楊曉偉,劉于暢，李畢成，王 艷，駱澤禮，劉 佳，趙自亮，朱盈名，劉 霞，趙光偉,4*

(1.西南大學 動物醫(yī)學院，重慶 榮昌 402460；2.上海海關動植物與食品檢測中心，上海 浦東 200135；3.貴州省動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽 550008；4.重慶三杰眾鑫生物工程有限公司，重慶 榮昌 402460)

中國大鯢(Chinese giant salamander)俗稱娃娃魚，屬兩棲綱、有尾目、隱腮鯢科、大鯢屬，是世界上現(xiàn)存?zhèn)€體最大的有尾目兩棲類動物。大鯢為我國特有的珍稀兩棲動物，已被列入國家二級保護動物名錄并收錄于《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》(CITES)附錄Ⅰ[1]。因其在科研、醫(yī)藥、食品和觀賞等方面具有重要的價值[2]，導致近年來大鯢的人工繁育與養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，我國許多有大鯢自然分布的地區(qū)都積極開展了人工繁育和養(yǎng)殖，據(jù)統(tǒng)計2013年我國大鯢的市場存量約700萬尾，2017年已經(jīng)增至2 000萬尾以上[3]，養(yǎng)殖數(shù)量增長了近3倍。然而，隨著大鯢飼養(yǎng)規(guī)模及集約化程度的不斷發(fā)展，大鯢的病害問題日趨嚴重,因此開展大鯢相關疾病的研究將為大鯢產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供保障。

葡萄牙檸檬酸桿菌(C.portucalensis)是一種革蘭陰性兼性厭氧菌，是腸桿菌科檸檬酸桿菌屬的成員，存在于人和動物的腸道中，隨后經(jīng)糞便排出也可在多種環(huán)境中發(fā)現(xiàn)，如污水、土壤等[4]。2017年，第1株葡萄牙檸檬酸桿菌(A60T)是在葡萄牙的水井樣本中分離出來的[5]。到目前為止，NCBI數(shù)據(jù)庫中只有29個該菌的基因組數(shù)據(jù)，說明對該菌的研究相對較少。盡管如此，已有報道證明該菌為機會致病菌[6]，其對人和動物造成的潛在致病性不容忽視。

除了致病性，另一個值得注意的是葡萄牙檸檬酸桿菌所表現(xiàn)出的耐藥性。有研究表明，分離自家禽的NR-12株[7]、斑點龜?shù)腞IT669株[8]和綠葉蔬菜的MBTC-1222株[9]等，均表現(xiàn)出較強的耐藥性，這無疑對人類和動物的健康造成潛在的威脅。國內(nèi)對葡萄牙檸檬酸桿菌的研究較少，而大鯢源葡萄牙檸檬酸桿菌也尚未見報道。因此，對葡萄牙檸檬酸桿菌的耐藥性進行研究是十分必要的。鑒于此，本試驗對分離自患病大鯢的葡萄牙檸檬酸桿菌進行了全基因組測定及其耐藥性分析。

1 材料與方法

1.1 病料及細菌分離重慶開州某大鯢人工繁育場患病大鯢，臨床主要表現(xiàn)為皮膚腐爛、腹部膨脹、腹腔積液等癥狀。無菌采集患病大鯢肝臟接種LB固體培養(yǎng)基，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基進行增菌培養(yǎng)18 h，加滅菌甘油，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 16S rDNA測序鑒定參照文獻[10]方法，利用DNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司，B610367)提取分離菌DNA作為模板，以16S rDNA通用擴增引物(F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R:5′-AAGGAGGTGATCCAG-CCGCA-3′，由華大基因科技公司合成)進行PCR擴增。PCR反應體系(25 μL)：模板3 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，Premix Taq 12.5 μL，無菌ddH2O 7.5 μL。PCR擴增條件：98℃ 5 min；98℃ 60 s，55℃ 45 s，72℃ 60 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測后回收目的片段，送華大基因科技有限公司進行測序。

1.3 小鼠致病性試驗取10只健康ICR小鼠，隨機分成2組，每組5只。第1組為健康對照，腹腔注射0.5 mL滅菌生理鹽水；第2組為感染組，每組腹腔注射分離菌0.5 mL，菌液濃度用平板菌落計數(shù)法調(diào)整至1.0×108CFU/mL，觀察并記錄小鼠的發(fā)病情況，連續(xù)觀察7 d。

1.4 藥敏試驗采用K-B紙片法對分離菌進行35種藥物的敏感性試驗，其中β內(nèi)酰胺類包括頭孢噻肟、頭孢拉定、頭孢噻吩、頭孢曲松、青霉素G、阿莫西林、苯唑西林、氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢氨芐、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢呋辛和羧芐西林等14種藥物；氨基糖苷類包括鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、新霉素和丁胺卡那等6種藥物；喹諾酮類包括環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、恩諾沙星等3種藥物；四環(huán)素類藥物包括四環(huán)素、米諾環(huán)素、強力霉素等3種藥物；大環(huán)內(nèi)酯類藥物3種，包括紅霉素、麥迪霉素、乙酰螺旋霉素；磺胺類包括磺胺異惡唑和復方新諾明等2種藥物；林可霉素類包括克林霉素和林可霉素等2種藥物；還包括多黏菌素類的多黏菌素B和氯霉素類的氟苯尼考。

1.5 全基因組序列的測定及組裝細菌全基因組的測定在成都羅寧生物科技有限公司完成。其主要步驟為：提取待測菌株基因組DNA，使其D260/D280在1.8～2.0之間，D260/D230值大于2.0。采用全基因組鳥槍法(whole genome shotgun，WGS)策略，構建約350 bp的文庫，利用二代測序技術，基于Illumina HiSeq測序平臺的雙端測序PE150測序方法進行測序；采用4 bp滑動窗口法去除接頭污染，切除兩端堿基質(zhì)量小于3的堿基進行數(shù)據(jù)過濾；最后利用HGA V1.0[11]進行序列組裝，并通過軟件SSPACE[12]和QUAST[13]軟件對組裝后的結(jié)果進行進一步的校正和結(jié)果評價。隨后將全基因組序列信息注冊至GenBank數(shù)據(jù)庫，并通過NCBI上的原核基因組注釋通道PGAP(prokaryotic genome annotation pipeline,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation prok/)對組裝后的基因組序列進行注釋；利用RAST 數(shù)據(jù)庫(rapid annotations using subsystems technology，http://rast.nmpdr.org/rast.cgi)對編碼蛋白進行進一步注釋分析；利用病原毒力因子數(shù)據(jù)庫(virulence factors of pathogenic bacteria，VFDB.www.mgc.ac.cn)對細菌的毒力基因進行比對分析。

1.6 耐藥基因分析利用耐藥基因數(shù)據(jù)庫CARD 3.0.0 (the comprehensive antibiotic resistance database)和ResFinder 3.0對基因組序列進行比對，分析菌株中攜帶的耐藥基因。

2 結(jié)果

2.1 患病大鯢的臨床表現(xiàn)患病大鯢體長17～39 cm，主要表現(xiàn)為體表、四肢皮膚潰爛(圖1A)，部分大鯢腹部膨脹，腹腔內(nèi)有大量混有血液的積液(圖1B)。

A.患病大鯢外觀，可見頭頸、四肢部位皮膚潰爛；B.剖檢腹腔中有大量積液

2.2 分離菌的形態(tài)及16S rDNA鑒定結(jié)果病料接種LB培養(yǎng)基可見圓形、白色中等大小菌落，邊緣整齊(圖2A)；革蘭染色為陰性桿菌(圖2B)；隨機挑取3個單個克隆進行16S rDNA的擴增，均有單一目的條帶(圖2C)。陽性PCR產(chǎn)物測序比對，確定分離菌為葡萄牙檸檬酸桿菌，將其命名為CQ-CP1。

A.分離菌在LB培養(yǎng)基上的形態(tài)；B.分離菌革蘭染色結(jié)果(1 000×)；C.分離菌16S rDNA PCR擴增結(jié)果(M.DL2000 DNA Marker；1～3.分別為隨機挑取單個菌落的PCR擴增產(chǎn)物)

2.3 CQ-CP1對小鼠的致病性在分離菌(CQ-CP1)5×107CFU劑量感染下，小鼠在72 h內(nèi)全部死亡，病死率100%；陰性對照組未出現(xiàn)死亡。死亡小鼠腹部膨脹，剖檢可見腸道鼓氣(圖3)，肝臟有出血。

圖3 CQ-CP1致死小鼠剖檢結(jié)果

2.4 CQ-CP1藥敏試驗結(jié)果藥敏試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CQ-CP1對頭孢拉定、頭孢唑啉、頭孢曲松、羧芐青霉素、頭孢他啶和多黏菌素B高度敏感，對頭孢噻肟、妥布霉素、阿米卡星和環(huán)丙沙星中度敏感；然而對頭孢噻吩、青霉素G、阿莫西林、苯唑西林、氨芐西林、頭孢氨芐、哌拉西林、頭孢呋辛、鏈霉素、慶大霉素、新霉素、卡那霉素、左氧氟沙星、恩諾沙星、四環(huán)素、米諾環(huán)素、多西環(huán)素、紅霉素、麥迪霉素、乙酰螺旋霉素、磺胺異惡唑、復方新諾明、克林霉素、林可霉素和氟苯尼考等25種藥物均不敏感，說明CQ-CP1是一多重耐藥菌株。

2.5 CQ-CP1全基因組測序結(jié)果測序結(jié)果表明CQ-CP1共有29個重疊群，堿基數(shù)量5 006 960 bp，G+C含量為51.8%，編碼4 722個蛋白基因，假基因130個，共有2個rRNA、64個tRNA和5個非編碼RNA(ncRNAs)，在GenBank中的登錄號為RZIH00000000.1。利用RAST對其編碼蛋白進行注釋，共注釋了1 529個基因，其余未能獲得注釋。從RAST獲得的功能分析顯示，基因組中有46個基因與鐵的獲取和代謝有關，226個基因參與蛋白質(zhì)的代謝，83個基因參與DNA的代謝，65個基因與毒力、疾病和防御相關，76個基因參與膜轉(zhuǎn)運，25個基因與噬菌體、轉(zhuǎn)座因子和質(zhì)粒有關(圖4)。

2.6 CQ-CP1毒力基因注釋結(jié)果VFDB數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn),CQ-CP1 中共有49個與其毒力相關的基因(表1)，主要包括22個與鞭毛的合成、運動等相關的基因，10個與菌毛的合成、調(diào)節(jié)、黏附相關的基因，6個與DNA的復制、轉(zhuǎn)錄結(jié)合相關的基因，5個與其趨化相關的基因，2個與金屬鐵的攝取轉(zhuǎn)運相關基因，2個與腸桿菌素的輸出相關基因，另有外膜蛋白、脂蛋白各1個。

2.7 CQ-CP1耐藥基因注釋結(jié)果通過CARD 3.0.0和ResFinder 3.0這2個數(shù)據(jù)庫的比對發(fā)現(xiàn)，CQ-CP1中共攜帶6個耐藥基因，分別是β內(nèi)酰胺類的blaCMY-35和blaTEM-1A、喹諾酮類的qnrB32和qnrS1、氨基糖苷類的aadA1和磺胺類的dfrA1；耐藥基因的詳細信息參見表2。

圖4 RAST系統(tǒng)注釋編碼基因功能

表1 CQ-CP1毒力基因注釋結(jié)果

表2 CQ-CP1耐藥基因注釋結(jié)果

3 討論

隨著我國大鯢養(yǎng)殖規(guī)模的擴大、集約化程度的提高、放養(yǎng)密度的增加等，導致養(yǎng)殖場不斷發(fā)生各種病害。引起大鯢疾病的致病原一般包括細菌、真菌、病毒以及寄生蟲等，其中細菌性疾病最為常見[14]。本試驗中的病鯢來自重慶開州某大鯢人工繁育基地，在此病鯢中分離到多種致病菌，其中一種就是葡萄牙檸檬酸桿菌，這應是首次在該宿主中分離到該菌的報道。致病性試驗顯示該菌能引起小鼠死亡，且主要侵襲小鼠的消化系統(tǒng)，這與其腸桿菌科的其他成員較類似。隨后的毒力基因分析也顯示該菌所持有的毒力基因與其他腸桿科細菌較為相似，如大腸桿菌、沙門菌所具有的鞭毛相關蛋白，以及弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)所帶有的菌毛蛋白等，該結(jié)果能夠與臨床患病大鯢腹腔中大量積液、肝臟腫脹等特征相對應。此外，由于大鯢屬于珍稀動物，本試驗未將分離菌回歸原動物進行致病性研究。

耐藥性是檸檬酸桿菌屬成員一個不容忽視的問題，由于常表現(xiàn)為低毒力，且能夠在宿主體內(nèi)長期存在并對耐藥性進行累積，因而它們會表現(xiàn)出更強的毒性[15]。目前，在巴西龜、家禽、蔬菜上分離到的葡萄牙檸檬酸桿菌均印證了這一觀點。本試驗分離的CQ-CP1菌株也同樣表現(xiàn)出較強的耐藥性，對多種抗生素均不敏感，是一典型的多重耐藥菌株。全基因組測序并與耐藥基因數(shù)據(jù)庫比對顯示該菌株中帶有6種不同的耐藥基因，分別類屬于β內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類和四環(huán)素類，由于數(shù)據(jù)庫所收錄耐藥基因的限制，該菌株中可能還攜帶其他耐藥元件，例如藥敏試驗結(jié)果顯示CQ-CP1對磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物不敏感，但并未比對出針對兩類藥物的耐藥基因。

本試驗結(jié)果表明，6種耐藥基因分別是β內(nèi)酰胺類的blaCMY-35和blaTEM-1A，喹諾酮類的qnrS1和qnrB32，氨基糖苷類的aadA1和磺胺類的dfrA1；結(jié)合藥敏試驗的結(jié)果，耐藥基因的檢出首先與CQ-CP1所表現(xiàn)出的耐藥表型是一致的，如對氨芐西林、頭孢氨芐、左氧氟沙星、恩諾沙星、卡那霉素、新霉素等藥物均不敏感。其次，與臨床中不規(guī)范使用抗生素藥物密切相關，經(jīng)后期調(diào)查該養(yǎng)殖場經(jīng)常使用恩諾沙星、卡那霉素、新霉素等藥物，且使用過程中通常沒有進行藥敏試驗的篩選，根據(jù)經(jīng)驗大量投喂，這使得耐藥現(xiàn)象在該場較為突出。JIANG等[16]研究表明，qnrB和qnrS是自中國養(yǎng)殖魚類分離的大腸桿菌中最常見的喹諾酮類基因，與本試驗結(jié)果一致。然而本試驗中的大鯢養(yǎng)殖基地從未使用過磺胺類藥物，但CQ-CP1菌株中發(fā)現(xiàn)了編碼引起磺胺類耐藥性的dfrA1基因，推斷其很可能是通過飼料、養(yǎng)殖水體環(huán)境中從其他魚類病原體或水生細菌中水平轉(zhuǎn)移過來的，由此可見，耐藥菌株的形成機制仍是很復雜的，因而隨著我國大鯢人工繁育產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，對其養(yǎng)殖環(huán)境中耐藥菌株進行持續(xù)性跟蹤監(jiān)測對了解其耐藥機制的產(chǎn)生是十分必要的。

綜上，本試驗獲得了1份大鯢源葡萄牙檸檬酸桿菌的全基因草圖，多種耐藥基因的存在揭示該菌株為多重耐藥菌株，鑒于其所表現(xiàn)出的致病力及耐藥性特征，這種細菌值得持續(xù)監(jiān)測以確定其在獸醫(yī)乃至人類醫(yī)學中所存在的健康風險。