黃治國，羅潤森，李彥中，鄧杰,3，任志強,3，衛(wèi)春會,3*

（1.四川輕化工大學釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川宜賓 644000）（2.四川江口醇隆鼎酒業(yè)有限公司，四川巴中 636400）（3.中國輕工業(yè)釀酒生物技術(shù)及智能制造重點實驗室，四川宜賓 644000）

白酒中高級醇是指三個及三個以上碳原子的一元醇，主要有異丁醇、異戊醇、異丙醇、正丙醇、正丁醇，β-苯乙醇等，是白酒中的一類主要香味物質(zhì)，也是一些香味成分的前體物質(zhì)[1,2]。適宜含量的高級醇能為白酒帶來舒適的口感與芳香，過量的高級醇含量則會使白酒口感辛辣苦澀，還對人體健康具有不利影響，飲用高級醇含量較高的白酒更容易引起上頭、惡心、眩暈等癥狀[3,4]，因此對白酒中高級醇含量的控制至關(guān)重要。

白酒行業(yè)大多按照GB/T 5009.48-2003《蒸餾酒與配制酒衛(wèi)生標準的分析方法》中有關(guān)規(guī)定，以每 100 mL飲料酒中高級醇含量不超過0.15 g（以戊醇計）或0.30 g（以異丁醇和異戊醇計）來評判酒中高級醇含量是否符合標準。我國GB 2757-1981規(guī)定白酒中高級醇含量不得高于2.00 g/L，因國外蒸餾酒高級醇含量普遍偏高，我國GB 2757在2012年取消了對高級醇的限制要求。各類白酒在釀造中均會出現(xiàn)高級醇含量偏高的現(xiàn)象，倍受青睞的小曲白酒也不例外。對多種川法小曲酒、大曲清香、麩曲清香、米香型等白酒進行風味物質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)小曲白酒高級醇含量相對較高[5]。目前，受蛋白質(zhì)分解機理影響，業(yè)內(nèi)普遍認為正丙醇的產(chǎn)生與堆積料中的耐高溫細菌有關(guān)[6]，已有研究表明酵母是高級醇的主要代謝微生物[7,8]，少數(shù)報道過芽孢桿菌產(chǎn)正戊醇、異戊醇等[9]。芽孢桿菌是白酒釀造的重要功能菌，在大曲、窖泥和酒醅中廣泛分布，為白酒釀造過程提供豐富的酶系，也對白酒風味物質(zhì)的產(chǎn)生有重要的影響[10,11]。芽孢桿菌在清香型小曲白酒的菌群中占有一定數(shù)量優(yōu)勢[12]，且地衣芽孢桿菌是清香型白酒中的產(chǎn)香功能微生物，可產(chǎn)較多乙酸乙酯，較少乳酸乙酯，符合清香型白酒“增乙降乳”的趨勢[13]，理論上將芽孢桿菌運用到小曲白酒釀造中具有一定價值。

本研究從大曲來源的13株功能芽孢桿菌出發(fā)，通過實驗室模擬液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵，對發(fā)酵產(chǎn)物的揮發(fā)性物質(zhì)進行風味分析，從中篩選出強化發(fā)酵能降低高級醇含量的芽孢桿菌，并進行菌株鑒定。然后制成芽孢桿菌麩曲，將其運用到小曲白酒釀造的小試和中試試驗，驗證其發(fā)酵性能，探究芽孢桿菌的添加對降低酒體高級醇含量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：13株芽孢桿菌均從大曲中篩選得來，現(xiàn)保存于釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，編號B1~B13；高粱、糠殼、小曲：市售；BacterialDNA Isolation Kit試劑盒，成都福際生物技術(shù)有限公司；正丙醇、異丁醇、異戊醇、正戊醇、苯乙醇（均為色譜純），上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS），美國安捷倫公司；M367983 PCR儀、ChemiDocXPS+凝膠成像儀和164-5070電泳儀，美國BIO-RAD公司；A360紫外可見分光光度計，上海翱藝儀器儀器有限公司；DM3000生物顯微鏡，德國徠卡儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株篩選

1.3.1.1 種子液制備

將純化的芽孢桿菌分別接入LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基，于37 ℃、120 r/min培養(yǎng)12 h，調(diào)節(jié)菌體OD600nm= 1.0（108CFU/mL），制成種子液，備用。

1.3.1.2 液態(tài)發(fā)酵

制備高粱營養(yǎng)液，將高粱粉100 g（過100目篩）加入至1 L沸水中糊化5 min，自然pH。在1 000 mL廣口瓶中加入800 mL高粱營養(yǎng)液，接種0.4%（m/V）市售小曲。取種子菌液10 mL，6 000 r/min離心5 min，棄上清液，留菌體沉淀，用10 mL無菌水，分次洗下菌體至廣口瓶中，密封發(fā)酵，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 d。

1.3.1.3 固態(tài)發(fā)酵

參照小曲清香白酒的釀造工藝[14]，以高粱為原料，用100 ℃水浸泡4~8 h進行潤糧，初蒸15~20 min，燜糧50~55 min，復(fù)蒸60~70 min，攤晾至40~50 ℃，加入蒸好的糠殼5%（m/V），添加0.4%（m/V）活化小曲，拌勻。25 ℃左右堆積20~24 h，添加菌液于1 000 mL廣口瓶，每瓶裝800 g酒醅，密封，25 ℃恒溫發(fā)酵7 d?？瞻讓φ战M僅添加0.4%（m/V）市售小曲進行發(fā)酵，試驗組添加0.4%（m/V）市售小曲和0.04%（m/V）芽孢桿菌，芽孢桿菌接種方式參照1.3.1.2中的方法。

1.3.1.4 總酯和高級醇含量測定

采用氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）對發(fā)酵結(jié)果中的高級醇含量與酯含量進行分析[15]。樣品測定參照GB/T 10345-2007《白酒分析方法》對酒醅進行處理后，取900 μL樣液于進樣瓶中，加入2 mg/mL的2-辛醇內(nèi)標溶液和3 mg/mL乙酸戊酯內(nèi)標溶液各50 μL，隨后自動進樣。

氣相色譜條件：毛細管色譜柱為DB-WAX（60.00 m ×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度為230 ℃；程序升溫：36 ℃保持13 min，以6 /min℃ 升溫至200 ℃，保持5 min，以10 /min℃ 升溫至230 ℃，保持10 min；運行時間共計58.333 min；載氣：99.999%氦氣，流速為1 mL/min。

質(zhì)譜條件：電子離子源EI，電子能量70 eV，采集模式全掃描，質(zhì)量掃描范圍20~550 u，溶劑延遲 3 min，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度230 ℃。

1.3.2 菌株鑒定

1.3.2.1 形態(tài)特征觀察

觀察菌株的菌落形態(tài)，并進行革蘭氏染色及芽孢染色。

1.3.2.2 生理生化試驗

針對芽孢桿菌菌種特性，進行葡萄糖分解試驗、甲基紅（MR）試驗、V-P試驗、過氧化氫酶(觸酶)試驗、淀粉水解試驗、檸檬酸鹽試驗、硝酸鹽還原試驗進行生理生化指標測定。 1.3.2.3 16S rDNA測序

使用Bacterial DNA Isolation Kit試劑盒提取所篩選菌株的基因組DNA，以此為模板，以通用引物27F、1492R進行序列擴增，反應(yīng)體系為25 μL：27F引物 1 μL、1492R引物1 μL、MIX酶12.5 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶，確定有無目的性條帶出現(xiàn)。然后將PCR產(chǎn)物寄往上海生工生物工程有限公司進行測序。測序完成后，用DNAstar軟件對測得的序列進行拼接及人工校正，在NCBI數(shù)據(jù)網(wǎng)站的GenBank中進行BLAST比對分析，選取序列相似性較高的標準菌株的基因序列，使用MEGA-X軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 小曲白酒釀造試驗

以麩皮為原料，接種目標芽孢桿菌，通過三級制曲的模式，制備芽孢桿菌麩曲[16]。參照小曲清香白酒固態(tài)釀造工藝進行小試、中試，小試采用5 L發(fā)酵容器，中試采用50 L發(fā)酵容器。試驗組分別添加0.4%市售小曲和0.04%芽孢桿菌麩曲，以只添加0.4%市售小曲為對照組，按照1.3.1.4方法對發(fā)酵產(chǎn)物中的高級醇含量與酯含量進行分析，驗證菌株B13與B8在小曲白酒發(fā)酵中降低酒體高級醇含量的功能。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 醇酯種類和高級醇代謝差異分析

功能菌株的開發(fā)與應(yīng)用對于釀造行業(yè)來說，能更好地調(diào)控白酒生產(chǎn)，提高生產(chǎn)質(zhì)量與產(chǎn)量。一般對于菌株的篩選多基于培養(yǎng)基的設(shè)計等，但是對于釀酒生產(chǎn)來說，這種試驗過于理論化，當投入實際生產(chǎn)時卻往往效果不佳，這大多是由于理論試驗于實際生產(chǎn)的差距導致，因此對于釀酒生產(chǎn)來說，篩選發(fā)酵相關(guān)的菌株，應(yīng)采取發(fā)酵試驗來進行篩選，并且盡可能與實際生產(chǎn)工藝相符合，才能更好地達到最初目的。通過固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵試驗研究13株菌參與發(fā)酵對醇酯類物質(zhì)產(chǎn)生的影響，對醇酯類物質(zhì)數(shù)量的影響如圖1，對高級醇含量的影響如圖2所示。

圖1 13株菌發(fā)酵產(chǎn)物中醇酯類種數(shù)比較Fig.1 Comparison of alcohol ester species in fermentation products of 13 strains

由圖1可知，B2、B8、B9、B13這四株菌與空白組相比，無論在液態(tài)還是固態(tài)發(fā)酵條件下，其發(fā)酵產(chǎn)醇酯類物質(zhì)種數(shù)都顯著高于空白組（P＜0.05）。由 圖2可知，B8、B10、B13在固、液發(fā)酵條件下，其發(fā)酵產(chǎn)物中高級醇含量都顯著低于空白組（P＜0.05），在確保醇酯類物質(zhì)種數(shù)增加的的情況下，菌株B8、B13對高級醇含量的降低作用最顯著，液態(tài)發(fā)酵中，B8、B13分別低至1.070 mg/mL和1.03 mg/mL，較空白組分別降低0.71和0.75 mg/mL；固態(tài)發(fā)酵中，B8、B13分別低至0.69和0.56 mg/mL，較空白組分別降低 0.41 mg/mL、0.54 mg/mL。在液態(tài)發(fā)酵中可利用氮源少，大多通過糖代謝途徑生成較高濃度的高級醇[17]，其高級醇含量普遍高于固態(tài)發(fā)酵，與試驗結(jié)果相符。通常液態(tài)法制備的小曲白酒中高級醇含量為0.60~2.50 mg/mL，固態(tài)發(fā)酵制備的小曲白酒中高級醇含量為0.50~1.80 mg/mL[18]，菌株B8與B13參與發(fā)酵后，高級醇含量在其正常范圍內(nèi)。

圖2 13株菌發(fā)酵產(chǎn)物中高級醇含量比較Fig.2 Comparison of higher alcohol contents in fermentation products of 13 strains

由上述可知，菌株B8與B13在液態(tài)、固態(tài)發(fā)酵過程中，能保持小曲白酒主體風味的情況下，增加醇酯類物質(zhì)種數(shù)，對降低小曲白酒高級醇含量作用明顯，這可能在一定程度上改善小曲白酒風味，提高小曲白酒酒質(zhì)。

2.2 芽孢桿菌鑒定

通過菌落形態(tài)觀察、生理生化試驗及16S rDNA測序分析方法，對菌株B8、B13進行菌種鑒定。兩菌株菌落特征及鏡檢如圖3所示，B8的菌落形狀不規(guī)則，呈白色不透明，表面多褶皺，中間凹陷，靠近邊緣有一圈隆起，易挑起。菌株B13的菌落呈乳白色圓形，不透明，質(zhì)感黏膩，不易挑起，表面光滑，濕潤有光澤，邊緣整齊。兩菌株革蘭氏染色與芽孢染色結(jié)果表明，均為革蘭氏陽性菌，且菌體為桿狀，兩株菌均產(chǎn)芽孢，初步判定其為產(chǎn)芽孢桿菌。

圖3 兩株菌菌落特征圖及鏡檢圖Fig.3 Microscopic examination of gram stain and spore stain of 2 strains

生理生化試驗結(jié)果如表1所示，菌株B8葡萄糖分解、甲基紅、V-P、觸酶、淀粉水解、檸檬酸鹽、硝酸鹽還原、精氨酸雙水解酶試驗結(jié)果均為陽性，菌株B13甲基紅試驗、檸檬酸鹽試驗與精氨酸雙水解酶試驗結(jié)果呈陰性，其余結(jié)果呈陽性。菌株B13不能利用檸檬酸鹽產(chǎn)生堿性化合物，具有分解葡萄糖產(chǎn)酸的能力，但分解葡萄糖產(chǎn)酸量較小，或者產(chǎn)生的酸進一步轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)（如醇、酮、醚、氣體和水等），使得甲基紅試驗結(jié)果為陰性。兩者均表現(xiàn)出良好的葡萄糖分解能力、淀粉水解能力，說明兩者均具有葡萄糖分解酶、淀粉酶，推測兩株菌在釀造環(huán)境中具有一定的生存能力。結(jié)合形態(tài)學觀察，根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》[19]初步判定菌株B8、B13為芽孢桿菌屬。

表1 兩株菌的生理生化試驗Table 1 Tests of physiological and biochemical of the 2 strains

對16S rDNA測序結(jié)果進行分析，使用MEGA 7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖4所示。菌株B8與Bacillus licheniformis具有最大的序列相似性，且發(fā)育樹上處于同一個分支，結(jié)合形態(tài)學觀察與生理生化結(jié)果，故將菌株B8鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。Bacillus velezensis與其相近種在生理生化上的區(qū)別包含精氨酸雙水解酶為陰性，結(jié)合菌株B13與Bacillus velezensis具有最大的序列相似性，發(fā)育樹上處于同一個分支，故將菌株B13鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。

圖4 鄰接法構(gòu)建的B8、B13菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain B8 and B13 16S rDNA constructed by adjacency method

Bacillus licheniformis是白酒釀造中貢獻風味的重要微生物，凌杰[20]、孟醒[21]等發(fā)現(xiàn)Saccharomyces通過產(chǎn)酸以及大分子的蛋白質(zhì)類物質(zhì)對Bacillus licheniformis生長形成抑制，結(jié)合蛋白組學，發(fā)現(xiàn)Bacillus licheniformis能影響釀酒酵母的乙醇、有機酸等物質(zhì)代謝。推測Bacillus.licheniformis的添加可能影響高級醇的代謝途徑，從而起到降低高級醇的作用。Bacillus velezensis多應(yīng)用于生物防治，關(guān)于醇類代謝研究鮮有報道，但是其為重要的釀酒功能微生物，是白酒高溫大曲的優(yōu)勢菌，具有較高的產(chǎn)蛋白酶和產(chǎn)淀粉酶能力，能通過調(diào)節(jié)代謝活性，改變大曲的原生菌群、酶活性和風味成分[22]。

2.3 小試和中試固態(tài)釀造高級醇及總酯含量分析

小試試驗可以對發(fā)酵過程進行更準確的控制，但中試試驗是將實驗室與生產(chǎn)連接的重要橋梁，是將科研成果轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力的必經(jīng)之路[23]。兩種芽孢桿菌麩曲的小試和中試釀造試驗產(chǎn)總酯與產(chǎn)高級醇結(jié)果如 圖5、圖6?？傮w上來看，兩株芽孢桿菌以麩曲形式參與到固態(tài)釀造試驗后，高級醇以及酯含量與對照組相比均存在顯著性差異（P＜0.05），高級醇含量顯著降低，酯類含量有明顯提升。對于酯含量，兩菌株分別參與發(fā)酵后，無論小試還是中試，其酯含量均高于空白組，主要表現(xiàn)為乙酸乙酯的增加，小試最高總酯含量為1.53 mg/mL，中試最高為1.20 mg/mL，兩株菌之間對比無明顯差異性。對于高級醇，菌株B13降低小曲白酒中高級醇含量能力稍優(yōu)于B8，但無顯著性差異，小試中高級醇含量最低達1.18 mg/mL，空白組為 1.80 mg/mL，降低了34.44%，中試中最低達 1.25 mg/mL，空白組為1.78 mg/mL，降低了29.87%，小試效果總體優(yōu)于中試。由于在小試中可以準確控制發(fā)酵條件，在中試放大發(fā)酵時，增加了許多其它不可控的因素，致使中試降高級醇效果整體低于小試，但兩輪次釀造試驗都能顯著降低小曲白酒高級醇的含量。由圖7所示，異丁醇、異戊醇在接種芽孢桿菌麩曲的試驗組產(chǎn)量降低最快，與只添加小曲發(fā)酵的對照組有顯著性差異（P＜0.05），芽孢桿菌強化發(fā)酵后，β-苯乙醇總體呈現(xiàn)上升趨勢，有微量的正戊醇產(chǎn)生，但其總高級醇含量顯著低于空白組，說明2株芽孢桿菌在高級醇的調(diào)控均存在著密切的相互作用關(guān)系，這對高級醇的調(diào)控有一定的貢獻。

圖5 兩種芽孢桿菌麩曲的小試釀造產(chǎn)總酯和高級醇含量情況Fig.5 The contents of total esters and higher alcohols produced by two kinds of Bacillus bran koji in pilot fermentation

圖6 兩種芽孢桿菌麩曲中試釀造產(chǎn)總酯和高級醇含量情況Fig.6 Contents of total esters and higher alcohols produced by two kinds of Bacillusfuqu in pilot fermentation

圖7 中試釀造中主要高級醇產(chǎn)量對比分析Fig.7 Comparative analysis of yield of main high alcohols in pilot brewing

目前關(guān)于小曲白酒中高級醇發(fā)酵調(diào)控的研究較少，曲冠頤等[24]通過分析固態(tài)發(fā)酵過程中菌群合成高級醇的代謝差異特征，確定Saccharomyces、Pichia與Lactobacillus是調(diào)控小曲白酒高級醇含量的主要微生物。研究表明，直接參與高級醇代謝途徑的相關(guān)基因如BAT2以及調(diào)控基因如GATA對高級醇合成具有重要影響，均可有效的調(diào)節(jié)釀酒酵母中高級醇的代 謝[25,26]，結(jié)合芽孢桿菌能影響酵母產(chǎn)醇的代謝途徑[21]， 由此推測功能芽孢桿菌的添加能降低高級醇的原因一方面可能是抑制了能調(diào)控高級醇生成的相關(guān)微生物的生長，造成菌群差異、代謝差異；另一方面可能是芽孢桿菌自身低產(chǎn)高級醇，然而釀酒酵母所產(chǎn)高級醇含量超出了芽孢桿菌對高級醇的耐受范圍，產(chǎn)生反饋機制，對高級醇代謝進行調(diào)控。此外，芽孢桿菌參與發(fā)酵會使β-苯乙醇含量增加和產(chǎn)生少量正戊醇。添加適量的B8和B13菌株到小曲白酒發(fā)酵能夠降低高級醇含量，可能是強化菌株代謝了正戊醇或β-苯乙醇等物質(zhì)，這些醇類物質(zhì)含量的增加改變或抑制了酵母代謝其它高級醇，但是目前還未有相關(guān)文獻報道過正戊醇或β-苯乙醇對高級醇的調(diào)控作用，在今后的試驗中還需進一步驗證。

由此可見，B8、B13在小曲白酒釀造中均具有一定降低高級醇含量的能力，且其風味物質(zhì)也有所增加，小試總體優(yōu)于中試，但中試釀造環(huán)境更接近實際的生產(chǎn)情況，能有效的將科研成果轉(zhuǎn)向生產(chǎn)。中試結(jié)果表明，菌株對高級醇含量最高降低率達29.87%，且低于某市售小曲白酒，驗證了芽孢桿菌強化發(fā)酵能有效的降低白酒中高級醇的含量，以期在實際生產(chǎn)中能加以運用。

3 結(jié)論

本文利用發(fā)酵試驗篩選功能菌株，通過液態(tài)釀造和固態(tài)釀造試驗，篩選得到2株可降低高級醇的優(yōu)良菌株，分別為B8（Bacillus licheniformis）、B13（Bacillus velezensis）。將功能菌株以麩曲的形式進行兩輪次釀造試驗，均能在維持小曲白酒主體風味的情況下，顯著降低小曲白酒中高級醇的含量。中試釀造中，高級醇含量變化主要變現(xiàn)為異戊醇與異丁醇的降低，以及β-苯乙醇的增加和微量正戊醇的產(chǎn)生，中試最高降低率可達29.87%，且低于某市售小曲清香型白酒成品酒中高級醇含量。通過研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌通過麩曲的形式應(yīng)用到小曲白酒發(fā)酵中是可行的，同時對降低高級醇含量和改善酒質(zhì)有一定作用，有較大應(yīng)用潛力。后續(xù)將從芽孢桿菌代謝物質(zhì)對高級醇的調(diào)控及微生物間的相互作用等兩方面進行更深入研究，以此探究其降低高級醇的機理，以期為解決小曲白酒中高級醇含量偏高問題提供理論依據(jù)，提升小曲白酒品質(zhì)。