盧丹妮，洪沛雄，張國超，葉燕銳

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006）

紫色桿菌素（Violacein）是一種含有雙吲哚的紫色天然色素[1]，具有抗腫瘤、抗致病菌、抗病毒、抗氧化等活性[2,3]，在食品、印染、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)都有重要的潛在應(yīng)用價值[4]。紫色桿菌素來源于紫色色桿菌（Chromobacterium violaceum）、藍黑紫色桿菌（Janthinobacterium lividum）等革蘭氏陰性細菌，其生物合成從L-色氨酸開始，先后通過vioABCDE操縱子編碼的5個酶（VioA、VioB、VioE、VioD和VioC）催化合成。紫色色桿菌、藍黑紫色桿菌[5]等天然菌種為條件致病菌，使紫色桿菌素的發(fā)酵生產(chǎn)與在食品領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制。Pemberton等[6]首次將紫色桿菌素操縱子克隆至大腸桿菌（Escherichia coli）中，但僅獲得淺紫色的菌落，未測定紫色桿菌素的產(chǎn)量。Rodrigues等[7]通過敲除trpR、tnaA、sdaA基因，過表達莽草酸途徑中aroFBL和tktA等多步遺傳操作，提高大腸桿菌內(nèi)的L-色氨酸含量，使脫氧紫色桿菌素的產(chǎn)量提高到了277 mg/L。蔣培霞等[8]選用來源Duganellasp.B2菌株的紫色桿菌素基因，并在大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）和弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）等革蘭氏陰性細菌中進行紫色桿菌素的異源合成，結(jié)果顯示在弗氏檸檬酸桿菌工程菌的產(chǎn)量最高，經(jīng)優(yōu)化后可達到1.68 g/L，但該宿主是一種條件致病菌，不適合用于食品行業(yè)產(chǎn)品的工業(yè)發(fā)酵。谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）是氨基酸的主要生產(chǎn)菌，作為公認的食品安全菌株（Generally Recognized as Safe，GRAS），在食品領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用和研究。孫宏年等[9,10]將來源于藍黑紫色桿菌的紫色桿菌素操縱子重疊基因進行解耦，并在每個開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）上游添加核糖體結(jié)合位點（Ribosome Binding Site，RBS），然后克隆到中高拷貝的pEC-XK99E質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032和ATCC 21850等菌株中，在LBHIS培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵，ATCC 13032的紫色桿菌素產(chǎn)量達到約200 mg/L，而在發(fā)酵培養(yǎng)基中，ATCC 21850的紫色桿菌素產(chǎn)量約180 mg/L。本研究首先從谷氨酸棒狀桿菌天然大質(zhì)粒的復(fù)制與分配元件，構(gòu)建了新的大腸桿菌-谷氨酸棒狀桿菌低拷貝穿梭質(zhì)粒，并基于該低拷貝質(zhì)粒，初步以谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032為宿主合成紫色桿菌素，發(fā)現(xiàn)了基于低拷貝質(zhì)粒的紫色桿菌素比基于中高拷貝質(zhì)粒的紫色桿菌素產(chǎn)量更高。此外，考慮到谷氨酸棒狀桿菌基因組中存在許多可表達轉(zhuǎn)座酶的插入序列（Insertion Sequence，IS）元件，會通過轉(zhuǎn)座作用破壞外源引入的DNA，不僅限制菌種的遺傳操作，在工業(yè)生產(chǎn)中還會導(dǎo)致菌株生產(chǎn)力下降和退化的情況[11,12]，本研究也比較了基于低拷貝質(zhì)粒的紫色桿菌素操縱子在IS序列刪除的谷氨酸棒狀桿菌株中的產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)IS序列的刪除可提高紫色桿菌素的產(chǎn)量。本研究進一步對其中產(chǎn)量最高的重組菌株進行紫色桿菌素的發(fā)酵條件優(yōu)化。本研究的結(jié)果為低拷貝質(zhì)粒用于紫色桿菌素的高效合成提供了新的角度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SpeI、EcoRI、EcoRV、DpnI等DNA限制性內(nèi)切酶，賽默飛科技有限公司；DNA marker和Primer STAR Max DNA聚合酶，日本TaKaRa公司；KOD FX聚合酶，東洋紡（上海）生物科技有限公司；硫酸卡那霉素、氯霉素、IPTG（異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷），北京索萊寶科技有限公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；DNA純化回收試劑盒，南京諾唯贊公司。

實驗所用的菌株和質(zhì)粒見表1和表2。

表1 本研究所用的菌株Table 1 Strains used in this study

表2 本研究所用的質(zhì)粒Table 2 Plasmids used in this study

1.2 培養(yǎng)基的配制

LBHIS培養(yǎng)基（1 L）[13]：由LB和BHIS分別配制，使用前等比例混合而成。

LB培養(yǎng)基（1 L）：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉5 g。

BHIS培養(yǎng)基（1 L）：腦心浸液肉湯粉末37 g，山梨醇91 g。

1.3 儀器與設(shè)備

聲波細胞粉碎機購自寧波新芝生物科技責(zé)任有限公司。

T100PCR擴增儀和Gene Pulser Xcell電穿孔儀均購自美國Bio-Rad公司；Tanon-5200 Multi凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；微量紫外分光光度計NP80購自德國Implen公司；TECAN infinite M200 Pro多功能光柵酶標(biāo)儀購自德國TECAN公司；JY92-Ⅱ超

1.4 方法

1.4.1 谷氨酸棒狀桿菌低拷貝質(zhì)粒復(fù)制子的獲取

本實驗構(gòu)建的低拷貝質(zhì)粒所需的復(fù)制子序列來源于谷氨酸棒狀桿菌的pTET3[14]，包括repA、parA和parB基因，以及兩個22 bp-box序列，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并克隆至pOK12載體中，命名為pOK12CG1。參考文獻[13]的方法將pOK12CG1質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至ATCC13032，得到ATCC13032/pOK12CG1菌株。電轉(zhuǎn)化率的計算：將0.5 μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至ATCC13032后，取適量轉(zhuǎn)化液涂布在對應(yīng)抗性的BHIS平板上，30 ℃孵育2 d，每個實驗重復(fù)3次，按公式（1）計算菌落個數(shù)并得出轉(zhuǎn)化效率。

式中：

a——電轉(zhuǎn)化效率；

b——菌落總數(shù)；

c——DNA總量；

n——稀釋倍數(shù)。

1.4.2 質(zhì)粒相容性分析

將pXMJ19、pEC-XK99E質(zhì)粒同時電轉(zhuǎn)至ATCC 13032/pCGBACT1谷氨酸棒狀桿菌感受態(tài)，涂布至含有卡那霉素（Kanamycin，Km）和氯霉素（Chloramphenicol，Cm）的BHIS（Km質(zhì)量濃度 25 μg/mL，Cm質(zhì)量濃度17 μg/mL）平板培養(yǎng)，通過菌落PCR進行轉(zhuǎn)化子驗證。

1.4.3 質(zhì)粒穩(wěn)定性分析

傳代實驗步驟[15]：取ATCC 13032/pOK12CG1、ATCC 13032/pXMJ19、ATCC 13032/pEC-XK99菌株進行平板劃線活化，然后分別挑取3種單菌落至含對應(yīng)抗生素（Km質(zhì)量濃度25 μg/mL或Cm質(zhì)量濃度 17 μg/mL）的BHIS培養(yǎng)基中于30 ℃過夜生長；將其接種至10 mL無抗生素的液體BHIS培養(yǎng)基（保證初始OD600≈0.05）；將細胞在30 ℃，250 r/min培養(yǎng)24 h，每隔24 h將細胞重復(fù)轉(zhuǎn)移到新鮮的無抗培養(yǎng)基中，同時，在稀釋106倍后均勻涂布在添加或不添加抗生素的BHIS平板上，30 ℃培養(yǎng)2~3 d，每組設(shè)3個平行；通過公式（2）計算兩種平板的菌落數(shù)來計算丟失率。

式中：

d——質(zhì)粒丟失率，%；

e——無抗性平板上的菌落總數(shù)；

f——抗性平板上的菌落總數(shù)。

1.4.4 質(zhì)?？截悢?shù)測定

按參考文獻[16]的方法，采用定量PCR測定質(zhì)粒的拷貝數(shù)。計算拷貝數(shù)的公式如下：

式中：

g——質(zhì)粒與基因組的相對拷貝數(shù)；

h——基因組大小，bp；

i——質(zhì)粒DNA的量，pg；

j——質(zhì)粒DNA的大小，bp；

k——基因組DNA的量，pg。

近年來，中央及各地政府機構(gòu)加大財政投入，加強資源整合，在農(nóng)村地區(qū)開展衛(wèi)生治理、村莊環(huán)境建設(shè)、道路修建等一系列基礎(chǔ)建設(shè)工作，使得鄉(xiāng)村呈現(xiàn)出天藍、水綠、村民安居樂業(yè)的美好景象。

1.4.5 紫色桿菌素重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

采用Takara的Primer STAR Max DNA聚合酶，以pOK12CG1質(zhì)粒和pECvio質(zhì)粒為模板，分別擴增線性pOK12CG1載體片段、ID1以及ID2片段，DpnI消化過夜后，進行DNA凝膠回收，通過Gibson assembly進行組裝并電轉(zhuǎn)E.coliDH5α；提取陽性克隆的質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶EcoRV進行單酶雙酶切驗證正確后進行測序。

1.4.6 紫色桿菌素重組菌的構(gòu)建

先將測序正確的重組質(zhì)粒pCGvio電轉(zhuǎn)化至C.glutamicumATCC 13032和7株敲除不同IS序列的ATCC 13032菌株（見表1）中，涂布在無抗生素或者含有卡那霉素抗性BHIS平板上，同時將C.glutamicumATCC13032/pECvio菌株劃線活化，9組平板均置于30 ℃培養(yǎng)24 h；從BHIS平板中挑選出線紫色單克隆于對應(yīng)抗性的BHIS液體培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)并保存。

1.4.7 紫色桿菌素重組菌的發(fā)酵

在超凈工作臺中，將1.4.6中得到的8個重組菌株的陽性轉(zhuǎn)化子以及對照組C.glutamicumATCC13032、C.glutamicumATCC13032/pECvio菌株單菌落接種至裝有5 mL含相應(yīng)抗生素的液體BHIS培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h，再以1%（m/V）接種量轉(zhuǎn)接至含50 mL LBHIS培養(yǎng)基的100 mL三角搖瓶中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h后加入1 mmol/L IPTG試劑，以20 ℃、220 r/min條件培養(yǎng)72 h，獲得發(fā)酵液。

1.4.8 紫色桿菌素的檢測

圖1 紫色桿菌素的標(biāo)準曲線Fig.1 Standard Curve of violacein

（2）發(fā)酵體系中紫色桿菌素的測定：按文獻方 法[9,16]獲取紫色桿菌素的粗提乙醇溶液，使用微量紫外線分光光度計測定OD570值，按標(biāo)準曲線算出紫色桿菌素的濃度值，求出紫色桿菌素的產(chǎn)量。

1.4.9 正交法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件

本研究采用LBHIS豐富培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，以誘導(dǎo)劑添加時間、誘導(dǎo)劑（IPTG）濃度及培養(yǎng)基（LB:BHIS）比例為考察因素，按照正交設(shè)計表L9（34）設(shè)計3個因素3個水平的正交試驗，比較不同發(fā)酵條件組合對紫色桿菌素產(chǎn)量的影響。試驗設(shè)計的因素和水平見表3。

表3 發(fā)酵條件優(yōu)化因素表Table 3 Optimization factors of fermentation conditions

1.4.10 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS 19.0在線軟件進行正交實驗的單因素和多因素方差分析[17]，采用Graphpad prism 8.0軟件進行圖表的繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 低拷貝載體pOK12CG1的構(gòu)建

典型的低拷貝質(zhì)粒含有編碼分配相關(guān)蛋白的parA和parB基因、類著絲粒元件parS和編碼復(fù)制蛋白的repA基因[18,19]。谷氨酸棒狀桿菌的天然大質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)粒（一般5~10拷貝/基因組）[15]，因此可以將其復(fù)制和分配的關(guān)鍵元件用于構(gòu)建低拷貝的大腸桿菌-谷氨酸棒狀桿菌穿梭載體。由于谷氨酸棒狀桿菌大多數(shù)天然大質(zhì)粒的基因缺乏注釋，選擇注釋相對清楚的pTET3（27.8 kb）[14]作為出發(fā)質(zhì)粒。pTET3來源于谷氨酸棒狀桿菌LP-6，屬于pCG1家族，其中編碼分配相關(guān)蛋白的parA和parB基因、編碼復(fù)制蛋白的repA基因、以及pCG1家族特有的與低拷貝質(zhì)粒的復(fù)制和維持有關(guān)的22 bp-box等[20]關(guān)鍵基因/元件有明確的注釋，且分布比較集中（圖2），但其類著絲粒元件parS的序列未知。本研究選擇從repA上游300 bp到parA下游300 bp的3.7 kb序列，進行基因合成，并克隆至pOK12中，構(gòu)建得到pOK12CG1（圖3）。為了測試pOK12CG1是否可在大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌中穿梭，將其電轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032中，并以pOK12和兩個常見的大腸桿菌-谷氨酸棒狀桿菌穿梭質(zhì)粒pXMJ19和pEC-XK99E作為對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pOK12CG1的轉(zhuǎn)化效率約為104CFU/μg，與pXMJ19和pEC-XK99E的轉(zhuǎn)化效率接近，而pOK12無法轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌（圖4），說明3.7 kb序列與pOK12組成的pOK12CG1為大腸桿菌-谷氨酸棒狀桿菌穿梭質(zhì)粒。谷氨酸棒狀桿菌pCG1家族質(zhì)粒的 22 bp-box序列對于質(zhì)粒的復(fù)制和維持有重要的作 用[20,21]，而3.7 kb中含有2個22 bp-box，為證明其作用，決定從pOK12CG1載體中刪除了含有該2個 22 bp-box區(qū)域的104 bp序列，得到pOK12CG2。電轉(zhuǎn)化的結(jié)果表明，pOK12CG2比pOK12CG1載體低90倍（圖4），說明了這兩個22 bp-box序列對pOK12CG1在谷氨酸棒狀桿菌中的自主復(fù)制具有重要的作用。

圖2 pTET3復(fù)制和分配序列示意圖Fig.2 Schematic diagram of the replication and distribution sequence of pTET3

圖3 pOK12CG1質(zhì)粒圖譜Fig.3 Schematic diagram of pCG12CG1 plasmid

圖4 pOK12CG1質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化效率Fig.4 Electroporation efficiency of pOK12CG1 plasmid

2.2 pOK12CG1質(zhì)粒復(fù)制穩(wěn)定性、拷貝數(shù)與相容性分析

為評估連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中質(zhì)粒在谷氨酸棒狀桿菌宿主中的穩(wěn)定性，我們將ATCC 13032/pOK12CG1菌株接種于無抗生素的BHIS液體培養(yǎng)基中并連續(xù)傳代12 d，結(jié)果顯示，在連續(xù)傳代12 d后，pOK12CG1的平均丟失率約為56%，與谷氨酸棒狀桿菌常用的pXMJ19（~74%）和pEC-XK99E（~56%）相近（圖5），表明pOK12CG1在無抗性的培養(yǎng)基中完全仍然可以相對穩(wěn)定地復(fù)制。

圖5 pOK12CG1載體復(fù)制能力驗證Fig.5 Verification of replication ability of pOK12CG1 vector

表4 pOK12CG1載體的質(zhì)?？截悢?shù)Table 4 Plasmid copy number of pOK12CG1 vector

采用qPCR法測定了pOK12CG1、pXMJ19與pEC-XK99E質(zhì)粒的拷貝數(shù)，結(jié)果表明，中等拷貝的pXMJ19和高拷貝的pEC-XK99E的拷貝數(shù)分別為約40~90拷貝/基因組和約290~430拷貝/基因組，與文獻報道接近[22,23]，而pOK12CG1的拷貝數(shù)為3~9拷貝/基因組，與文獻報道的pTET3質(zhì)粒的拷貝數(shù)（5~10拷貝/基因組）[14]相當(dāng)，屬于低拷貝質(zhì)粒[13,24]。為研究谷氨酸棒狀桿菌低拷貝載體pOK12CG1的相容性，選擇分別基于pBL1/colE和rep/colE復(fù)制子的pXMJ19和pEC-XK99E穿梭載體作為相容性測試的質(zhì)粒，把pXMJ19（pBL1/colE復(fù)制子）、pEC-XK99E（rep/colE復(fù)制子）、pOK12CG1（pTET3/p15A復(fù)制子）依次電轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032中，并對含有3種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子進行連續(xù)7 d的傳代培養(yǎng)，菌落PCR的結(jié)果表明，說明pOK12CG1載體能與含pBL1/colE復(fù)制子和含rep/colE復(fù)制子系列質(zhì)粒相容（圖6）。

圖6 ATCC 13032菌株的轉(zhuǎn)化子菌落PCR驗證Fig.6 PCR verification of transformant colonies of ATCC 13032

2.3 紫色桿菌素低拷貝質(zhì)粒與重組菌株的構(gòu)建

通過將文獻報道的紫色桿菌素操縱子[10]克隆至低拷貝pOK12CG1中獲得pCGvio質(zhì)粒。其中紫色桿菌素操縱子由誘導(dǎo)型啟動子Ptrc控制，紫色桿菌操縱子中的每個基因上游加入了RBS序列[10]。構(gòu)建的結(jié)果如圖7a所示，構(gòu)建pCGvio質(zhì)粒所需的線性載體pOK12CG1為5 869 bp，ID1片段4 235 bp，ID2片段為4 690 bp（圖7a）。將3個片段進行Gibson assembly并電轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，在37 ℃過夜培養(yǎng)后，LB抗性平板長出紫色菌落，將平板放置20 ℃以下過夜后紫色變深（圖7c），說明質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌并生成紫色桿菌素。酶切（圖7b）、菌落PCR（圖7d）和測序的結(jié)果證明pCGvio質(zhì)粒構(gòu)建成功，質(zhì)粒圖譜如圖8所示。

圖7 pCGvio質(zhì)粒構(gòu)建Fig.7 Construction of pCGvio plasmid

圖8 pCGvio質(zhì)粒圖譜Fig.8 Schematic diagram of pCGvio plasmid

將低拷貝的pCGvio質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至8株谷氨酸棒狀桿菌菌株（ATCC 13032、ISDM023、ISDM024、ISDM02、ISDM026、ISDM027、ISDM028和ISDM029）中（菌株信息見表1），得到基于低拷貝質(zhì)粒的紫色桿菌素重組菌株ATCC 13032/pCGvio、ISDM023/pCGvio、ISDM024/pCGvio、ISDM025/pCGvio、ISDM026/pCGvio、ISDM027/pCGvio、ISDM028/pCGvio和ISDM029/pCGvio，同時將高拷貝的pECvio質(zhì)粒（與孫宏年等[9,10]報道的pEC-C-vio1質(zhì)粒相同）轉(zhuǎn)化ATCC 13032，得到基于高拷貝質(zhì)粒的紫色桿菌素重組菌株ATCC 13032/pECvio。我們將紫色桿菌素重組菌株在搖瓶中，30 ℃培養(yǎng)12 h后添加1 mmol/L IPTG，20 ℃培養(yǎng)72 h后提取紫色桿菌素，使用圖1的標(biāo)準曲線估算各重組菌株的紫色桿菌素產(chǎn)量（圖9）?？瞻讓φ站闏.glutamicumATCC 13032在發(fā)酵過程中未檢測到紫色桿菌素；紫色桿菌素重組菌株在發(fā)酵過程中可觀察到發(fā)酵液顏色變?yōu)樽仙?，其中基于高拷貝質(zhì)粒的重組菌株ATCC 13032/pECvio紫色桿菌素產(chǎn)量約為376 mg/L，比張宏年等[10]使用相同菌株和質(zhì)粒的紫色桿菌素產(chǎn)量（約200 mg/L）高88%，這一差異可能是由于我們的發(fā)酵時間（90 h）比張宏年等[10]更長（70 h）所致。有趣的是，基于低拷貝質(zhì)粒的重組菌株ATCC 13032/pCGvio紫色桿菌素產(chǎn)量 （500 mg/L）比高拷貝質(zhì)粒的重組菌株ATCC 13032/pECvio（376 mg/L）高33%。而在IS刪除的大部分重組菌株紫色桿菌素產(chǎn)量＞500 mg/L，其中ISDM023/pCGvio菌株產(chǎn)量達到了610 mg/L，比ATCC 13032/pCGvio高22%。

圖9 不同宿主中紫色桿菌素的產(chǎn)量Fig.9 The yield of violacein in different hosts

上述結(jié)果表明，基于低拷貝質(zhì)粒的谷氨酸棒狀桿菌重組菌株紫色桿菌素產(chǎn)量高于高拷貝質(zhì)粒，類似的現(xiàn)象在其它物種與其它產(chǎn)物也有報道，在E.coli中使用低拷貝質(zhì)粒合成番茄紅素的產(chǎn)量是高拷貝質(zhì)粒的2~3倍[25]，說明了在某些代謝工程中，低拷貝質(zhì)粒可能減輕了代謝符合，更利于提高細胞的生產(chǎn)能力。需提出的是谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032不是色氨酸高產(chǎn)菌株，僅在豐富培養(yǎng)基（如LBHIS）中可以高效合成紫色桿菌素，而在發(fā)酵培養(yǎng)基中的產(chǎn)量很 低[9,10]，可改用色氨酸高產(chǎn)菌株（如CICC 20192、ATCC 21850等）作為宿主，構(gòu)建高產(chǎn)紫色桿菌素的重組菌株。

2.4 紫色桿菌素的發(fā)酵條件優(yōu)化

誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)劑添加時間和培養(yǎng)溫度對紫色桿菌素的在谷氨酸棒桿菌ATCC 21850中的產(chǎn)量有直接影響[9,10]，本實驗使用的宿主為ATCC 13032，需用豐富培養(yǎng)基LBHIS進行發(fā)酵，因此選取三個主要因素：誘導(dǎo)劑添加時間、誘導(dǎo)劑濃度及培養(yǎng)基比例（VLB:VBHIS），通過設(shè)計3個因素3個水平的正交試驗來篩選合適的發(fā)酵條件[26]，結(jié)果如表5、圖10所示。

圖10 正交試驗中紫色桿菌素產(chǎn)量Fig.10 The yield of violacein in orthogonal test

表5 正交設(shè)計實驗結(jié)果Table 5 Experimental results of orthogonal design

通過表5直觀地分析得知，攜帶pCGvio質(zhì)粒的ISDM023菌株經(jīng)采用不同發(fā)酵條件進行紫色桿菌素的表達，其含量最高可達到1 007.47 mg/L；此外，由各因素的極差值大小可判斷對紫色桿菌素表達量的影響大小分別為：培養(yǎng)基比例（VLB:VBHIS）＞誘導(dǎo)劑添加時間＞IPTG濃度。

從表6的多因素方差分析結(jié)果可知IPTG濃度、誘導(dǎo)劑添加時間、培養(yǎng)基比例（VLB:VBHIS）這3個因素對于Viol產(chǎn)量的差異關(guān)系：IPTG濃度、誘導(dǎo)劑添加時間并不會對產(chǎn)量產(chǎn)生差異關(guān)系，只有培養(yǎng)基比例（VLB:VBHIS）會對產(chǎn)量產(chǎn)生顯著性差異關(guān)系（P＜0.05），進一步使用單因素方差研究該因素發(fā)現(xiàn)（表7）培養(yǎng)基比例（VLB:VBHIS）中的兩兩水平間也存在顯著性差異，說明LB與BHIS培養(yǎng)基的比例確實對紫色桿菌素的產(chǎn)量有較大影響。在最優(yōu)發(fā)酵條件下，重組菌株ISDM023/pCGvio的紫色桿菌素產(chǎn)量為1 007.47 mg/L。本研究主要采用搖瓶發(fā)酵的方法，對于補糖、溶氧、pH值等因素均無法有效控制，未充分挖掘重組菌株發(fā)酵合成紫色桿菌素的潛力，后續(xù)和進一步通過微型或小型發(fā)酵罐，對上述因素開展更為全面的發(fā)酵優(yōu)化。

表6 正交試驗的多因素方差分析結(jié)果Table 6 Results of multivariate analysis of variance of orthogonal test

表7 培養(yǎng)基比例（VLB:VBHIS）因素的方差分析結(jié)果Table 7 Results of ANOVA for the scale factor of medium (VLB:VBHIS)

3 結(jié)論

在本研究中，我們構(gòu)建的低拷貝質(zhì)粒pOK12CG1能與常用的pXMJ19和pEC-XK99E具有相容性，為谷氨酸棒狀桿菌的代謝工程改造提供更多選擇。發(fā)酵實驗結(jié)果顯示：基于低拷貝質(zhì)粒pOK12CG1的谷氨酸棒狀桿菌重組菌株紫色桿菌素產(chǎn)量顯著高于基于高拷貝質(zhì)粒pEC-XK99E的重組菌株；以IS元件刪除菌株為宿主，可以提高紫色桿菌素的產(chǎn)量，為谷氨酸棒狀桿菌菌種的進一步改良提供了參考。此外，本文通過以刪除3個IS基因的谷氨酸棒狀桿菌ISDM023菌株為宿主，低拷貝載體pCGvio為基因表達工具，構(gòu)建了一株高效合成紫色桿菌素的重組菌株ISDM023/pCGvio。使用正交實驗法對該菌株的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，最終確定最佳誘導(dǎo)劑濃度是0.75 mmol/L，最佳誘導(dǎo)劑添加時間是30 ℃培養(yǎng)18 h后，最佳LBHIS培養(yǎng)基比例為LB和BHIS體積比1:2。綜上，本研究基于低拷貝質(zhì)粒，構(gòu)建了紫色桿菌素的谷氨酸棒狀桿菌重組菌株ISDM023/pCGvio，其紫色桿菌素產(chǎn)量高于基于高拷貝質(zhì)粒的重組菌株，經(jīng)過搖瓶發(fā)酵優(yōu)化，產(chǎn)量可達到1 007 mg/mL，為谷氨酸棒狀桿菌高效合成紫色桿菌素奠定了實驗基礎(chǔ)，也為其它產(chǎn)物的高效合成提供參考。