郭曉宇，丁 德

（1.吉林工程職業(yè)學(xué)院，吉林四平 136001；2.吉林省禾豐種豬繁育有限公司，吉林四平 136100）

液體發(fā)酵飼料通常指將飼料與水按照一定比例均勻混合發(fā)酵而成的飼料，含水量通常在60%以上，采用液體輸送系統(tǒng)進(jìn)行飼喂。發(fā)酵所用菌種主要是乳酸菌。相對(duì)于固體發(fā)酵飼料，液體發(fā)酵飼料含水量高，發(fā)酵產(chǎn)生的酸香味更濃，適口性好；液體發(fā)酵更有利于益生菌的快速生長(zhǎng)繁殖，增強(qiáng)其益生作用，提高飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率，并能有效抑制或殺滅病原微生物（沙門氏菌和大腸桿菌）。另外，液體飼料不存在粉塵現(xiàn)象，也能避免豬群發(fā)生呼吸道疾病。本試驗(yàn)研究植物乳桿菌在不同溫度下發(fā)酵液體飼料，對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)成分、乳酸、乙酸、丙酸等揮發(fā)性脂肪酸以及乳酸菌活菌數(shù)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 植物乳桿菌（活菌數(shù)＞109CFU/g）和釀酒酵母（活菌數(shù)＞109CFU/g）由北京某生物有限公司提供。試驗(yàn)所用試驗(yàn)為生長(zhǎng)育肥豬全價(jià)配合飼料，參照《NY/T 65-2004 豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》配制，飼料配方及營(yíng)養(yǎng)成份見表1。

表1 飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)分別設(shè)定20、25、30℃三個(gè)發(fā)酵溫度，每個(gè)發(fā)酵溫度設(shè)置6個(gè)重復(fù)。每個(gè)重復(fù)準(zhǔn)確稱取100.0 g配制好的全價(jià)配合飼料，裝入250 mL發(fā)酵瓶（瓶蓋安裝有水封式單向排氣閥）中，添加適量的干凈溫水，調(diào)節(jié)飼料含水量至60%，然后按照1%的比例接種植物乳桿菌和酵母菌（植物乳桿菌∶釀酒酵母=1∶1）至液體飼料中，攪拌均勻，蓋緊瓶蓋后分別放置在恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵24 h。

1.3 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.3.1 飼料中營(yíng)養(yǎng)成分 發(fā)酵結(jié)束后，將飼料樣品置于烘箱中，105℃下30～60 min，然后調(diào)節(jié)烘箱溫度為65℃，烘至24 h以上，制成風(fēng)干樣品待用。飼料中水分、粗蛋白質(zhì)（CP）、粗纖維（CF），分 別 采 用GB/T 6435-2014、GB/T 6432-2018、GB/T 6434-2006的方法測(cè)定。總能（GE）使用能量測(cè)定儀測(cè)定。

1.3.2 pH、乳酸及揮發(fā)性脂肪酸 發(fā)酵結(jié)束后立即取適量樣品測(cè)定液體飼料中的pH、乳酸和揮發(fā)性脂肪酸含量。pH用pH計(jì)測(cè)定；乳酸含量的測(cè)定采用對(duì)羥基聯(lián)苯比色法；乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸含量的測(cè)定采用高效液相色譜測(cè)定。

1.3.3 活菌數(shù) 發(fā)酵結(jié)束后立即無(wú)菌移取適量液體飼料樣品，然后充分搖勻，用滅菌后的吸管吸取25 mL樣品放入裝有225 mL生理鹽水的無(wú)菌三角燒瓶中，三角燒瓶中放置適量的無(wú)菌玻璃珠，充分振蕩搖勻，制成1：10的樣品勻液，然后采用GB 4789.35-2010的方法測(cè)定乳酸菌活菌數(shù)，采用GB 4789.15-2016的方法測(cè)定酵母菌活菌數(shù)，采用GB/T 13091-2018的方法測(cè)定沙門氏菌活菌數(shù)，采用GB/T 18869-2019的方法測(cè)定大腸桿菌活菌數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan’s 法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用“平均值與標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)飼料中常規(guī)成分的影響 由表2可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，飼料中粗蛋白質(zhì)含量顯著提高（P＜0.05），粗纖維含量均無(wú)顯著變化（P＞0.05），總能顯著降低（P＜0.05）。

表2 不同發(fā)酵溫度對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)成分的影響（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

2.2 對(duì)pH、乳酸及揮發(fā)性脂肪酸的影響 由表3可知，隨著發(fā)酵溫度升高，液體飼料pH顯著下降，表明在適宜溫度條件下，溫度越高，產(chǎn)酸速度越快。25和30℃發(fā)酵時(shí)，液體飼料中乳酸的含量顯著高于20℃組（P＜0.05），但25和30℃之間差異不顯著（P＞0.05）；25和30℃發(fā)酵組的乙酸和丙酸含量顯著高于20℃發(fā)酵組（P＜0.05），而25和30℃發(fā)酵組之間的丙酸含量差異不顯著（P＞0.05），乙酸含量則25℃發(fā)酵組高于30℃發(fā)酵組（P＜0.05）。丁酸含量則隨發(fā)酵溫度的升高而顯著降低（P＜0.05）。

表3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)飼料pH、乳酸及揮發(fā)性脂肪酸的影響

2.3 對(duì)活菌數(shù)的影響 由圖1可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，液體飼料中乳酸菌和酵母菌活菌數(shù)顯著升高（P＜0.05），其中25和30℃發(fā)酵組酵母菌活菌數(shù)無(wú)顯著差異。表明在20℃的發(fā)酵溫度下，乳酸菌和酵母菌的生長(zhǎng)繁殖速度較25和30℃慢。不同發(fā)酵溫度下的液體飼料中均未檢出沙門氏菌和大腸桿菌。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)飼料中乳酸菌活菌數(shù)的影響

3 討論

3.1 不同發(fā)酵溫度對(duì)液體發(fā)酵飼料中營(yíng)養(yǎng)成分的影響 液體發(fā)酵飼料含水量高，飼料含水量通常在60%以上，更符合豬的消化生理特點(diǎn)，更易采食、消化和吸收。其發(fā)酵方式通常包括自然發(fā)酵、接種菌株發(fā)酵和保留式發(fā)酵等。本試驗(yàn)采用的是接種菌株發(fā)酵，接種的菌株包括植物乳桿菌和釀酒酵母菌等。厭氧條件下，植物乳桿菌可產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸，而釀酒酵母可產(chǎn)生二氧化碳和酒精等。試驗(yàn)使用植物乳桿菌和釀酒酵母為主的復(fù)合菌制劑，將含水量為60%的飼料置入帶有單向排氣閥的發(fā)酵瓶中，在不同溫度條件下發(fā)酵。結(jié)果表明，發(fā)酵溫度升高至25℃以上時(shí)，液發(fā)酵飼料的粗蛋白質(zhì)含量顯著增加（P＜0.05），總能顯著降低（P＜0.05），但粗纖維無(wú)顯著變化（P＞0.05）。總能顯著降低的原因可能是在發(fā)酵初期，釀酒酵母利用發(fā)酵瓶中殘余的氧氣進(jìn)行發(fā)酵，好氧發(fā)酵能快速消耗可溶性糖，轉(zhuǎn)化成二氧化碳和水。隨著發(fā)酵瓶中氧氣逐漸消耗，瓶中氣體則以二氧化碳等為主，進(jìn)而轉(zhuǎn)入無(wú)氧發(fā)酵。整個(gè)發(fā)酵過程，可溶性糖分被乳酸菌和酵母菌利用，造成干物質(zhì)部分損失，因此，總能顯著下降。而粗蛋白質(zhì)提高的原因一方面是發(fā)酵過程中乳酸菌和釀酒酵母利用飼料中的可溶性糖類用于自身生長(zhǎng)帶來的干物質(zhì)損失（Canibe等，2012），間接導(dǎo)致粗蛋白質(zhì)含量升高，這種由于微生物發(fā)酵消耗部分原料，使產(chǎn)物總量減少，從而導(dǎo)致產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量的表觀值增加現(xiàn)象被稱之為“濃縮效應(yīng)”（張紅等，1996）。另一方面則是釀酒酵母本身含有大量蛋白質(zhì)，在適宜的發(fā)酵條件下，釀酒酵母大量增殖，引起飼料中粗蛋白質(zhì)的提高（張敏等，2010；尹瑋等，2008），接種乳酸菌的發(fā)酵液體飼料其粗蛋白質(zhì)含量會(huì)隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)而增加（Montagne等，2003）。而粗纖維無(wú)顯著變化的原因則可能是植物乳桿菌和釀酒酵母菌產(chǎn)生纖維素酶的能力較枯草芽孢桿菌差，對(duì)粗纖維的分解能力不足。

3.2 不同發(fā)酵溫度對(duì)pH、乳酸和揮發(fā)性脂肪酸的影響 通常干飼料的pH接近7適宜病原微生物（如大腸桿菌、沙門氏菌等）的生長(zhǎng)繁殖，而當(dāng)pH＜5時(shí)，病原微生物受到抑制，蛋白酶的活性最大。適宜條件下，發(fā)酵液體飼料通?？梢栽?4 h內(nèi)使飼料pH降到4以下甚至更低，從而可抑制潛在病原微生物的滋生，提高飼料消化率。發(fā)酵溫度則是影響液體飼料pH的重要條件。適宜的發(fā)酵溫度可促進(jìn)液體飼料的發(fā)酵，也可減少在寒冷季節(jié)由于液體飼料溫度太低對(duì)豬造成的應(yīng)激。而受多種因素影響，目前尚沒有一個(gè)最佳發(fā)酵溫度。Jensen等（1998）研究了10～30℃不同溫度條件下對(duì)發(fā)酵效果的影響，結(jié)果表明，要使pH保持穩(wěn)定，溫度必須高于15℃，25～30℃效果會(huì)更好。在發(fā)酵起始期補(bǔ)充熱量是必要的（Brooks，1999）。本試驗(yàn)采用20、25和30℃三個(gè)發(fā)酵溫度，研究發(fā)現(xiàn)，與前人結(jié)果保持一致，在30℃的條件下，飼料pH最低，20℃時(shí)pH為5.85，表明在較低發(fā)酵溫度條件下乳酸菌活性較低，需要較長(zhǎng)時(shí)間來進(jìn)行發(fā)酵和抑制其他微生物的生長(zhǎng)繁殖（Wang，2013）。液體飼料中有機(jī)酸的種類及含量能影響液體飼料發(fā)酵品質(zhì)，其中乳酸和乙酸是液體發(fā)酵飼料中最主要的有機(jī)酸，是飼料pH下降的主要原因。通常情況下，乳酸含量高能提高液體發(fā)酵飼料的品質(zhì)。本試驗(yàn)中，隨著溫度升高，pH不斷下降，其他微生物活性受到抑制，乳酸菌成為優(yōu)勢(shì)菌群，使乳酸含量逐漸增加。

3.3 不同發(fā)酵溫度對(duì)液體發(fā)酵飼料活菌數(shù)的影響 環(huán)境溫度是影響微生物快速生長(zhǎng)繁殖的重要因素之一。本研究結(jié)果顯示，隨著發(fā)酵溫度升高至25℃以上時(shí)，乳酸菌和酵母菌的活菌數(shù)顯著提高（P＜0.05）；而25和30℃的乳酸菌活菌數(shù)雖有顯著差異，但并無(wú)量級(jí)差別。試驗(yàn)所采用的植物乳桿菌最適生長(zhǎng)溫度為30～35℃，釀酒酵母的最適生長(zhǎng)溫度為20～30℃。因此，一般在最適宜的溫度范圍內(nèi)，溫度越高，越有利于微生物的生長(zhǎng)繁殖以及液體飼料的發(fā)酵。Beal等（2002）發(fā)現(xiàn)，30℃時(shí)沙門氏菌的死亡速度是20℃時(shí)的4～5倍。同時(shí)，30℃的發(fā)酵溫度條件下，6～7 h后檢測(cè)不出沙門氏菌，而在20℃時(shí)，發(fā)酵24 h后還能檢出少量沙門氏菌（Fernandes等，1990）。本試驗(yàn)在不同溫度下發(fā)酵的液體飼料中均未檢出大腸桿菌和沙門氏菌，原因可能是植物乳桿菌和釀酒酵母菌產(chǎn)生的有機(jī)酸或抑菌產(chǎn)物對(duì)其進(jìn)行了抑制。

4 總結(jié)

在適宜生長(zhǎng)范圍內(nèi)，提高植物乳桿菌和釀酒酵母的發(fā)酵溫度能顯著提高液體發(fā)酵飼料的粗蛋白質(zhì)含量，快速降低飼料pH，提高乳酸、乙酸等有機(jī)酸含量和有益菌活菌數(shù)，提高液體飼料品質(zhì)。但生產(chǎn)中維持較高發(fā)酵溫度需要消耗大量能源和成本，因此，25℃發(fā)酵更能應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。