張晨晨，朱曉晴，李甜，王聰聰，李鐵浪

湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208

心肌缺血是由于心臟血液供需不平衡引起的病理狀態(tài)，持續(xù)的缺血缺氧導(dǎo)致心功能紊亂，嚴(yán)重者引起心肌梗死、心力衰竭甚至死亡[1-2]。流行病學(xué)顯示，中國(guó)心血管病(cerebrovascular disease，CVD)患病率和死亡率處于持續(xù)上升階段，目前，心血管病是城鄉(xiāng)居民死亡的首要原因[3]。細(xì)胞凋亡是心肌細(xì)胞損傷的表現(xiàn)，廣泛參與心肌組織病理過程[4]，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡可能有利于阻止心肌缺血缺氧進(jìn)展性損傷。

研究表明，按法通過對(duì)特定穴位進(jìn)行刺激可以改善心肌缺血狀態(tài)。心俞穴是背俞穴之一，刺激心俞穴可以調(diào)節(jié)心臟功能[5-6]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，按壓心俞穴可以改善心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)模型兔心臟功能，延緩心力衰竭進(jìn)程[7-8]，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。因此，本研究通過制備心肌缺血大鼠模型，觀察按壓心俞穴對(duì)心肌損傷的調(diào)節(jié)作用是否與細(xì)胞凋亡相關(guān)，為臨床治療本病提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量250～280 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室倫理審批通過，倫理編號(hào)：LL2020102301。大鼠分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室，每籠3只，規(guī)律飲食，晝夜節(jié)律光照，飼養(yǎng)溫度為24～26 ℃，相對(duì)濕度 50%～70%。

1.2 藥物與試劑異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，貨號(hào)：R510-22-16，規(guī)格：100 mL)；異丙腎上腺素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：I129810)；鹽酸地爾硫卓(上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：D835096)；生理鹽水(廣西裕源藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H45020975)；TUNEL試劑盒(瑞士Roche公司，批號(hào)：11684817910)；破膜工作液、PBS緩沖液(皮諾飛生物科技有限公司，貨號(hào)：PN00014、PN0001)；DAPI染色液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：C1006)；抗熒光淬滅封片劑(美國(guó)Southern Biotech公司，批號(hào)：0100-01)；5×蛋白上樣緩沖液[四維加生物科技(武漢)有限公司，批號(hào)：8190011128]；甲醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純，純度≥99.5%，國(guó)藥編號(hào)：10014118)；大鼠心肌肌鈣蛋白-Ⅰ(cardiac troponin-Ⅰ，cTn-Ⅰ)ELISA試劑盒、大鼠肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase，MB form，CK-MB)ELISA 試劑盒、活化的半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶3(cleaved cysteinyl aspartate-specific protease 3，C-Caspase 3)抗體(武漢華美生物工程有限公司，貨號(hào)：CSB-E08594r、CSB-E14403r、CSB-PA148736)；B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)多克隆抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X，Bax)多克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：12789-1-AP、50599-2-Ig)。

1.3 儀器瑞沃德R500通用型呼吸麻醉機(jī)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；ECG-2303B型數(shù)字心電圖機(jī)(廣州市三銳電子科技有限公司)；KE0003087型移液槍、D3024R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器北京股份公司)；Epoch型酶標(biāo)檢測(cè)儀(美國(guó)BioTek公司)；DYY-6C型電泳槽(北京六一生物科技有限公司)；KZ-Ⅱ型高速組織研磨儀(武漢賽維爾生物科技有限公司)；Nikon Eclipse型正置熒光顯微鏡(日本尼康公司)；自制按法刺激器(專利號(hào)：201720875963.5)

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與造模將60只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、按法組和鹽酸地爾硫卓組，每組15只。除空白組外，其余3組大鼠參照文獻(xiàn)記錄的方法建立心肌缺血模型[9]，具體如下：于大鼠腹部皮下注射異丙腎上腺素2 mg·kg-1(濃度10 g·mL-1)，每日1次，連續(xù)注射14 d。造模前和造模結(jié)束后，用呼吸機(jī)麻醉(異氟烷麻醉：誘導(dǎo)濃度4%，維持濃度2%)大鼠后仰臥固定，連接數(shù)字心電圖機(jī)，記錄大鼠造模前和造模后Ⅱ?qū)?lián)心電圖變化，并計(jì)算J點(diǎn)位移變化(無論升高或者降低，取其變化的絕對(duì)值)，測(cè)定五個(gè)連續(xù)波型，取其平均值，以J點(diǎn)位移變化值>0.1 mv視為造模成功[10-11]。

2.2 干預(yù)方法大鼠造模完成后正常飼養(yǎng)并分別給予相應(yīng)治療。按法組：將大鼠俯臥位放置固定，操作部位局部備皮，用自制的按法刺激器，根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究得出的按法起效最佳參數(shù)[12](力量0.7 kg、時(shí)間7.5 min、頻率10次·min-1)，在雙側(cè)心俞穴上進(jìn)行按壓刺激，每天1次，每次間隔24 h，共干預(yù)7次；鹽酸地爾硫卓組大鼠腹腔注射鹽酸地爾硫卓 1.5 mg·kg-1(濃度10 g·L-1)，每天1次，每次間隔24 h，共注射7次，空白組和模型組不予處理。

2.3 心電圖監(jiān)測(cè)根據(jù)肢體導(dǎo)聯(lián)順序，連接數(shù)字心電圖機(jī)，于造模前、造模后、治療后分別檢測(cè)心電圖，記錄J點(diǎn)位移變化值。

2.4 心肌組織HE染色腹主動(dòng)脈采血后，立即解剖暴露心臟，剪掉心耳，心臟注射1 mL生理鹽水灌流2次后，取下全心，剪去多余組織，將其固定于 40 ng·L-1多聚甲醛溶液中24 h后，將固定好的心肌組織經(jīng)脫水、包埋后制備心肌組織石蠟切片，進(jìn)行HE染色常規(guī)操作，顯微鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變情況。

2.5 TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率取心肌組織制備石蠟切片，經(jīng)過抗原修復(fù)、血清封閉、滴加試劑，DAPI復(fù)染細(xì)胞核后封片，切片于倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。光鏡下正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈深淺不一的熒光綠色。切片于光鏡下400倍放大，應(yīng)用Image J圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，每張片隨機(jī)選取5個(gè)視野，對(duì)凋亡陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以心肌凋亡陽性細(xì)胞數(shù)占總心肌細(xì)胞數(shù)的百分比作為心肌細(xì)胞凋亡率。

心肌細(xì)胞凋亡率= 凋亡心肌細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%

2.6 ELISA檢測(cè)大鼠血清中CK-MB、cTn-Ⅰ的含量呼吸機(jī)異氟烷維持麻醉下，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，腹主動(dòng)脈采血，靜置2 h后離心，3 500 r·min-1離心10 min，取上清液分裝后于-20 ℃ 保存。將血清樣本從-20 ℃冰箱取出，解凍后的樣本應(yīng)再次離心，然后按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

2.7 Western Blot檢測(cè)大鼠心肌組織中C-Caspase 3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平取新鮮心臟組織，置于凍存管并迅速移至液氮中凍存，再移至-80 ℃ 冰箱中保存以備檢測(cè)。從-80 ℃冰箱中取出標(biāo)本，經(jīng)過蛋白提取、總蛋白變性、制膠、灌膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育后發(fā)光檢測(cè)，最后將膠片進(jìn)行掃描存檔，AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠心電圖J點(diǎn)位移變化值比較與空白組比較，模型組大鼠的J點(diǎn)位移變化值增加且>0.1 mv，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示心肌缺血模型建立成功。與模型組比較，按法組、鹽酸地爾硫卓組J點(diǎn)位移變化值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示按壓心俞穴能夠改善心肌缺血模型大鼠心肌損傷狀態(tài)。見表1。

表1 各組大鼠心電圖J點(diǎn)位移變化值比較

3.2 各組大鼠心肌組織病理變化比較空白組心肌組織形態(tài)基本正常，細(xì)胞核完整，心肌纖維排列整齊，橫紋清楚，心肌結(jié)構(gòu)無明顯病理改變。與空白組比較，模型組大鼠心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，心肌纖維大部分溶解、壞死，大量膠原纖維滲出，心肌細(xì)胞大小不一，呈萎縮、變性改變；與模型組比較，按法組和鹽酸地爾硫卓組均能改善心肌纖維的纖維化狀態(tài)，減少心肌細(xì)胞壞死程度，心肌損傷明顯改善，見圖1。

注：A：空白組；B：模型組；C：按法組；D：鹽酸地爾硫卓組；箭頭a：細(xì)胞核；箭頭b：心肌纖維；箭頭c：膠原纖維；箭頭d：肥大的心肌細(xì)胞；箭頭e：肥大增生的心肌細(xì)胞

3.3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較與空白組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，按法和鹽酸地爾硫卓組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2、圖2。結(jié)果表明，按壓心俞穴能減少心肌細(xì)胞凋亡，改善心肌損傷。

注：A：空白組；B：模型組；C：按法組；D：鹽酸地爾硫卓組；箭頭a：正常細(xì)胞；箭頭b：凋亡細(xì)胞

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較

3.4 各組大鼠血清中CK-MB、cTn-Ⅰ含量比較與空白組比較，模型組大鼠血清 CK-MB、cTn-Ⅰ含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，按法組和鹽酸地爾硫卓組大鼠血清CK-MB、cTn-Ⅰ含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。結(jié)果表明，按壓心俞穴能明顯改善心肌損傷。

表3 各組大鼠血清中CK-MB、cTn-Ⅰ含量比較

3.5 各組大鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較與空白組比較，模型組Bax、C-Caspase 3蛋白表達(dá)水平上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，按法組和鹽酸地爾硫卓組Bax、C-Caspase 3蛋白表達(dá)水平下調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表4。結(jié)果表明，心肌缺血模型大鼠存在明顯的心肌組織細(xì)胞凋亡，按法干預(yù)可明顯抑制模型大鼠的心肌組織細(xì)胞凋亡。見圖3。

表4 各組大鼠心肌組織Bax、C-Caspase 3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較

注：A：空白組；B：模型組；C：按法組；D：鹽酸地爾硫卓組

4 討論

心肌缺血是心臟的一種病理狀態(tài)，表現(xiàn)為心臟血液供應(yīng)減少而導(dǎo)致缺氧，持續(xù)缺血缺氧會(huì)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，釋放大量活性物質(zhì)，引起心肌細(xì)胞水腫、凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致心臟功能障礙，造成繼發(fā)性損傷[13]。本研究采用異丙腎上腺素制備心肌缺血模型，是由于異丙腎上腺素可引起心肌快速收縮，心臟做功增加，導(dǎo)致心肌耗氧過多，出現(xiàn)心肌缺血和壞死[14]。

心肌缺血一旦發(fā)生，心電圖也隨之改變，心電圖中J點(diǎn)位移變化引起ST段改變，可反映心肌缺血性損傷程度[15]。隨著心肌缺血的持續(xù)存在，心肌細(xì)胞大量凋亡或者壞死，血液中cTn-Ⅰ、CK-MB水平急劇上升，而cTn-Ⅰ、CK-MB是反映心肌細(xì)胞損傷程度的重要指標(biāo)[16]。心肌缺血持續(xù)發(fā)生，造成心肌細(xì)胞不可逆的傷害，細(xì)胞凋亡也隨之發(fā)生[17]。Bcl-2 家族包括促細(xì)胞凋亡和抗細(xì)胞凋亡兩大類，主要參與細(xì)胞凋亡信號(hào)接受和傳遞的上游環(huán)節(jié)，與線粒體膜的通透性雙向調(diào)節(jié)相關(guān)。當(dāng)促凋亡蛋白收到凋亡信號(hào)時(shí)，可使線粒體釋放細(xì)胞色素C來激活下游Caspases引起細(xì)胞凋亡，而抗凋亡蛋白通過抑制促凋亡蛋白來抑制細(xì)胞凋亡，在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵性作用[18]。Bcl-2是抗凋亡蛋白，能抑制如輻射、高溫以及部分藥物誘導(dǎo)等因素引起的細(xì)胞凋亡，還可通過調(diào)節(jié)Ca2+濃度和抗氧化作用保證細(xì)胞存活[19-20]。Bax作為一種細(xì)胞傳感器，位于線粒體表面，通過破壞Bcl-2蛋白的功能引起細(xì)胞凋亡[21]。Caspase家族蛋白活化是細(xì)胞凋亡的下游環(huán)節(jié)，C-Caspase 3可以激活凋亡信號(hào)傳遞，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[22]。

按法作為推拿的代表手法之一，直接作用于人體體表，有調(diào)整臟腑、行氣活血的作用。研究表明，推拿可以降低外周阻力，提高心肌供氧，減輕心臟負(fù)荷，從而改善心臟心肌缺血缺氧狀態(tài)[23-24]。心俞穴是背俞穴之一，張介賓謂“十二之俞皆通于臟氣”，刺激背俞穴可以調(diào)節(jié)臟腑功能的盛衰，治療臟腑疾病。研究表明，背俞穴的分布規(guī)律與脊神經(jīng)節(jié)段性分布特點(diǎn)大致吻合，提示背俞穴的治療作用與神經(jīng)反應(yīng)相關(guān)[25-27]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠“心俞”對(duì)心肌缺血改善作用的神經(jīng)生理學(xué)基礎(chǔ)與其對(duì)脊神經(jīng)節(jié)區(qū)和腦PVN區(qū)的特異性反應(yīng)相關(guān)。課題組前期研究已證實(shí)，按壓心俞穴可以調(diào)節(jié)心肌缺血損傷，但其作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證按壓心俞穴對(duì)心肌缺血的作用機(jī)制，以異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠心肌缺血模型，研究其作用機(jī)制是否與細(xì)胞凋亡相關(guān)。本研究結(jié)果中，模型組心電圖中J點(diǎn)位移變化值>0.1 mv，血清cTn-Ⅰ、CK-MB水平顯著升高，提示心肌缺血模型大鼠造模成功；按法組心電圖J點(diǎn)位移變化值低于0.1 mv，血清cTn-Ⅰ、CK-MB含量明顯下降。HE染色切片可以形象直觀地觀察組織形態(tài)學(xué)改變，結(jié)果表明，模型組有大量膠原纖維存在，心肌細(xì)胞變性、壞死，而按法組心肌損傷程度明顯減輕。心肌缺血缺氧損傷后Bax蛋白和基因表達(dá)水平增加，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，經(jīng)治療后Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，而C-Caspase 3蛋白表達(dá)水平降低，減少細(xì)胞凋亡。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠心肌組織中 C-Caspase 3、Bax蛋白表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)下降，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，按法干預(yù)后C-Caspase 3、Bax蛋白表達(dá)下調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，提示按法通過調(diào)節(jié)C-Caspase 3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡，改善心肌缺血損傷。

綜上所述，按壓心俞穴對(duì)心肌缺血具有一定的治療作用，其作用機(jī)制與按法參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，本研究為今后臨床上防治心肌缺血及其相關(guān)疾病提供一種新的治療方案。