陳奕博 楊萬明 岳愛琴 王利祥 杜維俊 王敏

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，太谷 030801；2. 晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，榆次 030619）

土壤鹽漬化是一個全球性的生態(tài)問題，會對作物產(chǎn)生嚴重的負面影響。全球鹽漬土和堿性土的面積分別為3.97 億hm2和4.34 億hm2，并且有19.5%的灌溉地和2.1%的旱地受到鹽脅迫的影響［1］。其中，我國鹽堿土面積為0.991 3 億hm2，占種植總面積的4.88%［2］，并且呈現(xiàn)局部治理、整體惡化、面積增加的趨勢。可鹽漬地作為我國重要的后備耕地，未來可開墾為農(nóng)業(yè)備用耕地。因此，對當代育種科學(xué)家而言，培育耐鹽性強的作物，可保障我國糧食生產(chǎn)安全［3］。

大豆（Glycine max（L.）Merr.）是世界范圍內(nèi)重要的油料作物和糧食作物，原產(chǎn)于中國，是當今世界最重要的植物蛋白與植物油來源［4］，近年來，我國對其需求量與進口量逐年增加。大豆通常被認為是一種鹽敏感作物，當土壤鹽度超過5 dS/m 時，大豆開始受到鹽害，更高濃度的鹽害下會出現(xiàn)減產(chǎn)，嚴重時會絕收［5］。鹽濃度過高通常是由氯化鈉引起的，它會引起2 種不同卻相互關(guān)聯(lián)的脅迫，滲透脅迫和離子脅迫［6］。在鹽濃度升高時，滲透脅迫立即發(fā)生，并抑制水分吸收和細胞擴張。鹽脅迫早期與干旱脅迫［7］相似，且對生長速率的影響大于離子毒性［8］，鹽脅迫發(fā)生一段時間后，離子脅迫的影響逐漸顯現(xiàn)，有毒的離子在植物體內(nèi)積累，增加了葉片死亡率，降低了光合作用。這些有害離子不僅直接抑制代謝，而且還通過減少有益營養(yǎng)物質(zhì)［9］的攝取而破壞離子穩(wěn)態(tài)。鹽脅迫下植物表現(xiàn)出多種癥狀，包括生長抑制、衰老甚至死亡。鹽脅迫是大豆生長發(fā)育過程中一種重要的非生物脅迫，會對其生長產(chǎn)生嚴重的負面影響。鹽漬化土壤嚴重影響著大豆的正常生長，會造成大豆產(chǎn)量低下。但隨著世界范圍內(nèi)鹽漬化的不斷加劇，且改良土壤具有比較高的成本，較難實現(xiàn)，因此，明確大豆耐鹽機制，篩選耐鹽基因，進而培育出耐鹽性優(yōu)良的大豆品種，是提高大豆產(chǎn)量的重要途徑。

早期研究表明，大豆苗期耐鹽性狀是由單個顯性基因決定，現(xiàn)有研究結(jié)果表明，大豆苗期耐鹽性狀是受多個不同基因控制的數(shù)量性狀［10］。過去幾十年來，通過正向遺傳學(xué)方法獲得大豆耐鹽QTL 或基因，一方面結(jié)合構(gòu)建高密度的分子圖譜，獲得與耐鹽基因連鎖的分子標記，尋找QTL 附近的分子標記去篩選獲取最終的目的基因；另一方面利用不同的遺傳群體、不同的定位指標及方法對大豆耐鹽性狀進行QTL 定位，運用分子標記輔助（marker assisted selection, MAS）育種技術(shù)對主效QTL 開展精細定位，從而挖掘出耐鹽相關(guān)基因，為大豆耐鹽育種提供基因資源［11］。Guan 等［12］在第3 染色體上進行精細定位，將其命名為GmSALT3，該基因定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，可以顯著提高大豆耐鹽性。Zhang 等［13］通過QTL定位確定GmCDF1為重要的候選基因，后續(xù)試驗表明該基因是大豆萌發(fā)期耐鹽性的負調(diào)控基因。通過反向遺傳學(xué)方法鑒定的大豆耐鹽基因也有很多，基因GmNHX1可將胞質(zhì)Na+轉(zhuǎn)運到液泡中［14］，在大豆中過表達和擬南芥中異源表達都可以增強轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽能力［15］。Zhao 等［16］在擬南芥中異源表達GmSOS1，可以降低Na+積累，并增加抗氧化酶活性，從而參與擬南芥耐鹽性。Wei 等［17］研究表明，GmCLC1能夠通過調(diào)控Cl-的積累增強植物耐鹽性。Chen 等［18］發(fā) 現(xiàn)GmHKT1和GmHKT1;4均 可 以 調(diào)節(jié)Na+和K+的平衡，增強轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽能力。當植物受鹽脅迫時，相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子也會參與，如一些MYB［19］、bZIP［20］、WRKY［21］、ERF［22］、NAC［23］等轉(zhuǎn)錄因子家族成員與大豆耐鹽性相關(guān)。由于構(gòu)建QTL 定位群體需要考慮多方面原因，如群體的遺傳背景、定位時的環(huán)境變化、基因與基因互作、標記的準確性。因此，在這些因素變化后，所定位到的QTL 結(jié)果也可能會隨之改變。但近年來，隨著QTL精細定位研究工作不斷深入，在了解QTL 的位置及效用機理后，將QTL 定位結(jié)果用于挖掘候選基因依然擁有可預(yù)見的前景。

前人主要利用溫室和自然環(huán)境對大豆苗期耐鹽性進行鑒定研究，定位的耐鹽QTL 大多位于N 連鎖群上，但是，由于鑒定環(huán)境的不同和遺傳群體材料遺傳背景的差異，鑒定的相關(guān)QTL 位點也存在巨大差異。

本研究以栽培大豆品種晉大53 為母本和野生大豆品種平南為父本雜交衍生的128 個株系的RIL 群體為材料，結(jié)合基于SLAF 標記構(gòu)建的高密度遺傳連鎖圖譜，再以大豆苗期鹽處理后致死濃度（plant death concentration, PDC）作為耐鹽指標，對連續(xù)2年大豆苗期耐鹽性進行QTL 分析。發(fā)掘控制大豆苗期耐鹽性的新QTL 位點，為大豆耐鹽性的遺傳改良提供參考，促進耐鹽基因在大豆耐鹽育種中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

所用RIL 群體由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆種質(zhì)創(chuàng)新與利用實驗室提供，母本栽培大豆晉大53 和父本野生大豆平南。通過單粒傳法獲得由128 個株系組成F2：12重組自交系群體。

1.2 方法

1.2.1 遺傳圖譜的構(gòu)建 應(yīng)用北京百邁科生物科技有限公司自主研發(fā)的SLAF-seq（Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing）技術(shù)［24］和High Map軟件［25］對大豆128 份重組自交系群體開發(fā)高密度分子標簽，根據(jù)大豆參考基因組大小、GC 含量，選擇酶切方案。根據(jù)選定的酶切方案，分別對檢測合格的各樣品基因組DNA 進行酶切試驗。處理后選取質(zhì)檢合格的酶切片段（SLAF 標簽）進行測序。獲得各個樣品的reads，通過對reads 進行評估，使用reads 間聚類的方法，在親本和子代中開發(fā)SLAF 標簽。最后利用多態(tài)性的SLAF 標簽，構(gòu)建遺傳圖譜，并進行圖譜評估。

1.2.2 大豆苗期耐鹽性鑒定 2020-2021年連續(xù)2年在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)旱棚內(nèi)進行試驗，采用王聰?shù)龋?6］方法進行，將大豆種子播種于35 穴的育苗盤中，蛭石與滅菌土等比例混合后作為基質(zhì)，采用隨機區(qū)組設(shè)計，重復(fù)3 次，重復(fù)內(nèi)每個家系播1 穴，每穴定苗2 株。待大豆植株長到二葉一心期時，用130 mmol/L NaCl 溶液進行逆境處理（即開始處理時的初始濃度），每次每穴30 mL，每2 d 處理1 次，澆至320 mmol/L NaCl 時（即所有家系均死亡時的最大濃度），試驗完成。

1.2.3 表型數(shù)據(jù)的調(diào)查和分析 待大豆長至二葉一心期開始脅迫處理，每2 d 統(tǒng)計一次，及下次脅迫處理前進行統(tǒng)計，記錄每個家系死亡時NaCl 的濃度，直到該家系所有植株全部死亡，當每個家系植株死亡，NaCl 濃度不同時，取2 個植株死亡時濃度的均值，可計算出該家系的平均致死濃度，即為致死濃度（plant death concentration, PDC），然后以各個家系的致死濃度作為耐鹽指標，致死濃度與耐鹽等級對照如表1 所示，利用SPSS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對表型值進行統(tǒng)計分析。

表1 致死濃度與耐鹽等級對照表Table 1 Comparison between plant death concentration and salt tolerance grade

1.2.4 QTL 定位分析 以復(fù)合區(qū)間作圖法作圖，以LOD=2.5 為閾值對QTL 進行定位分析。LOD 值≥5.0 即可認為該區(qū)間存在一個上位性QTL，并計算QTL 的加性效應(yīng)、上位性效應(yīng)及表型貢獻率。QTL 命名方法后面的數(shù)字為染色體編號，參照McCouch 等［27］方法。PDC Ⅰ、PDC II、PDC Ⅲ、PDCA 分別表示致死濃度重復(fù)一、致死濃度重復(fù)二、致死濃度重復(fù)三和3 次致死濃度平均值。

2 結(jié)果

2.1 SLAF-seq文庫構(gòu)建

對參考物種基因組（Glycine maxCv. Williams 82.a2.v1）序列進行電子酶切預(yù)測，根據(jù)酶切方案選擇原則，選擇的酶為HaeⅢ，酶切片段長度為264-364 bp 的序列定義為SLAF 標簽，預(yù)測可得到114 027 個SLAF 標簽，位于重復(fù)序列區(qū)的SLAF 標簽比例為7.11%，SLAF 標簽在基因組各染色體上分布基本均勻，酶切方案可行。對測序數(shù)據(jù)進行，共獲得260 187 738 reads（52.02 Gb）數(shù)據(jù)，測序平均Q30 為89.24%，平均GC 含量為41.04%，樣本GC分布正常。綜上所述，數(shù)據(jù)比對效率、酶切效率和質(zhì)量均達到目的要求。

2.2 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

在進行SLAF 標簽文庫構(gòu)建時，共獲得140 864個SLAF 標簽，其中，多態(tài)性SLAF 標簽有44 298 個，可以用于遺傳圖譜構(gòu)建的標簽有33 742 個，親本有效多態(tài)性為23.95%。為保證遺傳圖譜質(zhì)量，將多態(tài)性SLAF 標簽進行過濾，終得到可用于作圖的SLAF標簽8 223 個。將篩選出的8 223 個SLAF 標簽，及山西農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆種質(zhì)創(chuàng)新與利用實驗室提供的可以比對到參考基因組上的SSR 標記39 個共8 266 個，一起進行分群。通過與大豆參考基因組的定位將SLAF 標簽分為20 個連鎖群，以連鎖群（每條染色體）為單位，獲得連鎖群內(nèi)Marker 的線性排列，并估算相鄰Marker 間的遺傳距離，進行連鎖圖譜的構(gòu)建。最終，得到一張包括20 個連鎖群共7 945 個Marker的連鎖遺傳圖譜（圖1），該圖譜總圖距為3 148.46 cM，標記完整度為99.56%。各個連鎖群Marker 數(shù)目、總圖距、平均圖距、最大Gap 和Gap<5 cM 的比例基本信息統(tǒng)計如表2 所示，其中，第18 染色體的標記數(shù)最多（740 個），第1 染色體的標記數(shù)最少（57個）。標記間平均距離最大值為3.30，最小值為0.25，分別位于第16 染色體上和第4 染色體上。最大Gap在第18 染色體上，值為27.09，最小在第17 染色體上，值為6.87。

表2 染色體標記信息Table 2 Chromosome marker information

圖1 遺傳圖譜結(jié)果圖Fig. 1 Genetic map results

2.3 大豆苗期耐鹽性表型分析

為利用親本平南和晉大53 進行大豆耐鹽性的QTL 定位研究，對雙親連續(xù)2年不同環(huán)境PDC Ⅰ、PDC II、PDC Ⅲ和PDCA 等4 個耐鹽指標差異進行分析，2年內(nèi)，晉大53 的PDC Ⅰ、PDC Ⅲ、PDC II和PDCA 的4 個指標均顯著高于平南（P<0.05）。

在2年不同環(huán)境下，RIL 群體中各株系的致死濃度（PDC）在160-320 mmol/L 都有分布，且呈連續(xù)分布規(guī)律，符合數(shù)量性狀的特點，從親本致死濃度在群體內(nèi)的分布來看，存在雙向超親遺傳規(guī)律，這也是數(shù)量遺傳的典型特征。其中，2020PDC Ⅰ的變異系數(shù)最大，為35.1，2020PDCA 的變異系數(shù)最小，為22.1，正態(tài)分布的適合性檢驗結(jié)果表明，2年內(nèi)致死濃度的偏度和峰度的絕對值均小于1。以上結(jié)果表明，耐鹽性狀是一種數(shù)量性狀，RIL 群體耐鹽相關(guān)性狀數(shù)據(jù)適合QTL 定位（表3，圖2）。

圖2 RIL 群體耐鹽性狀頻次分布Fig. 2 Frequency distribution of salt tolerance traits in RIL population

表3 RIL 群體中苗期表型統(tǒng)計Table 3 Phenotypic statistics of RIL population at seedling stage

2.4 RIL群體耐鹽指標的相關(guān)性分析

通過對2020-2021年RIL 群體苗期耐鹽性狀進行相關(guān)性分析（表4）發(fā)現(xiàn)，2020PDC Ⅰ、2020PDC II、2020PDC Ⅲ、2020PDCA 各性狀間多呈顯著正相關(guān)，表明鹽脅迫對大豆植株的影響是同向的。由相關(guān)性分析可知，2020PDC Ⅰ與2021PDC Ⅰ的相關(guān)系數(shù)為0.651，2020PDCA 與2021PDCA 的相關(guān)系數(shù)為0.415 5，各指標間呈正相關(guān)關(guān)系。綜合2年結(jié)果，鹽脅迫對于大豆表型耐鹽性狀影響是一致的，且2年各性狀之間相關(guān)性較高，表明不同的自然環(huán)境對大豆苗期耐鹽性狀影響不大，說明128 個家系的耐鹽指標可用于大豆苗期耐鹽性的QTL 定位。

表4 耐鹽性狀的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of salt tolerance traits

2.5 大豆苗期耐鹽性的QTL定位

通過對2年128 份RIL 群體耐鹽性狀相對值進行QTL 定位分析（圖3），2年共檢測到12 個相關(guān)性狀的QTL 位點，分布于第2、3、5、7、9、11、13、15、18 和20 染色體上（表5）。2020年耐鹽性狀共定位到7 個QTL，分布在7 條染色體上，其中，第7 染色體上存在2 個位置相近的QTL 位點，性狀的遺傳變異解釋率為24.58-31.84。2021年耐鹽性狀共定位到5 個QTL，分布于5 條染色體上，其中，第3 染色體上存在2 個位置相近的QTL 位點，性狀的遺傳變異解釋率為31.22-31.22。通過比較2年各性狀定位到的QTL，在第3 染色體上定位到多個QTL 位點，集中于58.81-108.22 cM 位置區(qū)間，在第7 染色體上定位到多個QTL 位點，集中于63.68-100.65 cM 位置區(qū)間，說明PDC 作為耐鹽生理指標較準確，且在第3 染色體上可能存在耐鹽相關(guān)的穩(wěn)定QTL。對于QTL 加性效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，2020年qPDC15 為0.71，qPDC7-1 為1.28，qPDC2 為0.42，qPDC7-2 為0.97，2021年qPDC3-1 為0.58，qPDC9為1.20，qPDC20 為0.89，且皆為正值，說明這些位點增效基因來自父本平南，其他QTL 為負值，說明其他位點的增效基因主要來自母本晉大53（表5）。

表5 大豆苗期耐鹽性狀QTL 分析Table 5 Analysis of QTL associated with salt tolerance in soybean seedling

圖3 大豆苗期耐鹽各性狀的QTL 分布Fig. 3 QTL distribution of salt tolerance traits in soybean seedling stage

2.6 上位性QTL定位

檢測到1 對與苗期耐鹽相關(guān)的上位性位點（表6），該位點存在于第20 染色體的Marker174 668-Marker200 562，LOD 值為5.18，貢獻率為33.32，上位性效應(yīng)為0.89。

表6 大豆苗期的上位性位點Table 6 Epistatic loci of soybean at seedling stage

3 討論

目前，在大豆耐鹽QTL 定位和耐鹽機制等方面取得很多進展［28］。近年來，大量研究使用大豆種內(nèi)或種間重組自交系群體，在不同年份，不同地點，重復(fù)多次進行QTL 定位，這樣定位到的結(jié)果比較可靠，前人普遍使用沙培或土培的方式進行耐鹽性鑒定，調(diào)查的耐鹽性狀大多為葉片SPAD 值、耐鹽系數(shù)、葉片受害面積等指標，這些鑒定方式和指標存在一定的合理之處，但也存在許多局限性，為了更好地反映大豆耐鹽性，采用致死濃度作為耐鹽指標進行調(diào)查。通過對2年耐鹽性狀的QTL 定位結(jié)果分析，各性狀定位到的QTL 分布于不同染色體的不同位置上且2年的QTL 重疊度不高，這可能是由于環(huán)境的影響造成定位結(jié)果的不穩(wěn)定。但是本研究在染色體上定位到的QTL 和前人研究結(jié)果較為一致，研究定位到的位置相近。

前人對苗期大豆耐鹽QTL 定位研究較多［29］。Lee 等［29］利用S-100×Tokoy 為親本的RILs 群體，以視覺耐鹽等級（visual salt tolerance ratings, STR）作為鹽處理后的耐鹽指標，在N 和L 連鎖群上定位 到6 個 耐 鹽QTL。Hamwieh 等［30］以JWS156-1×Jackson 為親本組成的F2群體，以葉片葉綠素含量SPAD 和STR 為指標在N 連鎖群上定位到2 個QTL，都位于Satt339 分子標記附近。Chen 等［31］以南農(nóng)1138-2×科豐1 號為親本的RILs 群體，以STR、存活時間和存活率為指標定位出8 個耐鹽QTL，分別位于7 個不同的連鎖群上。Ha 等［32］使用野生大豆品種PI4-83463 與Hutcheson 雜交獲得的106 個RILs 群體進行定位，其與耐鹽相關(guān)的QTL基因定位在第3 染色體上Satt255 與BARC-038333-10036 之間。楊燕［33］以重組自交系群體NJRIKY（科豐1 號×南農(nóng)1138-2）427 個家系為研究對象，結(jié)合構(gòu)建的包含4 737 個重組bin（分子標記）的高密度大豆遺傳圖譜，以相對根長（relative root length,RRL）和相對干重（relative dry weight, RDW）為鑒定指標，一共檢測到16 個大豆幼苗期耐鹽 QTL 位點。陳華濤等［11］以植株鹽處理后的存活時間（plant survival days, PSD）為指標，共檢測到3 個耐鹽QTL，它們分別位于B1、G 和K 三個連鎖群上。據(jù)報道在大豆不同生育時期，大豆表現(xiàn)出不同的耐鹽機制［34］。研究結(jié)果表明，第3 染色體上QTL，在大豆苗期耐鹽相關(guān)性狀定位［35］時，被多名研究人員重復(fù)檢測到。其他報道也發(fā)現(xiàn)許多與大豆耐鹽相關(guān)的新QTL。2008年，Chen 等［31］在大豆苗期耐鹽QTL 定位中，通過田間和溫室試驗定位到8 個QTL分布在6 條染色體上，在大豆第3 染色體上和第18染色體上定位到了穩(wěn)定的QTL 位點。Kan 等［36］利用由184 份F7:11組成的重組自交系，定位11 個大豆芽期耐鹽相關(guān)QTL，同時在第8 染色體上和第18 染色體上定位到了耐鹽顯著相關(guān)的QTL。在2018年，Do 等［37］使用Williams 82（中度敏鹽）和Fiskeby III（耐鹽）構(gòu)建的132 重組自交系群體進行苗期耐鹽相關(guān)研究中，在第3 染色體和第13 染色體上都定位到了耐鹽相關(guān)QTL。劉謝香［38］利用耐鹽栽培大豆中黃39 與鹽敏感野生大豆NY27-38 雜交后代衍生的142 個家系組建群體 ,定位到2 個大豆出苗期耐鹽性QTL，分別位于第6 和第14 染色體。在實際生產(chǎn)種植上，大豆苗期是大豆生長發(fā)育的重要時期，對產(chǎn)量的影響較大。了解大豆苗期耐鹽機制，挖掘耐鹽基因可能成為今后大豆耐鹽育種研究的一個重要方面。

4 結(jié)論

2020-2021年連續(xù)2年共定位到12 個QTL 位點。7 個QTL 位點具有加性效應(yīng)，1 個QTL 位點具有上位性效應(yīng)。有5 個與已報道的大豆耐鹽相關(guān)QTL 物理位置相同，其余7 個QTL 則是本研究首次發(fā)現(xiàn)的新QTL 位點。在大豆第3 染色體58 cM 處與第18染色體123.18 cM 處定位到的苗期耐鹽QTL 位點為大豆苗期耐鹽主效QTL。