楊麗軍，夏 楠，方申超，徐 迪，張冬冬

（1.蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2.蕪湖市農(nóng)產(chǎn)品食品檢測中心，安徽 蕪湖 241000）

嘔吐毒素，又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON），可由漆班菌屬、鐮刀霉菌屬等真菌產(chǎn)生[1-2]。嘔吐毒素具備高的細胞毒性和免疫抑制性，會使豬的造血系統(tǒng)遭受損害并造成死亡[3-4]，故已嚴格控制使用。在GB/T 30956—2014標準中指出，豬飼料嘔吐毒素的含量不能超過1.0 mg/kg[5]。所以，在日常生活中任何可能含有嘔吐毒素的物品都應(yīng)該被準確測定。

不確定度是對結(jié)果的合理表征[6]，觀察被測量值的分散性與測量結(jié)果的可用性，是表示檢測值是否準確的重要參數(shù)[7-10]，所以實驗室進行權(quán)威認可前均需進行不確定度評定。李萬鵬等人[11]、陳曦等人[12]曾對飼料、參類等食品中赭曲霉毒素和人參皂苷等不同參數(shù)的測定進行不確定度評定，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生不確定度的主要來源有分析儀器、回收率等。

目前，我國測定嘔吐毒素的方法包括高效液相色譜法（HPLC）、膠體金快速試紙條法、衰減全反射-傅立葉紅外光譜法（ATR-FTIR）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等[13-16]。但因高效液相色譜法測定結(jié)果準確且儀器操作簡單并可重復(fù)使用，所以試驗利用高效液相色譜法測定飼料中的嘔吐毒素。

GB/T 30956—2014中介紹了免疫親和柱-高效液相色譜法測定飼料中嘔吐毒素含量的方法，以此方法為基礎(chǔ)并根據(jù)Robertson M，Kuang Y C等人[17-18]對不確定度的研究，進行不確定度評定，以此為同行業(yè)研究者提供理論支持。

1 試劑與儀器

1.1 試驗試劑

嘔吐毒素標準物質(zhì)（質(zhì)量濃度50μg/mL），青島普瑞邦生物工程有限公司提供；蒸餾水；聚乙二醇，海安石油化工廠提供；鹽酸，伊犁新天煤化工有限責(zé)任公司提供；氫氧化鈉，天津市福晨化學(xué)試劑廠提供；甲醇（色譜純），綠環(huán)化工廠提供。

1.2 試驗儀器

電子天平（感量0.01 mg），上海韜易實業(yè)有限公司產(chǎn)品；LC/20A型高效液相色譜儀、C18型色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm），島津公司產(chǎn)品；嘔吐毒素免疫親和柱，北京華安麥科生物技術(shù)有限技術(shù)產(chǎn)品；離心機，日本HITACHI公司產(chǎn)品；振蕩器，TAITEC實驗設(shè)備公司產(chǎn)品。

2 試驗方法

參照GB/T 30956—2014對飼料中嘔吐毒素的含量測定方法進行[19-21]。因為蒸餾水的安全性大且無特殊氣味，所以試驗用水均為蒸餾水。再利用免疫親和柱對液體進行凈化，最后洗脫、檢測。

2.1 樣品處理

從飼料袋中取出飼料粉碎，用間距1 mm分樣篩篩出較細飼料，稱取10.0 g飼料放置在50 mL離心管中，加入PEG 2.0 g，蒸餾水50 mL，置于200～300 r/min的振蕩器中劇烈振蕩20 min，再在離心機中以轉(zhuǎn)速8 000 r/min處理5 min，從而提取飼料中的嘔吐毒素。取上清液，用0.01 mol/L HCl或0.01 mol/L NaOH調(diào)節(jié)上清液pH值為6～8，用以進行下一步凈化。

2.2 樣品凈化

嘔吐毒素免疫親和柱可特異性吸附液體中的嘔吐毒素：將嘔吐毒素免疫親和柱插在氣控操作架的注射器上，將10.0 mL的醫(yī)用注射器連接在親和柱上，調(diào)節(jié)開關(guān)使親和柱保護液以約1 d/s的流速全部通過免疫親和柱。吸取2.5 mL上述上清液注入醫(yī)用注射器中，直至上清液全部通過，用20.0 mL蒸餾水洗滌免疫親和柱，流速約為1 d/s或2 d/s，直到蒸餾水全部通過。將親和柱從操作架取下、吹干。

2.3 樣品洗脫

液體排干后，將1.0 mL的甲醇注入親和柱中，精確地把嘔吐毒素從親和柱上洗脫下來，流速約為1 d/s，所有的洗脫液收集在干凈的玻璃管中，并在50～60℃加熱條件下用氮氣吹至干燥，殘留物用1mL流動相復(fù)溶，并用0.22μm的有機濾膜過濾至樣品瓶中，上液相色譜進行分析。

2.4 嘔吐毒素標準溶液配制

試驗使用質(zhì)量濃度為50μg/mL嘔吐毒素標準溶液，加入流動相稀釋為0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0μg/mL，用作試驗的6個標準工作液。

2.5 液相色譜條件

C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；液相色譜檢測器：熒光檢測器；流動相：甲醇-水（20∶80）；柱溫：25℃；流動相流速：1.0 mL/min；進樣量：20μL；定量利用的是曲線的峰面積，定性利用的是保留時間[22]。

2.6 樣品測定

飼料測定液和6支標準工作液進液相色譜進行分析，可得嘔吐毒素質(zhì)量濃度，在此基礎(chǔ)上求得豬飼料中嘔吐毒素的最終含量。

2.7 嘔吐毒素含量的計算公式

式中：X——飼料中嘔吐毒素含量，mg/kg；

p——飼料測定液中嘔吐毒素質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——飼料測定液最終定容體積，mL；

m——飼料稱樣量，g；

V1——提取液體積，mL；

V2——用于凈化的溶液體積，mL。

3 結(jié)果與分析

3.1 不確定度來源分析

根據(jù)檢測過程及嘔吐毒素含量計算公式分析，認定嘔吐毒素含量的不確定度來源主要是標準品工作液及配置、稱量飼料、飼料均勻性、處理過程的飼料回收率、測量重復(fù)性、體積量取、定容和分析儀器引入的不確定度。

3.2 相對標準不確定度分量的分析

3.2.1標準品工作液及配置引入的相對標準不確定度

（1）標準品濃度引入的不確定度。不同廠家生產(chǎn)的標準物質(zhì)濃度或純度會有一些差異，因此由此所帶來的不確定度也不同。該方法使用的是嘔吐毒素標準品，標準證書上會標明嘔吐毒素的濃度及誤差。查找標準證書可知其純度為0.996，最大允許誤差為±0.004，按均勻分布計算，則濃度帶來的標準不確定度U(c)和相對標準不確定度Urel(c)分別為：

（2）標準工作液配置引入的不確定度。在配置標準工作液過程中，使用的移液槍和容器等均存在誤差。根據(jù)《化學(xué)分析中的不確定度的評估指南》（CNAS-GL06）[23]可分析不確定度來源，根據(jù)國家計量技術(shù)規(guī)范《測量不確定度評定與表示》[24]可知誤差是怎樣表示的，從而根據(jù)標準證書上的誤差計算出工作液配置過程中所用容器引入的不確定度。

在配置中間標準溶液時，使用到的移液槍量程分別為200μL，1 mL，容量瓶體積為10 mL。根據(jù)《常用玻璃量具檢定規(guī)程》和《移液槍檢定規(guī)程》[25-26]的要求，可知1 mL的移液槍，它的最大允許誤差為±0.01 mL。按均勻分布計算，可得其產(chǎn)生的不確定度U(V3)和相對標準不確定度Urel(V3)：

試驗采用的10 mL容量瓶，由以上規(guī)程可知其最大允許誤差為±0.02 mL。按均勻分布計算，可得其產(chǎn)生的不確定度U(V4)和相對標準不確定度Urel(V4)：

使用的200μL移液槍，由玻璃量具使用規(guī)程可知其最大允許誤差為±3μL，按均勻分布計算，可得到其產(chǎn)生的不確定度U(V5)和相對標準不確定度Urel(V5)：

在整個試驗操作過程中，室溫變化會使液體體積發(fā)生變化，從而產(chǎn)生不確定度U(Vt)。因此計算室溫變化產(chǎn)生的不確定度，可通過估計室溫波動范圍和此室溫下體積膨脹系數(shù)計算，因液體膨脹系數(shù)遠大于玻璃，所以玻璃的膨脹系數(shù)可忽略不計。實驗室溫度一般在±2℃范圍變動[27-28]，溶劑以水為代表，液體膨脹系數(shù)在20℃時為a=2.1×10-4，則：

所以，標準工作液配置引入的不確定度Urel(V配置)為：

綜上可知，標準品工作液及配置引入的不確定度Urel標準品為：

3.2.2 樣品稱量引入的相對標準不確定度

在樣品稱量過程中需要使用電子天平，根據(jù)JJG 98—1990《非自動天平檢定規(guī)程》，使用最大允許誤差為±0.01 g，感量為0.01 g的天平，不確定度按均勻分布計算，從而得到U(m)和Urel(m)分別為：

3.2.3 樣品均勻性引入的相對標準不確定度

從飼料樣品袋中取上下左右中間5個方位的樣品，測定其嘔吐毒素含量。測得嘔吐毒素的含量分別為0.768，0.702，0.782，0.803，0.786 mg/kg，這5個含量的平均值A(chǔ)為0.768 mg/kg，標準偏差SA為3.90%。由計算可得樣品均勻性引入的不確定度U(A)和相對標準不確定度Urel(A)分別為：

3.2.4 樣品處理過程的回收率引入的相對標準不確定度

取不含嘔吐毒素的空白豬飼料作為樣品，向樣品中添加一定含量的嘔吐毒素，通過測定嘔吐毒素的含量來計算回收率，再根據(jù)數(shù)學(xué)模型計算出回收率產(chǎn)生的不確定度。取5份10 g的飼料樣品，加入含量為1.0 mg/kg的嘔吐毒素。處理后測得嘔吐毒素含 量 分 別 為0.916，0.842，0.896，0.839，0.901，0.890 mg/kg；回收率分別為91.6%，84.2%，89.6%，83.9%，90.1%，89.0%。平均回收率R為88.1%，標準偏差SR為3.20%，回收率引入的不確定度U(R)和相對標準不確定度Urel(R)分別為：

3.2.5 測量重復(fù)性引入的相對標準不確定度

稱取一份10 g的空白飼料，加入含量為1.0 mg/kg的嘔吐毒素，重復(fù)測定6次嘔吐毒素含量，分別為0.916，0.923，0.916，0.916，0.905，0.921 mg/kg。平均值X=0.916 mg/kg，標準偏差SX為0.6%，U(X)和Urel(X)分別為：

3.2.6 體積量取引入的相對標準不確定度

根據(jù)JJG 196—2006，可知50 mL量筒的最大允許誤差為±0.25 mL，U(V6)和Urel(V6)分別為：

根據(jù)JJG 646—2006，知5 mL移液槍的最大允許誤差為±0.025 mL，U(V7)和Urel(V7)分別為：

由體積量取引入的合成相對不確定度為：

3.2.7 定容引入的相對標準不確定度

樣品洗脫階段，洗脫液用氮氣吹干，用量程1 mL的移液槍往殘留物中準確加入1 mL流動相溶解定容。由前述規(guī)程可知此移液槍的最大允許誤差為±0.01。所以，在定容階段引入的不確定度U(V定容)和Urel(V定容)分別為：

3.2.8 分析儀器引入的相對標準不確定度

試驗所使用的分析儀器為LC/20A高效液相色譜儀，其擴展不確定度為10%，k=2（由山東省計量測試技術(shù)研究院出具的校準證書），則由液相色譜儀引入的相對標準不確定度Urel(E)為：

3.3 相對標準不確定度的合成及擴展

3.3.1 各相對標準不確定度分量匯總

相對標準不確定度分量表見表1。

表1 相對標準不確定度分量表

依據(jù)表1數(shù)據(jù)，可計算其合成各相對標準不確定度為：

合成不確定度為：

3.3.2 擴展不確定度

按k=2計算，其擴展不確定為：

測得此品牌豬飼料中嘔吐毒素的結(jié)果表示為：

4 結(jié)論

采用液相色譜法測定豬飼料中的嘔吐毒素，當飼料取樣量為10.0 g，k=2（95%置信度）測得的嘔吐毒素含量為0.768±0.0912 mg/kg。通過對各個不確定分量分析可以看出，標準品工作液及配置過程、體積量取過程和分析儀器是該方法不確定度的主要來源。通過評定試驗過程的不確定度，可以有效地減少試驗過程中的偏差，達到準確檢測樣品結(jié)果的目的。