楊復(fù)香 劉錦龍 張國(guó)慶 周愛(ài)明 李磊

（1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 湖北武漢 430070；2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所 海南?？?571101）

入侵紅火蟻（Solenopsis invictaBuren）是一種膜翅目（Hymenoptera），蟻科（Formicidae）的土棲性昆蟲(chóng)，其食性雜，攻擊力強(qiáng)，種間競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)明顯，具有較強(qiáng)的溫度適應(yīng)能力、傳播和擴(kuò)散能力[1-3]，是全球最具危險(xiǎn)性的入侵生物之一。紅火蟻原分布于南美洲[4]，2003年在中國(guó)臺(tái)灣桃園、臺(tái)北縣發(fā)現(xiàn)有紅火蟻危害；2004年底，在中國(guó)廣東吳川首次發(fā)現(xiàn)紅火蟻入侵[5]；2012年在海口和文昌發(fā)現(xiàn)紅火蟻入侵[6]；至2018年6月，紅火蟻在我國(guó)已擴(kuò)散入侵至11省317縣，且擴(kuò)散傳播速度及面積有進(jìn)一步增大趨勢(shì)[7]，對(duì)我國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，人類生活、身體健康及入侵地區(qū)的生物多樣性有重大威脅。

紅火蟻是社會(huì)性昆蟲(chóng)，其種群具有單蟻后型和多蟻后型2種形態(tài)，前者巢穴只有一只可繁殖蟻后，而后者巢穴存在多只可繁殖蟻后[8]。除此之外，2種不同形態(tài)的紅火蟻種群在蟻巢建巢與分巢方式、蟻巢規(guī)模大小、巢穴密度、蟻群結(jié)構(gòu)、種群擴(kuò)散、蟻后繁殖力、工蟻大小及攻擊性強(qiáng)弱和同巢工蟻的遺傳相關(guān)性等方面均存在一定的差異[9-11]。

紅火蟻社會(huì)型的產(chǎn)生與基因型有較大關(guān)系。Ross等[12]研究發(fā)現(xiàn)，蟻群中蟻后的數(shù)量與Pgm-3和Gp-9基因的變異有關(guān)，而Gp-9表現(xiàn)出比Pgm-3更強(qiáng)的等位基因頻率差異，是預(yù)測(cè)多蟻后型較好的指標(biāo)[13]；對(duì)Gp-9基因進(jìn)行測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，其編碼一種參與種間化學(xué)識(shí)別的信息素結(jié)合蛋白，這種遺傳因素影響蟻后的生殖表型和行為策略，并決定著工蟻是否容納蟻后。單蟻后型蟻巢工蟻Gp-9基因只攜帶B等位基因，為純合子；而多蟻后型蟻巢的工蟻Gp-9處則攜帶B和b兩個(gè)等位基因，為雜合子。Gp-9Bb基因型蟻后與Gp-9BB基因型蟻后釋放不同的化學(xué)信息物質(zhì)，Gp-9Bb基因型工蟻通過(guò)對(duì)化學(xué)信息素的識(shí)別，容納能夠產(chǎn)生相同化學(xué)信號(hào)的Gp-9Bb基因型蟻后，而排斥Gp-9BB基因型蟻后[14]。

紅火蟻社會(huì)型鑒定已有較全面的研究，具體鑒定方法有生物學(xué)觀察法[15]、蛋白質(zhì)電泳法[16]、探針?lè)╗17]、RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，特異性限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析）法[18]和基于PCR技術(shù)的分子手段[19-20]等。其中基于PCR技術(shù)的分子鑒定方法簡(jiǎn)單易行、耗時(shí)短且成功率高，僅需提取不同巢穴中工蟻的DNA，在幾個(gè)小時(shí)之內(nèi)即能完成多個(gè)巢穴的鑒定[8]。本研究以采自海南7個(gè)不同地方的紅火蟻為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，基于PCR技術(shù)的分子手段對(duì)不同蟻巢的紅火蟻Gp-9基因進(jìn)行擴(kuò)增并鑒定，以期明確海南不同地區(qū)紅火蟻蟻巢的社會(huì)型，為其防治與監(jiān)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用紅火蟻工蟻采自海南萬(wàn)寧、瓊海、?？凇⒘晁?、文昌、屯昌和儋州7個(gè)地方的不同蟻巢。采集后的工蟻用95%的酒精保存在?80℃冰箱中用于后續(xù)鑒定。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取將保存在95%酒精中的紅火蟻取出，每巢取15頭工蟻，用蒸餾水漂洗后，用TIANGEN? TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒進(jìn)行DNA提取，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA產(chǎn)物純度，紫外分光光度計(jì)（Bio Photometerplus, Eppendorf, 德國(guó)）檢測(cè)其濃度，確保DNA的OD260/OD280和OD260/OD230均在1.8~2.0。檢測(cè)完后將DNA產(chǎn)物保存于?20℃。

1.2.2 PCR擴(kuò)增引物合成參照Valles等[21]和文獻(xiàn)[8]，Gp-9B的特異性引物：26BS，5’ CTCGCCGATTCTAACGAAGGA；16BAS，5’ ATGTATACTTTAAAGCATTCCTAATATTTTGTC。Gp-9b的特異性引物：24bS，5’ TGGAGCTGATTATGATGAAGAGAAAATA；25bAS，5’GCTGTTTTTAATTGCATTTCTTATGCAG。Insert5_F1：5’ CGGAGTGCGTACGTGATCT；Insert5_R1_bSpec：5’ CCATGATCGAAAAACCGACT。引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

多重PCR擴(kuò)增與Gp-9b等位基因擴(kuò)增反應(yīng)體系均為50 μL，包括2×PCR Mix 25 μL，4種引物各2 μL，基因組DNA 50~500 ng，用ddH2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性2 min，35個(gè)循環(huán)[98℃變性10 s，55℃（Gp-9b等位基因擴(kuò)增的退火溫度為47℃）退火15 s，72℃延伸30 s]，72℃延伸5 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

以紅火蟻工蟻DNA為模板，利用Gp-9B（26BS，16BAS）和Gp-9b（24bS，25bAS）兩對(duì)特異性引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，2種社會(huì)型的基因型是不同的。多蟻后型蟻巢的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在423和517 bp處各有一條擴(kuò)增條帶，而單蟻后型蟻巢僅在517 bp處有單一條帶。Gp-9b等位基因擴(kuò)增法用Insert5_ F1和Insert5_R1_bSpec一對(duì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，多蟻后型蟻巢應(yīng)在259 bp處有單條擴(kuò)增條帶，而單蟻后型蟻巢無(wú)條帶。

用上述2種方法對(duì)在海南7個(gè)地區(qū)采集的32個(gè)蟻巢進(jìn)行鑒定，多重PCR結(jié)果顯示，32個(gè)蟻巢在500 bp上下各有一條擴(kuò)增條帶（圖1）。Gp-9b等位基因擴(kuò)增結(jié)果顯示，32個(gè)蟻巢均在250 bp左右有單一的擴(kuò)增條帶（圖2）。以上2種方法鑒定結(jié)果表明，海南7個(gè)不同地區(qū)采集的32個(gè)蟻巢均為多蟻后型蟻巢。

圖1 利用多重PCR檢測(cè)紅火蟻的社會(huì)型

圖2 利用Gp-9b等位基因擴(kuò)增法檢測(cè)紅火蟻的社會(huì)型

3 討論與結(jié)論

不同社會(huì)型的紅火蟻在蟻巢密度、種群擴(kuò)散速度等方面的差異與其防治密切相關(guān)。研究表明，紅火蟻蟻巢密度及分布決定防治方案的制定[22]；蟻巢密度越大，同一劑量茚蟲(chóng)威餌劑對(duì)蟻巢防治效果越差[23]；此外，對(duì)紅火蟻種群擴(kuò)散速度進(jìn)行監(jiān)測(cè)能提高防治的有效性[24]。因此，快速鑒定紅火蟻社會(huì)型對(duì)于紅火蟻的科學(xué)監(jiān)測(cè)及準(zhǔn)確防控具有重大指導(dǎo)意義。

Nonacs等[25]認(rèn)為，紅火蟻新入侵一個(gè)地區(qū)時(shí)，棲息地廣泛存在且符合單蟻后型繁殖行為策略，而多蟻后型的出現(xiàn)是由于入侵地區(qū)適宜筑巢地逐漸飽和。隨后的研究表明，Gp-9BB型蟻后只能依靠自身婚飛前儲(chǔ)存的能量養(yǎng)育第一代工蟻，而Gp-9Bb型蟻后則可以通過(guò)加入已存在的多蟻后型種群共同養(yǎng)育第一代[26]，且不同社會(huì)型的工蟻Gp-9基因型的差異導(dǎo)致其識(shí)別蟻后及調(diào)節(jié)蟻后數(shù)量的能力不同。在這種簡(jiǎn)單的遺傳控制下，紅火蟻表現(xiàn)出基本的社會(huì)多型性，因此具有主效作用的Gp-9單基因可以作為紅火蟻社會(huì)進(jìn)化中重要復(fù)雜行為表達(dá)的基礎(chǔ)[14]。

利用多重PCR與Gp-9b等位基因擴(kuò)增法快速鑒定紅火蟻社會(huì)型的方法已被廣泛研究報(bào)道并應(yīng)用，且鑒定結(jié)果較為準(zhǔn)確可靠[8,11]。Mescher等[27]利用Gp-9b等位基因擴(kuò)增法發(fā)現(xiàn)，南美本土的單蟻后型蟻巢占比高于多蟻后型蟻巢；Kjeldgaard等[28]鑒定了美國(guó)德克薩斯州6個(gè)紅火蟻發(fā)生地的73個(gè)蟻巢，發(fā)現(xiàn)單蟻后與多蟻后型蟻巢數(shù)量比接近1∶1。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，海南萬(wàn)寧、瓊海、海口、陵水、文昌、屯昌和儋州7個(gè)地區(qū)的32個(gè)蟻巢均為多蟻后型。羅禮智[29]根據(jù)蟻巢密度及工蟻大小等推斷我國(guó)的紅火蟻主要為多蟻后型；邵敬國(guó)等[11]對(duì)廣東、廣西、福建和湖南4個(gè)?。▍^(qū)）120個(gè)蟻巢進(jìn)行社會(huì)型鑒定發(fā)現(xiàn)，多蟻后型與單蟻后型比例約為4:1。結(jié)合前人研究與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以推測(cè)在海南省紅火蟻中多蟻后型蟻巢可能占主導(dǎo)地位，這與我國(guó)的紅火蟻以多蟻后型為主的觀點(diǎn)相符。但本研究中紅火蟻的采樣只涉及海南7個(gè)地區(qū)，并未覆蓋全海南，采集的蟻巢數(shù)量有限。因此，明確海南地區(qū)紅火蟻多蟻后型與單蟻后型蟻巢的比例及分布，還需要進(jìn)一步的大范圍采樣及鑒定。