劉 然,張 琳，劉淑英*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

綿羊肺腺瘤(ovine pulmonary adenomatosis,OPA)是由綿羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)引起的一種慢性、進(jìn)行性、傳染性的肺部腫瘤性疾病[1]。該病主要以患羊咳嗽、呼吸困難、消瘦、大量漿液性鼻液、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和無纖毛細(xì)支氣管上皮細(xì)胞腫瘤性增生為特征[2]。其主要發(fā)病動物是綿羊，山羊相對較少，不感染其他動物[3]，由于沒有特效藥和疫苗進(jìn)行治療和預(yù)防，給養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此加強(qiáng)OPA的快速診斷對于預(yù)防和控制該病具有重要意義。

JSRV屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒屬，結(jié)構(gòu)基因主要是由5′-gag-pro-pol-env-3′構(gòu)成，其中env基因編碼的囊膜蛋白(envelope protein,Env)由跨膜蛋白(TM)和表面糖蛋白(SU)構(gòu)成，是引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化和致瘤的主要蛋白[4-5]。ARNAUD等[6]發(fā)現(xiàn)綿羊基因組中存在約27個拷貝的內(nèi)源性肺腺瘤反轉(zhuǎn)錄病毒(endogenous jaagsiekte sheep retrovious,enJSRV)在綿羊體內(nèi)大量表達(dá)，使得綿羊?qū)ν庠葱跃d羊肺腺瘤病毒(exogenous jaagsiekte sheep retrovirus，exJSRV)形成免疫耐受，以至于體內(nèi)檢測不到特異性抗體[7]，因此常規(guī)的血清學(xué)方法無法用于OPA的診斷，只能通過臨床癥狀、病理組織學(xué)方法，耗時長且過程繁瑣，不利于該病防控，由此可見快速診斷方法的建立尤為重要。

近年來，分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，以此為基礎(chǔ)的核酸檢測是病原鑒定最常用的方法之一。目前JSRV的檢測方法已有多種，但都耗費(fèi)時間較長。重組酶聚合酶恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification,RPA)是一種新型恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，利用重組酶、DNA聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白代替了PCR反應(yīng)中的熱循環(huán)解鏈過程，能夠在37～42℃對目的片段進(jìn)行擴(kuò)增[8-9]，15～30 min即可通過擴(kuò)增曲線實(shí)時觀察結(jié)果。目前RPA已經(jīng)在多種病原的檢測中成功應(yīng)用[10-13]，但國內(nèi)外尚無對JSRV的檢測報(bào)道。本研究選擇在exJSRVenv基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，以病羊肺組織提取RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，建立了exJSRV的實(shí)時熒光RPA檢測方法，以期為防控OPA提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 毒株及病料JSRV感染陽性的肺組織由本實(shí)驗(yàn)室保存。本研究使用的其他病原核酸：小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)、羊敗血性鏈球菌(ovine streptococcosis septicemia,OSS)由本實(shí)驗(yàn)室保存。牛腸道病毒 (bovine entero virus,BEV)、傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)、牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type3,BPIV3)、肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae,MO)由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)郝永清教授實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑與儀器動物組織、細(xì)胞與昆蟲總RNA快速提取試劑盒、血液/組織/細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒和瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒購自北京金佰特生物技術(shù)有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Vazyme;TwistAmp exo Kit試劑盒購自英國TwistDx Inc公司;核酸恒溫?cái)U(kuò)增儀AGS8800購自杭州安譽(yù)科技有限公司。

1.3 引物與探針的設(shè)計(jì)及合成參照GenBank上的JSRV登錄號為AF105220、JQ837489、KP691837和DQ838493的env基因序列，通過比對分析內(nèi)外源性env序列，運(yùn)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)1對PCR引物(表1)，同時按照RPA引物探針設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)4組引物和1條探針(表2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 exJSRV 熒光RPA方法的建立

1.4.1核酸提取及cDNA 制備 提取PPRV、BEV、BPIV3及JSRV的 RNA，使用酶標(biāo)儀檢測質(zhì)量濃度與純度，將上述總RNA分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用，提取IBRV、OSS和MO的DNA備用。具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.2cDNA的純化 將上述制備的OPA病肺cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增env全長，取50 μL產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行膠回收，純化cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩＞唧w操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

表1 PCR引物信息

1.4.3熒光RPA的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件 使用TwistAmp exo Kit進(jìn)行熒光RPA擴(kuò)增，反應(yīng)總體系50 μL。將Rehydration Buffer 29.5 μL，模板1 μL，上、下游引物各2.1 μL(10 μmol/L)，探針0.6 μL(10 μmol/L)，DNase/RNase-Free Deionized Water配成 47.5 μL的體系，混勻后移入RPA凍干酶粉反應(yīng)管后，再加入2.5 μL濃度為0.28 mmol/L的MgAc溶液?；靹蚝髮⒎磻?yīng)管放入恒溫核酸擴(kuò)增儀中，反應(yīng)4 min后取出混合，再繼續(xù)反應(yīng)16 min，在整個反應(yīng)過程中收集FAM熒光信號。在20 min內(nèi)觀察到指數(shù)級增長的擴(kuò)增曲線判定為陽性，反之為陰性。

1.4.4最佳引物對及最佳反應(yīng)溫度的篩選 將4對引物進(jìn)行熒光RPA檢測，根據(jù)擴(kuò)增效率篩選出最佳引物對。反應(yīng)溫度37～42℃條件下使用擴(kuò)增效果最優(yōu)引物對進(jìn)行熒光RPA檢測，篩選出最佳反應(yīng)溫度。

表2 RPA引物和探針信息

1.4.5特異性試驗(yàn) 利用已優(yōu)化的反應(yīng)條件和體系，將IBRV、OSS、MO、PPRV、BEV、BPIV3、JSRV核酸以及空白對照(以DNase/RNase-Free Deionized Water作為模板)進(jìn)行熒光RPA檢測，確定該方法的特異性。

1.4.6靈敏度試驗(yàn) 將上述制備及純化后的cDNA，以此為標(biāo)準(zhǔn)品按照10倍倍比稀釋后和空白對照進(jìn)行熒光RPA檢測，確定敏感性。同時進(jìn)行PCR試驗(yàn)，比較二者的靈敏度差異。

1.4.7重復(fù)性試驗(yàn) 選取cDNA和純化cDNA各兩個質(zhì)量濃度為模板以及空白對照進(jìn)行熒光RPA檢測，并重復(fù)3次，以驗(yàn)證建立的檢測方法的穩(wěn)定性。

1.4.8樣品檢測 為了驗(yàn)證所建立方法的可靠性，對本實(shí)驗(yàn)室保存的JSRV感染病羊肺部組織、鼻液、外周血白細(xì)胞(來自不同的病羊)、健康羊肺組織和空白對照進(jìn)行熒光RPA檢測。同時進(jìn)行PCR試驗(yàn)，比較二者檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 最佳引物及反應(yīng)溫度的篩選探針和4對引物(F1/R1、F2/R2、F3/R3和F4/R4)組合分別對JSRV進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，4對引物均能擴(kuò)增產(chǎn)生熒光信號，其中F1/R1擴(kuò)增速度最快，且熒光強(qiáng)度值最強(qiáng)，因此選用此對引物進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)(圖1)。最佳溫度篩選發(fā)現(xiàn)在40℃時Ct值11.52為最低，故確定該方法的最佳反應(yīng)溫度為40℃(圖2)。

1.F1/R1；2.F2/R2；3.F3/R3；4.F4/R4

A～F.37～42℃的RPA檢測結(jié)果，Ct值分別為15.36，13.51，12.77，11.52，12.23，12.42

2.2 特異性試驗(yàn)分別以JSRV、PPRV、OSS、BEV、IBRV、BPIV3、MO核酸為模板進(jìn)行熒光RPA檢測，結(jié)果顯示，除JSRV外，其他病原核酸和空白對照均無擴(kuò)增(圖3)，表明該方法與PPRV、OSS、BEV、IBRV、BPIV3、MO無交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)。

1.JSRV；2.PPRV；3.OSS；4.BEV；5.IBRV；6.BPIV3；7.MO；8.空白對照

2.3 靈敏度試驗(yàn)將上述制備的病羊肺組織cDNA及純化后的產(chǎn)物，分別進(jìn)行10倍倍比稀釋，以此作為模板進(jìn)行靈敏度檢測。結(jié)果顯示，所建立的方法對JSRV未純化cDNA的檢測下限為106ng/L，而對純化后cDNA的檢測下限為10 ng/L(圖4,5)。同時用上述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示PCR靈敏度與RPA相同(圖6,7)。說明只要模板中存在10 ng/L以上的病毒含量就能檢測到。

1～7.cDNA質(zhì)量濃度分別為109，108，107，106，105，104，103 ng/L；8.空白對照

1～7.cDNA質(zhì)量濃度分別為106，105，104，103，102，10，1 ng/L;8.空白對照

M.DL2000 DNA Marker;1～8.cDNA質(zhì)量濃度分別為109，108，107，106，105，104，103，102 ng/L；9.空白對照

M.DL2000 DNA Marker;1～9.cDNA質(zhì)量濃度分別為108，107，106，105，104，103，102，10，1 ng/L；10.空白對照

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)病羊肺組織cDNA選取質(zhì)量濃度108,107ng/L，純化cDNA選取質(zhì)量濃度103,102ng/L 進(jìn)行熒光RPA重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示該方法對于相同質(zhì)量濃度的模板檢測結(jié)果一致，在相同位置均可觀察到相對應(yīng)的熒光曲線，穩(wěn)定性良好(圖8)。

A.以病肺cDNA為模板(1～3.108 ng/L；4～6.107 ng/L；7.空白對照);B.以純化cDNA為模板(1～3.103 ng/L；4～6.102 ng/L；7.空白對照)

2.5 樣品檢測僅病羊肺組織、鼻液和外周血白細(xì)胞核酸出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，與PCR檢測結(jié)果一致，說明本研究建立的熒光RPA檢測方法可有效檢測出病羊體內(nèi)的JSRV(圖9,10)。

1.陽性肺組織；2.陽性鼻液；3.陽性外周血白細(xì)胞；4.健康肺組織；5.空白對照

1.陽性肺組織；2.陽性鼻液；3.陽性外周血白細(xì)胞；4.健康肺組織；5.空白對照

3 討論

2001年MAEDA等[14]發(fā)現(xiàn)JSRVenv基因在小鼠成纖維細(xì)胞(NIH3T3)中單獨(dú)表達(dá)可引起細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化；本實(shí)驗(yàn)室張宇飛等[15]通過對內(nèi)蒙株JSRVenv全長進(jìn)行克隆表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Env可以引起NIH3T3細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化；杜方原等[16]、趙娟等[17]通過構(gòu)建外源性綿羊肺腺瘤病毒囊膜基因(exJSRV-env) 的重組質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染至小鼠成纖維細(xì)胞(NIH3T3)和永生化綿羊絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞(STCs)中，發(fā)現(xiàn)JSRV Env 蛋白可促進(jìn) NIH3T3 細(xì)胞和STCs細(xì)胞的增殖和惡性轉(zhuǎn)化。以上研究結(jié)果表明 JSRV Env是致瘤作用的主要原因。由于內(nèi)外源性JSRV基因組在同源性上高度相似，為了排除enJSRV的干擾，通過DNAMAN比對二者env序列，選擇在env基因的TM區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和探針，以病羊肺組織提取的RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進(jìn)行exJSRV實(shí)時熒光RPA快速檢測。

目前已經(jīng)報(bào)道的JSRV的分子生物學(xué)檢測方法有PCR、qPCR、LAMP、巢式PCR。PCR檢測方法耗時長、檢測步驟與程序相對復(fù)雜，結(jié)果需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后才可得到[18]；qPCR法雖然相對于PCR法來說，操作簡單，但是檢測儀器復(fù)雜昂貴，需對溫度條件進(jìn)行摸索[19]；LAMP方法是等溫?cái)U(kuò)增，但需要的引物設(shè)計(jì)難度較高，試驗(yàn)結(jié)果存在假陽性的問題[20]；巢式PCR在進(jìn)行第2次擴(kuò)增時污染的幾率較高[21]。而熒光RPA技術(shù)可以在恒溫的條件下對目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，與熒光探針結(jié)合后可以通過儀器實(shí)時反應(yīng)擴(kuò)增結(jié)果，相較于其他檢測方法，能夠在短時間內(nèi)得到檢測結(jié)果，同時所需儀器更加便攜，方便基層檢測，反應(yīng)體系所需成分均以凍干粉的形式保存，儲存條件要求不高，有利于現(xiàn)場檢測。

本研究以JSRV的env基因高可變區(qū)為靶基因，按照TwistDX Inc公司引物和探針設(shè)計(jì)原則，使用固定探針篩選出了擴(kuò)增效果最優(yōu)的引物組合，確定了最佳反應(yīng)條件和體系，建立了能夠在40℃、20 min 檢測出exJSRV的熒光RPA方法。所建立的方法具有良好的重復(fù)性，能夠在相同位置出現(xiàn)擴(kuò)增曲線；特異性強(qiáng)，對PPRV、BEV、BPIV3、IBRV、OSS和MO等繼發(fā)呼吸道疾病的病原無交叉反應(yīng)；在樣品檢測中，與PCR檢測結(jié)果一致，檢測最低質(zhì)量濃度為106ng/L，純化后檢測最低質(zhì)量濃度為10 ng/L，由于所提取病羊肺組織中的RNA及反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA并非都是JSRV核酸，因此對檢測模板進(jìn)行純化，目的是得到所建立方法能夠檢測到的最低值，對于臨床應(yīng)用中，模板中只要病毒載量達(dá)到10 ng/L就可以檢測出。

RPA技術(shù)自2006年面世以來，已經(jīng)建立了多種可現(xiàn)場特異性檢測微量病原體DNA或RNA的檢測方法。黃超華等[22]建立了豬圓環(huán)病毒2型RPA恒溫?cái)U(kuò)增檢測方法，能夠在40℃、20 min內(nèi)檢測到87 ng/L的DNA模板；熊煒等[23]建立了對犬冠狀病毒(CCV)的實(shí)時熒光RPA方法，能夠在39℃、25 min內(nèi)檢測到104ng/L的cDNA模板；王瀟等[24]建立了禽流感病毒H5亞型RT-exoRPA方法，能夠在40℃、20 min內(nèi)檢測到8.9×102ng/L的RNA模板。以上檢測方法的建立說明RPA技術(shù)已經(jīng)成熟應(yīng)用于各類病原體的檢測，為本研究建立的JSRV熒光RPA方法提供可靠依據(jù)，該方法僅在20 min內(nèi)檢測到10 ng/L的cDNA，在檢測時間和靈敏度方面優(yōu)于上述其他方法。

綜上所述，本研究建立的exJSRV的熒光RPA檢測方法，特異性強(qiáng)、靈敏度高、反應(yīng)快速、操作手法簡單，是快速檢測exJSRV的有效手段，對于基礎(chǔ)設(shè)施較差的臨床養(yǎng)殖場進(jìn)行疾病篩查具有重要意義。