茅佳欽，熊俞婧，方 正，陳書強(qiáng)，王曉紅

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，陜西 西安 710038)

近年來，輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)取得了飛速發(fā)展，但反復(fù)種植失敗(repeated implantation failure，RIF)仍是目前亟待解決的難題，其發(fā)生率約占行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療人群的10%[1]。目前較為公認(rèn)的RIF診斷標(biāo)準(zhǔn)是：40歲以下的婦女，接受3次及以上新鮮或解凍胚胎移植周期，至少移植4枚優(yōu)質(zhì)胚胎而未能獲得臨床妊娠[2]。其常見原因包括胚胎染色體核型異常、女性解剖結(jié)構(gòu)異常、男性因素、遺傳因素、內(nèi)分泌異常、感染及高凝傾向等[3]。

外泌體是一種直徑在40～160nm的細(xì)胞外囊泡，來源于細(xì)胞膜向內(nèi)出芽形成的胞內(nèi)小體，其在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過多種生物學(xué)過程，最終以外吐的方式排出細(xì)胞[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)外泌體可以通過其攜帶的功能蛋白、mRNA和非編碼RNA發(fā)揮細(xì)胞間通訊的功能[5]。蛻膜化是指子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞在甾體激素和多種蛻膜化誘導(dǎo)因子的作用下，增殖并分化為分泌型蛻膜細(xì)胞的過程，是胚胎植入和妊娠維持的重要環(huán)節(jié)[6]。RIF患者子宮內(nèi)膜組織中蛻膜化標(biāo)志基因胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1(insulin-like growth factor binding protein,IGFBP-1)和催乳素(prolactin，PRL)的表達(dá)下調(diào)，提示子宮內(nèi)膜基質(zhì)蛻膜化水平降低[7]。有研究證據(jù)表明外泌體在母胎界面和促進(jìn)胚胎種植、發(fā)育中發(fā)揮了重要作用，子宮內(nèi)膜分泌的外泌體異?？赡軙?huì)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性異常。此外，有研究發(fā)現(xiàn)種植失敗的不孕患者與種植成功的不孕患者相比，多種血漿外泌體miRNA的表達(dá)發(fā)生改變[8]。那么RIF患者的外周血外泌體能否通過miRNA影響子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化呢？目前這部分生物學(xué)研究仍較少。因此，本研究旨在結(jié)合RIF患者外周血外泌體miRNA的改變探究影響子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

外周血樣本取自于2021年8月1日至2021年12月31日前來空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院生殖中心就診的不孕患者，其中接受IVF治療的20名RIF患者作為RIF組，20名同期無特殊病史的不孕患者作為對(duì)照組。RIF組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡<40歲；②經(jīng)歷過3次移植周期，且至少移植過4枚優(yōu)質(zhì)胚胎但均未獲得臨床妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：①子宮解剖結(jié)構(gòu)異常；②未治療的輸卵管積水；③子宮腺肌??；④中-重度宮腔粘連；⑤夫妻任一方染色體異常。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡<40歲；②輸卵管因素不孕的患者；③對(duì)患者進(jìn)行隨訪，后續(xù)通過IVF-ET成功種植。排除標(biāo)準(zhǔn)：①以往經(jīng)歷過IVF-ET，未成功妊娠；②子宮解剖結(jié)構(gòu)異常、未治療的輸卵管積水、子宮腺肌病、中-重度宮腔粘連、夫妻任一方染色體異常。所有樣本的獲取均經(jīng)過患者及其家屬的知情同意。

1.1.2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基(不含酚紅)購自博士德公司；碳吸附胎牛血清(Charcoal stripped foetal bovine serum,CS-FBS)購自BioInd公司；胰蛋白酶、杜氏磷酸鹽緩沖液(Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline,DPBS)購自Corning公司；RNAiso Plus、SYBR?Green PCR試劑盒、PrimeScriptTMRT Master Mix購自TaKaRa公司；α-Amanitin購自MCE公司；miRNA 第一鏈 cDNA 合成(莖環(huán)法)試劑盒、熒光定量PCR 8聯(lián)管購自生工生物工程有限公司；bromo-cAMP、MPA購自阿拉丁生化科技有限公司；M-PERTMMammalian Protein試劑、RNA提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、Lipofectamine RNAiMAX試劑購自ThermoFisher Scientific公司；蛋白電泳預(yù)制膠、快速轉(zhuǎn)膜試劑盒購自Bio-rad公司；小鼠抗人TSG101、CD9、CD81、Calnexin抗體購自Abcam公司；兔抗人FOXO1抗體、CoraLite488標(biāo)記鬼筆環(huán)肽購自Proteintech公司；兔抗人β-actin購自CST公司；PKH26試劑盒購自Sigma公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)購自Equitech-Bio公司；ECL化學(xué)發(fā)光液購自默克公司；Triton X-100、DAPI購自塞維爾生物公司。

1.1.3 儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱、生物安全柜購自Thermo、NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)公司；超速離心機(jī)購自Enppendorf公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購自HERMLE公司；電泳儀、半干式電轉(zhuǎn)儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、化學(xué)發(fā)光儀購自Bio-rad公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購自美谷分子儀器有限公司；干式恒溫器購自奧盛儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡購自ZEISS公司。

1.2 主要方法

1.2.1子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)、蛻膜化誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)染

人永生化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞系(HESC)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。HESC細(xì)胞在含有10%碳吸附胎牛血清、1%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白、1mmol/L丙酮酸鈉、500ng/mL嘌呤霉素、1.5g/L碳酸氫鈉、1%青霉素和鏈霉素的無酚紅DMEM/F12完全培養(yǎng)基中以37℃、5%CO2培養(yǎng)。在誘導(dǎo)蛻膜化時(shí)，使用含有2%碳吸附胎牛血清、1μM的甲羥孕酮、0.5mmol/L的8-bromo-cAMP的DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)72h。用0.25%的胰蛋白酶消化HESC細(xì)胞3min后終止消化，800r/min離心5min，重懸細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按每孔5×105個(gè)細(xì)胞加入六孔板中，待細(xì)胞約占60%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將9μL脂質(zhì)體RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑稀釋于150μL Opti-MEM培養(yǎng)基，將3μL濃度為10μmol/L的miRNA溶液稀釋于150μL Opti-MEM培養(yǎng)基，將稀釋后的脂質(zhì)體RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑與稀釋后的miRNA溶液按1∶1的比例混合，室溫孵育5min后，每孔加入250μL混合液體，6h后換液。

1.2.2 外泌體提取、鑒定、共培養(yǎng)、示蹤

取5mL新鮮血漿，4℃條件下以500×g離心10min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中，20 000×g離心20min，取上清液，用DPBS稀釋10倍后在4℃條件下以120 000×g離心70min后棄去上清液，用DPBS重懸沉淀后再次以120 000×g離心70min，所得沉淀即為外泌體[9]。用100μL DPBS重懸外泌體后可進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)或置于低蛋白吸附管中于-80℃保存。將溶于DPBS中的外泌體用磷鎢酸復(fù)染，室溫干燥后利用透射電鏡觀察其形態(tài)，通過納米流式技術(shù)檢測(cè)其粒徑。按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒提供的說明書測(cè)出外泌體溶液的蛋白濃度，按100μg/mL的濃度添加至培養(yǎng)液中用于共培養(yǎng)。將外泌體按照PKH26熒光標(biāo)記染料說明書將外泌體染色，隨后120 000×g離心70min，重懸后加入培養(yǎng)基中過濾除菌，與HESC共培養(yǎng)24h后進(jìn)行熒光染色，鏡下觀察。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR

當(dāng)檢測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá)水平時(shí)用Thermo RNA提取試劑盒提取HESC細(xì)胞總RNA；當(dāng)檢測(cè)細(xì)胞miRNA表達(dá)水平時(shí)使用RNAiso Plus提取HESC細(xì)胞總RNA。隨后用NanoDrop 2000測(cè)量RNA質(zhì)量，再分別按照Thermo RNA提取試劑盒(反轉(zhuǎn)錄mRNA)和miRNA 第一鏈 cDNA 合成(莖環(huán)法)試劑盒(反轉(zhuǎn)錄miRNA)說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成對(duì)應(yīng)的cDNA。使用Takara試劑盒進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。在檢測(cè)外泌體miR-183-5p的表達(dá)時(shí)，在逆轉(zhuǎn)錄體系中加入0.5μL 20μM的cel-miR-39作為外源性參照物，細(xì)胞內(nèi)miR-183-5p的表達(dá)以U6作為內(nèi)參，IGFBP-1、PRL和FOXO1的表達(dá)以18sRNA作為內(nèi)參。相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCt法。引物序列為：miR-183-5p，5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGA TACGACAGTGAA-3′(逆轉(zhuǎn)錄)5′-AACAGTGTATGGCACTGGTAGA-3′(上游)，5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′(下游)。U6，5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(上游)，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′(下游)。IGFBP-1，5′-TTTTACCTGCCAAACTGCAACA-3′(上游)，5′-CCCATTCCAAGGGTAGACGC-3′ (下游)。PRL，5′-GGAGCAAGCCCAACAGATGAA-3′(上游)，5′-GGCTCATTCCAGGATCGCAAT-3′(下游)。FOXO1，5′-AAACACCAGTTTGAATTCACCC-3′(上游)，5′-TCGACTTATTGTCCTGAAGTGT-3′(下游)。

1.2.4 Western Blot檢測(cè)TSG101、CD9、CD81、Calnexin、FOXO1表達(dá)水平

用M-PERTMMammalian Protein試劑提取HESC細(xì)胞和外泌體蛋白，采用BCA法測(cè)定上清蛋白濃度。在上清中加入上樣緩沖液，95℃加熱7min，將制備好的蛋白樣品根據(jù)蛋白定量結(jié)果確定上樣量后進(jìn)行凝膠電泳分離蛋白，使用Turbo轉(zhuǎn)印系統(tǒng)將分離好的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%BSA封閉1h，加入一抗TSG101(1∶3 000)、CD9(1∶1 000)、CD81(1∶1 000)、Calnexin(1∶1 000)、FOXO1(1∶3 000)，4℃過夜。用TBST洗膜3次后加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育1h，TBST洗膜3次后浸入ECL發(fā)光液，轉(zhuǎn)移至Bio-rad發(fā)光系統(tǒng)中進(jìn)行曝光。內(nèi)參為β-actin，利用Image J軟件分析條帶的灰度值，將目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為蛋白表達(dá)量。

1.2.5 免疫熒光染色

將細(xì)胞爬片取出，PBS洗滌3次。4%多聚甲醛固定15min，PBS洗滌3次。使用2%的Triton X-100進(jìn)行破膜，5min后PBS洗滌3次。將熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽儲(chǔ)存液用PBS按1∶200的比例進(jìn)行稀釋，室溫避光孵育20min后PBS洗滌3次。DAPI室溫避光孵育5min，PBS洗滌3次，用防熒光淬滅封片劑封片。用蔡司倒置熒光顯微鏡觀察并拍攝。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次及以上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組基本資料比較

RIF組與對(duì)照組的年齡、BMI、不孕診斷、不孕因素、活產(chǎn)史及流產(chǎn)史方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組患者的基線資料Table 1 Baseline characteristics of

2.2 血漿外泌體鑒定

收集RIF組與對(duì)照組婦女的黃體期外周血血漿，通過超速離心法提取外泌體。通過透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察，鏡下可見外泌體呈茶杯托狀且具有雙層膜結(jié)構(gòu)，見圖1A。利用納米粒徑跟蹤分析技術(shù)檢測(cè)，顯示外泌體囊泡直徑在40～150nm，見圖1B。Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示外泌體特征性膜蛋白TSG101、CD9和CD81均呈陽性，陰性對(duì)照Calnexin呈陰性，見圖1C。以上實(shí)驗(yàn)提示外泌體分離成功[10]。

2.3 RIF患者血漿外泌體抑制HESC細(xì)胞的蛻膜化

誘導(dǎo)后IGFBP-1、PRL的表達(dá)水平顯著升高(t值分別為-4.438、-16.520,P<0.05)，見圖2A。同時(shí)在光鏡下，可見HESC細(xì)胞增大，外形變得不規(guī)則，細(xì)胞核亦增大，見圖2B，證明HESC細(xì)胞體外蛻膜化誘導(dǎo)成功。將血漿外泌體用PKH26染色后與HESC細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，進(jìn)行免疫熒光染色。鏡下可見，在胞質(zhì)中存在大量標(biāo)記的外泌體，證實(shí)外泌體已被HESC細(xì)胞攝取，見圖2C。將兩組外泌體與細(xì)胞共培養(yǎng)48h后，誘導(dǎo)體外蛻膜化，72h后通過qRT-PCR檢測(cè)IGFBP-1、PRL的表達(dá)情況，與對(duì)照組相比，RIF組患者血漿外泌體抑制了IGFBP-1、PRL的表達(dá)(t值分別為5.324、9.056，P<0.05)，見圖2D。表明RIF組患者血漿外泌體能夠抑制HESC細(xì)胞蛻膜化過程。

2.4 miR-183-5p在RIF患者血漿外泌體、內(nèi)膜組織中高表達(dá)

經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證，與對(duì)照組比較，RIF患者血漿外泌體miR-183-5p表達(dá)升高(t=-2.486，P<0.05)，見圖3A。為了排除細(xì)胞內(nèi)源性miRNA對(duì)miR-183-5p表達(dá)水平的影響，將HESC細(xì)胞用RNA聚合酶Ⅱ的抑制劑α-Amanitin預(yù)處理后與外泌體共培養(yǎng)24h，通過qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-183-5p的表達(dá)水平。與對(duì)照組比較，HESC細(xì)胞與RIF患者血漿外泌體共培養(yǎng)后miR-183-5p表達(dá)水平升高(t=-2.378，P<0.05)，見圖3B。與對(duì)照組比較，RIF組患者子宮內(nèi)膜組織miR-183-5p表達(dá)水平升高(t=-4.821，P<0.05)，見圖3C。

注：A.TEM觀察外泌體的形態(tài)；B.NTA分析外泌體直徑；C.Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)外泌體特征性膜蛋白TSG101、CD9、CD81與陰性對(duì)照Calnexin。

注：A.qRT-PCR檢測(cè)HESC細(xì)胞蛻膜化誘導(dǎo)后IGFBP-1、PRL表達(dá)水平(n=3)；B.光鏡下觀察HESC細(xì)胞蛻膜化誘導(dǎo)前后變化；C.免疫熒光觀察HESC細(xì)胞對(duì)血漿外泌體的攝取，DAPI(藍(lán)色熒光)為細(xì)胞核，F(xiàn)-actin(綠色熒光)為細(xì)胞骨架蛋白，PKH26(紅色熒光)為血漿外泌體；D.外泌體與HESC細(xì)胞共培養(yǎng)24h后進(jìn)行蛻膜化誘導(dǎo)72h，qRT-PCR檢測(cè)IGFBP-1和PRL mRNA表達(dá)水平(n=5)。*P<0.05，***P<0.001。

注：A.qRT-PCR檢測(cè)RIF患者與對(duì)照組血漿外泌體miR-183-5p表達(dá)水平(n=20)；B.qRT-PCR檢測(cè)血漿外泌體與HESC細(xì)胞共培養(yǎng)24h后miR-183-5p表達(dá)水平(n=5)；C.qRT-PCR檢測(cè)RIF患者與對(duì)照組內(nèi)膜組織中miR-183-5p表達(dá)水平(n=5)。*P<0.05，***P<0.001。

2.5 過表達(dá)miR-183-5p的HESC細(xì)胞蛻膜化受到抑制

將miR-183-5p的激動(dòng)劑、拮抗劑及作為對(duì)照的無義序列轉(zhuǎn)染HESC細(xì)胞，在48h后通過qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-183-5p的表達(dá)情況。與轉(zhuǎn)染了無義序列的對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染了agomir后miR-183-5p表達(dá)水平顯著升高(t=-12.310，P<0.05)，轉(zhuǎn)染了antagomir后miR-183-5p表達(dá)水平下降(t=6.169，P<0.05)，見圖4A，表明轉(zhuǎn)染成功。在HESC過表達(dá)miR-183-5p后，對(duì)其誘導(dǎo)體外蛻膜化，通過qRT-PCR檢測(cè)IGFBP-1、PRL，結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，IGFBP-1、PRL的表達(dá)水平下降(t值分別為7.510、8.115，P<0.05)，見圖4B。

注：A.qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-183-5p的agomir、antagomir 和無義序列48h后miR-183-5p表達(dá)水平(n=3)；B.qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-183-5p的agomir、antagomir和無義序列48h后并誘導(dǎo)蛻膜化后IGFBP-1、PRL mRNA表達(dá)水平(n=3)。**P<0.01，***P<0.001。

2.6 miR-183-5p通過靶向FOXO1抑制HESC細(xì)胞的蛻膜化

在Targetscan、Starbase和miRDB數(shù)據(jù)庫中檢索hsa-miR-183-5p的靶基因，通過Venn圖取交集，交集內(nèi)共有244個(gè)靶基因,見圖5A。通過DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)交集靶基因進(jìn)行KEGG富集分析，從而分析miR-183-5p影響HESC細(xì)胞哪些信號(hào)通路,見圖5B。根據(jù)富集倍數(shù)、基因數(shù)及顯著性，選取了多巴胺能突觸、心肌腎上腺素能信號(hào)通路、長(zhǎng)壽調(diào)控通路及AMPK信號(hào)通路進(jìn)行下一步研究。將miR-183-5p的agomir轉(zhuǎn)染進(jìn)HESC細(xì)胞48h后進(jìn)行蛻膜化誘導(dǎo)，72h后檢測(cè)FOXO1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，結(jié)果顯示均發(fā)生了下降(t值分別為3.120、2.793,P<0.05)，見圖5C、圖5D。

注：A.Venn圖顯示Targetscan、Starbase和miRDB網(wǎng)站的預(yù)測(cè)靶基因交集；B.KEGG富集分析；C.qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-183-5p的agomir、antagomir 和無義序列并誘導(dǎo)蛻膜化后FOXO1 mRNA表達(dá)水平(n=3)；D.Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-183-5p的agomir、antagomir 和無義序列并誘導(dǎo)蛻膜化后FOXO1的蛋白表達(dá)水平(n=3)。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

3 討論

3.1 子宮內(nèi)膜容受性與RIF的關(guān)系

RIF病因往往高度異質(zhì)，目前已知病因包括胚胎核型異常、子宮內(nèi)膜容受性異常、母胎界面免疫紊亂等。子宮內(nèi)膜容受性是指子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎的接受能力，即允許胚胎在子宮內(nèi)進(jìn)行定位、黏附、侵入等過程的能力[11]。子宮內(nèi)膜只有在特定的時(shí)間點(diǎn)才具有良好的容受性，目前普遍認(rèn)為在排卵后第6～10天。子宮內(nèi)膜容受性的提高與基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化、上皮細(xì)胞黏附、內(nèi)膜基質(zhì)血管重塑等一系列復(fù)雜的生理過程密切相關(guān)[12]。約2/3的胚胎種植失敗是由于子宮內(nèi)膜容受性受損造成的，是導(dǎo)致輔助生殖治療失敗的最大因素[13]。研究發(fā)現(xiàn)RIF患者的子宮內(nèi)膜容受性下降，其中子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化異常是影響子宮內(nèi)膜容受性正常建立的關(guān)鍵因素[14]。RIF患者的子宮內(nèi)膜組織中蛻膜化標(biāo)志物IGFBP-1和PRL的mRNA和蛋白水平均發(fā)生下降，內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖能力和蛻膜化水平發(fā)生下降[15]。有研究將RIF患者的內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其分泌PRL的能力下降。此外，RIF患者的內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞不僅蛻膜化能力受損，其分泌的外泌體能夠抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力[16]。因此，內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化受損可能是RIF發(fā)生的潛在因素。

3.2 外泌體miRNA與子宮內(nèi)膜容受性

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與子宮內(nèi)膜容受性的建立和胚胎植入過程[17-19]，對(duì)miRNA參與RIF發(fā)病機(jī)制有了新的見解。研究發(fā)現(xiàn)RIF患者與成功妊娠婦女相比，多種外周血miRNA表達(dá)水平發(fā)生改變[8]。miRNA家族中l(wèi)et-7、miR-30、miR-200、miR-17-92等多種miRNA被認(rèn)為能夠參與子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)節(jié)[20]。研究證實(shí)，子宮內(nèi)膜細(xì)胞和胚胎能夠分泌細(xì)胞外囊泡參與圍著床期子宮內(nèi)膜-胚胎之間的相互作用[21]。這些細(xì)胞外囊泡能夠通過其運(yùn)載的miRNA參與細(xì)胞間的生物學(xué)調(diào)控，影響胚胎種植窗的開放[22]。

3.3 外泌體源miR-183-5p通過靶向FOXO1抑制子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化

本研究選取了8-bromo-cAMP結(jié)合MPA對(duì)HESCs進(jìn)行體外誘導(dǎo)作為蛻膜化模型，通過檢測(cè)蛻膜化標(biāo)志物IGFBP-1、PRL基因的表達(dá)情況及F-actin的表達(dá)分布反映HESC細(xì)胞的蛻膜化程度。本研究發(fā)現(xiàn)RIF患者血漿外泌體能夠抑制HESC細(xì)胞的蛻膜化過程，結(jié)合前期的測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)RIF患者血漿外泌體中高表達(dá)miR-183-5p。為了進(jìn)一步探究血漿外泌體中的miR-183-5p能否進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用，通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了外泌體被細(xì)胞攝取。此外，為了確認(rèn)HESC細(xì)胞與RIF患者血漿外泌體共培養(yǎng)后miR-183-5p水平的升高是否與外泌體有關(guān)，我們用RNA聚合Ⅱ的抑制劑α-Amanitin預(yù)處理HESC細(xì)胞，抑制其內(nèi)源性miRNA的產(chǎn)生以排除干擾。miRNA能夠通過與靶基因mRNA的3’UTR區(qū)結(jié)合抑制靶基因的翻譯，能夠發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用[23]。為了探究miR-183-5p是通過何種途徑影響HESC細(xì)胞的蛻膜化過程，結(jié)合數(shù)據(jù)庫對(duì)其靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)。通過對(duì)交集靶基因的KEGG分析，探究miR-183-5p對(duì)HESC細(xì)胞生物學(xué)過程的影響。有研究報(bào)道，AMPK信號(hào)通路在子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中發(fā)揮重要作用[24]。富集到AMPK信號(hào)通路的基因有PPP2CA、PPP2CB、IRS1、TSC1、PPP2R2A、PPP2R5C、EEF2和FOXO1。既往文獻(xiàn)報(bào)道FOXO1、HOXA10、STAT3等基因在子宮內(nèi)膜蛻膜化和胚胎種植過程中發(fā)揮了重要作用[25]，因此我們篩選出FOXO1進(jìn)行進(jìn)一步的探究。將經(jīng)過特殊化學(xué)修飾的miR-183-5p激動(dòng)劑agomir和拮抗劑antagomir轉(zhuǎn)染HESC細(xì)胞，通過qRT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-183-5p激動(dòng)劑能夠使HESC細(xì)胞的FOXO1表達(dá)下降。

本研究首次發(fā)現(xiàn)了血漿外泌體miR-183-5p能夠影響子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化，證實(shí)了miR-183-5p通過靶向FOXO1使子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化受損，為RIF的診療提供了新的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。