成功后的菌液于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 重組質(zhì)粒的表達(dá)

1.6.1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞 293T細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37℃、5% CO2中進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d將293T細(xì)胞鋪至6孔板內(nèi)，使第2天細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%；將pcDNA3.1-Flag-B2L-P2A-P32-Myc重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h；每孔加入160 μL RIPA裂解液、1.6 μL蛋白酶抑制劑PMSF(100×)，冰上裂解30 min；最后加入SDS-PAGE上樣緩沖液(5×)，煮沸樣品10 min。

1.6.2Western blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá) 使用PAGE凝膠快速制備試劑盒(12.5%)配制蛋白膠；取20 μL樣品進(jìn)行電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；5%脫脂奶粉37℃封閉30 min；使用Flag標(biāo)簽抗體、Myc標(biāo)簽抗體、β-actin內(nèi)參抗體和GAPDH內(nèi)參抗體，4℃孵育過夜；TBS-T緩沖液洗膜，使用對(duì)應(yīng)源性HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h；TBS-T緩沖液洗膜，使用超敏ECL發(fā)光液顯色，利用Image J軟件對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析。

1.7 DNA疫苗免疫小鼠效果評(píng)價(jià)

1.7.1免疫程序 42只6～8周齡雌性BALB/c小鼠購自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，每組6只，具體分組情況：3個(gè)對(duì)照組(PBS組、pcDNA3.1(+)質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒+佐劑組)和4個(gè)疫苗免疫組(pcDNA3.1-B2L-P2A-P32重組質(zhì)粒組、pcDNA3.1-B2L-P2A-P32重組質(zhì)粒+佐劑組、iORFV+佐劑組和iSPPV+佐劑組)。

首免的佐劑為完全弗氏佐劑，加強(qiáng)免疫的佐劑為不完全弗氏佐劑；病毒液與β-丙內(nèi)酯1∶3 000充分混合，4℃靜置24 h滅活，37℃水浴水解2 h后再與佐劑混合；質(zhì)粒的免疫劑量為100 μg/100 μL，滅活病毒的免疫劑量為1×105TCID50/100 μL；疫苗與佐劑1∶1混合，0，21 d在小鼠大腿外側(cè)肌肉注射，取首免后第1，3，5周的小鼠血清。

1.7.2血清特異性抗體檢測(cè) 采用間接ELISA法檢測(cè)血清中的特異性抗體。用碳酸鹽緩沖液分別稀釋ORFV病毒液(106TCID50/0.1 mL)與SPPV病毒液(106TCID50/0.1 mL)，每孔取100 μL加入ELISA板內(nèi)，4℃包被12 h；洗板時(shí)每孔加200 μL PBST，微孔板混勻儀振蕩1 min，棄去洗板液，重復(fù)洗板2次，每孔加入100 μL 5%脫脂奶粉，37℃封閉1 h；洗板4次，每孔加入100 μL稀釋的血清，以1∶50稀釋血清，37℃孵育1 h；洗板4次，每孔加入100 μL HRP標(biāo)記的鼠源二抗(以1∶10 000稀釋)，37℃封閉1 h；洗板4次，每孔加入100 μL新鮮配置的顯色液，避光孵育15 min;每孔加入100 μL的終止液,在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定D值。

1.7.3中和抗體的檢測(cè) 試驗(yàn)前1 d將OFTu細(xì)胞鋪至96孔板，確保第2天細(xì)胞的匯合度可以達(dá)到70%～80%；將血清在56℃水浴滅活30 min，隨后以1∶10進(jìn)行倍比稀釋，并加入病毒液10 μL(106TCID50/0.1 mL)，每孔共加入100 μL溶液；將血清與病毒溶液充分混合，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h；培養(yǎng)細(xì)胞的96孔板棄去原液，用無菌的PBS溶液洗1次，加入血清-病毒混合液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h；棄去原液，每孔加200 μL 2% DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；在3～5 d內(nèi)觀察細(xì)胞狀態(tài)，記錄出現(xiàn)病毒病變的孔數(shù)，根據(jù)Karber法計(jì)算中和抗體效價(jià)。

1.7.4細(xì)胞因子的檢測(cè) 血清中IL-4和IFN-γ的檢測(cè)均按照Biolegend公司ELISA MAXTMDeluxe Set Mouse IL-4和IFN-γ試劑盒說明書操作進(jìn)行，每個(gè)血清樣品重復(fù)3次。

1.7.5小鼠攻毒保護(hù)性試驗(yàn) 在首次免疫后的第35天，進(jìn)行攻毒保護(hù)性試驗(yàn)，其中每組取6只小鼠接毒SPPV，攻毒劑量均為107TCID50/只，接毒方式為尾靜脈注射。攻毒后第14天，分離小鼠肺臟，提取肺臟組織RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法來測(cè)定肺臟中的病毒載量， SPPV基因區(qū)域的序列參考GenBank：AY077834.1。設(shè)計(jì)的引物如表2所示，由長(zhǎng)春庫美生物有限公司合成。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物信息

2 結(jié)果

2.1 ORFVB2L基因、SPPVP32基因以及融合基因PCR擴(kuò)增所有經(jīng)PCR擴(kuò)增的基因片段均用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。Flag-B2L-P2A片段如圖1A所示，PCR擴(kuò)增獲得大小為1 227 bp的目的條帶；P2A-P32-Myc片段如圖1B所示，PCR擴(kuò)增獲得大小為1 059 bp的目的條帶；Flag-B2L-P2A-P32-Myc融合片段如圖1C所示，在2 263 bp處得到目的條帶；B2L-P2A-P32融合片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1D所示，在2 209 bp處得到目的條帶。所有條帶大小均與預(yù)期結(jié)果相符。

A.ORFV B2L基因PCR擴(kuò)增結(jié)果(M.DL2000 DNA Marker；1.Flag-B2L-P2A片段PCR擴(kuò)增結(jié)果；2.陰性對(duì)照)；B.SPPV P32基因PCR擴(kuò)增結(jié)果(M.DL2000 DNA Marker；1.P2A-P32-Myc片段PCR擴(kuò)增結(jié)果；2.陰性對(duì)照)；C.帶標(biāo)簽的融合基因PCR擴(kuò)增結(jié)果(M.DL2000 DNA Marker；1.Flag-B2L-P2A-P32-Myc片段PCR擴(kuò)增結(jié)果；2.陰性對(duì)照)；D.融合基因PCR擴(kuò)增結(jié)果(M.DL2000 DNA Marker；1.B2L-P2A-P32片段PCR擴(kuò)增結(jié)果；2.陰性對(duì)照)

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證結(jié)果酶切產(chǎn)物均用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-B2L-P2A-P32-Myc雙酶切驗(yàn)證后可見5 356 bp的大片段和2 235 bp的小片段(圖2A)；重組質(zhì)粒pcDNA3.1-B2L-P2A-P32雙酶切驗(yàn)證后可見5 410 bp的大片段和2 181 bp的小片段(圖2B)。所有條帶大小均與預(yù)期結(jié)果相符，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

A.重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-B2L-P2A-P32-Myc的鑒定結(jié)果(M.DL15000 DNA Marker；1.BamHⅠ和ApaⅠ雙酶切；2.未酶切；3.BamHⅠ單酶切；4.ApaⅠ單酶切)；B.重組質(zhì)粒pcDNA3.1-B2L-P2A-P32的鑒定結(jié)果(M.DL15000 DNA Marker；1.HindⅢ和BamHⅠ雙酶切；2.未酶切；3.HindⅢ單酶切；4.BamHⅠ單酶切)

2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后的蛋白表達(dá)、切割鑒定結(jié)果將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞72 h后，收取蛋白樣品，經(jīng)Western blot分析，用抗Flag標(biāo)簽抗體檢測(cè)Flag-B2L-P2A多肽片段及未切割的多肽片段，結(jié)果如圖3A所示，43 kDa處為切割后的Flag-B2L-P2A多肽；用抗Myc標(biāo)簽抗體檢測(cè)P32-Myc多肽片段及未切割的多肽片段，結(jié)果如圖3B所示，37 kDa處為切割后的P2A-P32-Myc多肽，未切割的蛋白均在81 kDa處，特異性蛋白條帶與實(shí)際預(yù)測(cè)蛋白的大小一致。pcDNA3.1(+)質(zhì)粒及293T細(xì)胞未檢測(cè)到特異性條帶。結(jié)果表明，該重組質(zhì)粒的自剪切肽P2A在真核細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了自剪切，ORFVB2L基因編碼的蛋白與SPPVP32基因編碼的蛋白在真核細(xì)胞內(nèi)可以獨(dú)立表達(dá)。

A.抗Flag標(biāo)簽抗體檢測(cè)結(jié)果(M.蛋白Marker；1.正常293T細(xì)胞；2.重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-B2L-P2A-P32-Myc轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞；3.質(zhì)粒pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞)；B.抗Myc標(biāo)簽抗體檢測(cè)結(jié)果(M.蛋白Marker；1.正常293T細(xì)胞；2.重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-B2L-P2A-P32-Myc轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞；3.質(zhì)粒pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞)

2.4 血清中特異性抗體水平檢測(cè)自制間接ELISA法，分別使用ORFV(106TCID50/0.1 mL)和SPPV(106TCID50/0.1 mL)作為抗原包被酶標(biāo)板，對(duì)免疫后1，3，5周采集的血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，4個(gè)疫苗組均檢測(cè)到了特異性抗體，在加強(qiáng)免疫后抗體水平再次升高，而3個(gè)對(duì)照組均未檢測(cè)到特異性抗體。在第5周，重組質(zhì)粒+佐劑組對(duì)2種病毒的特異性抗體水平均高于重組質(zhì)粒組，說明重組質(zhì)粒與佐劑混合后免疫，是有助于重組質(zhì)粒在體內(nèi)的緩慢釋放而激發(fā)更高的免疫效果，重組質(zhì)粒+佐劑組與3個(gè)對(duì)照組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著(P<0.001)，重組DNA疫苗+佐劑組與2個(gè)滅活疫苗組相比，特異性抗體水平相當(dāng)，統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著性差異(P>0.05)。

以上結(jié)果證明該重組DNA疫苗可以激發(fā)小鼠產(chǎn)生抗ORFV(圖4A)和SPPV(圖4B)的特異性抗體。在加強(qiáng)免疫后，重組質(zhì)粒的免疫水平再次升高，證明該疫苗可激活小鼠的體液免疫。

A.血清中ORFV特異性抗體水平；B.血清中SPPV特異性抗體水平。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。下同

2.5 血清中的中和抗體效價(jià)檢測(cè)取免疫后第5周的血清進(jìn)行中和抗體效價(jià)檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示，除3個(gè)對(duì)照組外，重組質(zhì)粒組、重組質(zhì)粒+佐劑組和iSPPV+佐劑組對(duì)SPPV均產(chǎn)生了中和抗體，半數(shù)中和單位分別為10-1.9，10-1.85和10-1.725。重組質(zhì)粒+佐劑組和重組質(zhì)粒組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異(P>0.05)，與iSPPV+佐劑對(duì)照組相比，抗體水平相當(dāng)，統(tǒng)計(jì)學(xué)亦無顯著性差異(P>0.05)，重組質(zhì)粒+佐劑組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。說明該重組質(zhì)粒+佐劑組可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗SPPV的中和抗體。

重組DNA疫苗組、重組質(zhì)粒+佐劑組和iORFV+佐劑組未能檢測(cè)到中和ORFV的抗體。據(jù)報(bào)道，ORFV因獨(dú)特的免疫逃避機(jī)制，雖然免疫相關(guān)疫苗后，會(huì)產(chǎn)生較高的免疫指標(biāo)，無法生成中和抗體。

2.6 血清中細(xì)胞因子水平檢測(cè)采用ELISA試劑盒對(duì)免疫后1，3，5周血清中的細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)，IL-4和IFN-γ的水平如圖6所示。在免疫后3，5周，重組質(zhì)粒組、重組質(zhì)粒+佐劑組、iORFV+佐劑組和iSPPV+佐劑組分泌的IL-4和IFN-γ水平隨著加強(qiáng)免疫而增高，其余對(duì)照組均未見升高趨勢(shì)。

如圖6A所示，重組質(zhì)粒+佐劑組在第3周為56.89 ng/L，第5周比第3周高0.57倍。在第5周，重組質(zhì)粒+佐劑組比iORFV+佐劑組高0.21倍，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著(P<0.001)，比iSPPV+佐劑組高0.09倍，統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著性差異(P>0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒+佐劑組與其他對(duì)照組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著(P<0.001)。

圖5 血清中的中和抗體效價(jià)

如圖6B所示，重組質(zhì)粒+佐劑組分泌的IFN-γ水平最高，第5周為355.15 ng/L，比第3周高0.72倍。在第5周，重組質(zhì)粒+佐劑組的IFN-γ水平比iORFV+佐劑組高0.19倍，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.05)，比iSPPV+佐劑組高0.27倍，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著(P<0.01)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒+佐劑組與其他對(duì)照組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著(P<0.001)。

Th2型細(xì)胞分泌IL-4，主要參與體液免疫，Th1型細(xì)胞分泌IFN-γ，主要參與細(xì)胞免疫。加強(qiáng)免疫后，重組DNA疫苗+佐劑組的IL-4與IFN-γ的水平均為最高。結(jié)果表明，重組DNA疫苗可同時(shí)誘導(dǎo)Th1及Th2型免疫。

A.血清中IL-4水平檢測(cè)；B.血清中IFN-γ水平檢測(cè)

2.7 小鼠攻毒后病毒載量水平檢測(cè)對(duì)加強(qiáng)免疫后14 d的小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，尾靜脈接毒107TCID50/只，攻毒結(jié)束后提取小鼠肺臟組織RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行熒光定量PCR，以檢測(cè)各組的病毒載量水平。

攻毒SPPV的檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，重組疫苗+佐劑組、滅活疫苗組和健康對(duì)照組小鼠的病毒載量水平相當(dāng)，統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異(P>0.05)，重組疫苗+佐劑組低于3個(gè)對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著(P<0.01)。重組質(zhì)粒組的小鼠病毒載量遠(yuǎn)低于對(duì)照組，與滅活疫苗組的病毒載量無顯著性差異，證明該重組DNA疫苗可以起到對(duì)小鼠的保護(hù)作用。

圖7 小鼠攻毒SPPV后肺臟的病毒載量變化

3 討論

羊口瘡和綿羊痘在全世界養(yǎng)羊業(yè)發(fā)達(dá)的地區(qū)呈廣泛流行，受感染的羊群臨床上常呈現(xiàn)混合感染，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。有研究表明，對(duì)單獨(dú)ORFV的免疫原性基因B2L和單獨(dú)SPPV的P32免疫原性基因制備的基因工程疫苗進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)2種疫苗均具有較好的免疫效果[8-9]。鑒于2種病毒?；旌细腥狙蛉?，研發(fā)安全、高效的二聯(lián)苗勢(shì)在必行。因此，本研究將上述2個(gè)病原的免疫原性基因串聯(lián)，構(gòu)建了抗羊口瘡和綿羊痘二聯(lián)重組DNA疫苗，并在試驗(yàn)動(dòng)物小鼠體內(nèi)進(jìn)行了免疫效果評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)二聯(lián)DNA疫苗具有較好的免疫效果。

近年來，國內(nèi)學(xué)者對(duì)2種病毒免疫原性基因及相應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)研究較多。李杰等[10]將ORFVB2L基因進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建到pET-32a原核表達(dá)載體中，進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、純化，并免疫家兔，制備出多克隆抗體。經(jīng)過ELISA以及Western blot驗(yàn)證，B2L蛋白具有能與兔抗ORFV抗血清反應(yīng)的能力，證明了B2L蛋白與ORFV擁有共同的B細(xì)胞表位。有研究人員也構(gòu)建了基于ORFVB2L基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)，小鼠可以產(chǎn)生針對(duì)ORFV的特異性抗體，可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的體液免疫和細(xì)胞免疫[11]。丁軍濤等[12]以減毒鼠沙門菌X4550為載體，構(gòu)建了SPPVP32胞外段基因的新型口服活載體DNA疫苗，結(jié)果顯示活載體疫苗具有良好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生持久的、高水平的免疫應(yīng)答。田靜等[13]通過GPI錨定策略將P32蛋白錨定到新城疫病毒樣顆粒囊膜表面制備成嵌合型病毒樣顆粒cVLP-P32，通過對(duì)小鼠和羊的免疫試驗(yàn)證明，cVLP-P32能誘導(dǎo)小鼠及羊產(chǎn)生特異性抗體，也可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生CD3+CD4+T以及CD4+CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。

目前，國內(nèi)有關(guān)綿羊痘和羊口瘡二聯(lián)疫苗生產(chǎn)尚屬空白，國外臨床生產(chǎn)中所用二聯(lián)疫苗多為弱毒疫苗，雖然產(chǎn)生了一定的免疫效果，但是該疫苗在免疫過程中存在病毒擴(kuò)散、毒力反強(qiáng)的危險(xiǎn)[14]。因此，研發(fā)一種安全有效的二聯(lián)疫苗顯得極其重要。與傳統(tǒng)疫苗相比，DNA疫苗設(shè)計(jì)簡(jiǎn)潔、制造成本較低、研制周期較短、且易于儲(chǔ)存，減少了運(yùn)輸過程中對(duì)冷鏈的需求，而且使用 DNA 質(zhì)粒進(jìn)行疫苗接種消除了從感染性病原體中純化蛋白質(zhì)的必要性，從而提高了安全性[15]。

為此，本研究通過構(gòu)建一種ORFVB2L基因與SPPVP32基因的二聯(lián)重組DNA疫苗，并證明該疫苗能在真核細(xì)胞中獨(dú)立表達(dá)免疫原性多肽。免疫后可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗羊口瘡和綿羊痘的特異性抗體，也可以產(chǎn)生抗綿羊痘的中和抗體，同時(shí)也提示成功激發(fā)了宿主的細(xì)胞免疫；不僅如此，疫苗也可以對(duì)SPPV攻毒后的小鼠起到一定的保護(hù)作用。上述研究結(jié)果為開展羊口瘡和綿羊痘的聯(lián)合預(yù)防研究奠定了基礎(chǔ)，具有重要的實(shí)踐意義與潛在應(yīng)用價(jià)值。