金衛(wèi)東，唐澤宇，李作臣，王海軍，陳 健，賈立軍

(1.延邊大學(xué) 東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心，吉林 延吉 133002；2.延邊特色產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，吉林 延吉 133002；3.延邊州畜牧總站，吉林 延吉 133002；4.延邊州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，吉林 延吉 133002)

犬新孢子蟲(chóng)(Neosporacaninum)是引起孕畜流產(chǎn)、死胎及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)障礙的胞內(nèi)寄生性原蟲(chóng)，主要寄生于動(dòng)物的腦、肝臟、脾臟等臟器組織以及生殖系統(tǒng)[1-2]。新孢子蟲(chóng)病(Neosporosis)呈世界性分布，我國(guó)北京、山東、吉林、新疆、青海等多個(gè)省、市(區(qū))都有該病的報(bào)道[3]。犬新孢子蟲(chóng)對(duì)牛的危害最為嚴(yán)重，羊、馬、驢、鹿、狐、鴿、水貂等多種動(dòng)物均有該病感染的報(bào)道[4-5]。目前尚無(wú)用于預(yù)防新孢子蟲(chóng)病的商品化疫苗[6]。

致密顆粒蛋白(GRA)是新孢子蟲(chóng)致密顆粒細(xì)胞器分泌的蛋白，致密顆粒蛋白被釋放到寄生液泡(pv)中，在維持寄主-寄生關(guān)系和獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)方面發(fā)揮重要作用[7]。目前鑒定得到的新孢子蟲(chóng)GRA9蛋白與弓形蟲(chóng)GRA9蛋白同源性達(dá)到60%，且NcGRA9主要是親水蛋白質(zhì)，但也包含較短的疏水區(qū)。而NcGRA9蛋白作為新孢子蟲(chóng)疫苗的候選抗原之一，國(guó)內(nèi)尚未有該蛋白研究的相關(guān)報(bào)道，本試驗(yàn)PCR擴(kuò)增新孢子蟲(chóng)NcGRA9基因，構(gòu)建NcGRA9重組表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白并進(jìn)行純化，通過(guò)Western blot鑒定和小鼠免疫來(lái)驗(yàn)證NcGRA9蛋白的抗原性，以期為新孢子蟲(chóng)疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲(chóng)株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物牛源犬新孢子蟲(chóng)、Vero細(xì)胞、pGEX-4T-1表達(dá)載體均由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供；BALB/c小鼠購(gòu)自延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑BamHⅠ 酶、Not Ⅰ酶、GST純化試劑盒、BCA試劑盒均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、蛋白質(zhì)Marker均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)ToxoDB網(wǎng)站發(fā)布的NcGRA9(NCLIV_066630)基因序列，應(yīng)用Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列P1：5′-TCTTATCGGGATCCATGCAGGGCGTGAC-3′，P2：5′-ATAAGAATGCGGCCGCTATTTCTCCGTT-ATGGTTCG-3′。

1.4 NcGRA9基因PCR擴(kuò)增以提取的新孢子蟲(chóng)基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94℃ 5 min;94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 45 s,35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.5 NcGRA9基因重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建及測(cè)序?qū)CR擴(kuò)增正確的條帶回收，連接pMD18-T克隆載體，轉(zhuǎn)化到DH5α中，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，并進(jìn)行測(cè)序分析。

1.6 NcGRA9基因原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建雙酶切pGEX-4T-1載體，瓊脂糖凝膠回收載體片段。將NcGRA9基因與pGEX-4T載體4℃過(guò)夜連接。

1.7 表達(dá)蛋白SDS-PAGE電泳和Western blot分析將pGEX-4T-NcGRA9重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞中IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化表達(dá)蛋白。SDS-PAGE電泳后，進(jìn)行Western blot分析。

1.8 重組蛋白的小鼠免疫將純化后的重組蛋白與弗氏佐劑(完全佐劑和不完全佐劑)混合。將30只BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，分為免疫組(重組蛋白+佐劑)、質(zhì)粒組(pGEX-4T-NcGRA9)及對(duì)照組(PBS)。免疫組的重組蛋白含量200 μg/只，質(zhì)粒組為等量pGEX-4T-NcGRA9，對(duì)照組為等體積PBS。每次接種間隔14 d，共接種3次，每次接種前及第3次接種后14 d采集血液，分離血清并保存待檢。

1.9 免疫小鼠血清中抗體水平和細(xì)胞因子水平檢測(cè)應(yīng)用間接ELISA方法[8]檢測(cè)免疫小鼠血清中IgG抗體水平，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)免疫小鼠血清中抗體亞類(lèi)IgG1、IgG2a水平和細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4水平。

2 結(jié)果

2.1 牛源犬新孢子蟲(chóng)NcGRA9基因的克隆與測(cè)序分析以牛源犬新孢子蟲(chóng)的DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出大小為522 bp的條帶，擴(kuò)增條帶與預(yù)期大小相符。構(gòu)建pMD18-T-NcGRA9重組克隆質(zhì)粒，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，PCR擴(kuò)增出522 bp片段；經(jīng)NotⅠ與BamHⅠ雙酶切后，獲得522 bp的目的條帶與2 692 bp的載體片段。經(jīng)測(cè)序表明，獲得的NcGRA9基因序列與ToxoDB網(wǎng)站發(fā)布NcGRA9(NCLIV_066630)基因序列同源性為100%。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-NcGRA9鑒定pGEX-4T-NcGRA9進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，PCR擴(kuò)增出522 bp目的片段；經(jīng)NotⅠ、BamHⅠ雙酶切后，獲得522 bp的目的條帶與4 969 bp的載體片段(圖1)。

M.DL2000 DNA Marker；1.pGEX-4T-NcGRA9雙酶切產(chǎn)物

2.3 蛋白的表達(dá)與純化取誘導(dǎo)3 h后的重組蛋白和純化后的重組蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，在約45 kDa處出現(xiàn)目的條帶，并以可溶性蛋白表達(dá)(圖2)。Western blot分析表明，該蛋白能被小鼠抗新孢子蟲(chóng)陽(yáng)性血清所識(shí)別，具有較好的反應(yīng)原性(圖3)。

M.蛋白質(zhì)Marker；1.誘導(dǎo)后總蛋白；2.純化后的蛋白；3.沉淀樣本；4.上清樣本

M.蛋白質(zhì)Marker；1.NcGRA9重組蛋白；2.陰性對(duì)照

2.4 免疫小鼠血清中IgG、IgG1及IgG2a抗體水平檢測(cè)結(jié)果ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a抗體水平(圖4)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，免疫重組蛋白后，免疫組小鼠IgG抗體及其亞類(lèi)IgG1、IgG2a水平均極顯著高于質(zhì)粒組與PBS對(duì)照組(P<0.01)。

**P<0.01表示差異極顯著；*P<0.05表示差異顯著；P>0.05表示差異不顯著。下同

2.5 免疫小鼠血清中IFN-γ、IL-4細(xì)胞因子水平檢測(cè)結(jié)果ELISA試劑盒檢測(cè)免疫小鼠血清中細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4水平(圖5)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，免疫組小鼠IFN-γ與IL-4水平均極顯著高于質(zhì)粒組與PBS對(duì)照組(P<0.01)。

圖5 不同免疫組小鼠血清IFN-γ(A)、IL-4(B)的水平檢測(cè)

3 討論

新孢子蟲(chóng)病嚴(yán)重影響我國(guó)的畜牧業(yè)發(fā)展，而目前尚無(wú)有效藥物和疫苗防控新孢子蟲(chóng)病。國(guó)內(nèi)外對(duì)NcGRA2、NcGRA6、NcGRA7、NcGRA16等均有不同程度的研究報(bào)道，而對(duì)NcGRA9的研究較少[9]。國(guó)內(nèi)金春梅等[10]對(duì)NcGRA2進(jìn)行了表達(dá)與鑒定；刑明等[11]對(duì)NcGRA6基因進(jìn)行表達(dá)，并對(duì)其免疫效果進(jìn)行初步分析；賈立軍等[12]對(duì)NcGRA7進(jìn)行了表達(dá)；杜博亞等[13]對(duì)NcGRA16進(jìn)行了初步分析；但尚未見(jiàn)對(duì)NcGRA9的相關(guān)研究報(bào)道。

致密顆粒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能多樣，在宿主細(xì)胞入侵后被釋放到寄生液泡中，使蟲(chóng)體獲得營(yíng)養(yǎng)以滿(mǎn)足生長(zhǎng)增殖的需要[14]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，致密顆粒蛋白在參與蟲(chóng)體入侵宿主細(xì)胞后以高水平分泌，在其后處于較低水平。NcGRA9作為可溶性蛋白存在于液泡中，在宿主細(xì)胞入侵中起重要作用，并且C末端截短的NcGRA9蛋白保留在這些細(xì)胞器中因?yàn)檎郫B不當(dāng)，隨后可能會(huì)退化。

以往的研究證實(shí)，GRA2、GRA6和GRA7的抗原分子是新孢子蟲(chóng)有效的候選疫苗蛋白基因[15]。而關(guān)于NcGRA9疫苗方面的研究甚少，僅有YU等[16]將新孢子蟲(chóng)致密顆粒蛋白NcGRA1、NcGRA4、NcGRA9、NcGRA14、NcGRA17及NcGRA23構(gòu)建的pcNcGRA DNA疫苗接種BALB/c小鼠，這些真核表達(dá)質(zhì)?？梢饛?qiáng)烈的Th1型免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgG2a抗體和IFN-γ細(xì)胞因子水平，免疫保護(hù)試驗(yàn)表明DNA疫苗均能夠延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間和減少腦內(nèi)蟲(chóng)荷量。由此可見(jiàn)，NcGRA9基因作為疫苗抗原的可行性。

為了解NcGRA9基因的表達(dá)形式及作為疫苗候選抗原的免疫原性，本試驗(yàn)對(duì)NcGRA9基因進(jìn)行了原核表達(dá)，確定了NcGRA9基因表達(dá)重組蛋白為可溶性蛋白，Western blot分析具有良好的反應(yīng)原性；接種BALB/c小鼠能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答與體液免疫應(yīng)答，具有良好的免疫原性。本試驗(yàn)為NcGRA9基因蛋白作為新孢子蟲(chóng)病診斷的候選抗原和疫苗候選抗原奠定了基礎(chǔ)。