張 怡，張銘珈，馮庭宇，朱艷芳，敖海清

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510000)

抑郁癥是一類以持續(xù)性情緒低落，認(rèn)知、思維活動(dòng)遲緩、活動(dòng)能力減退為主要特征的心境障礙[1]。在中醫(yī)范疇，肝郁氣滯和肝郁脾虛是抑郁癥中最為常見的兩個(gè)證型[2-3]。慢性心理應(yīng)激會(huì)引起機(jī)體免疫功能的變化，趙榮華等[4]發(fā)現(xiàn)肝郁氣滯、肝郁脾虛證型大鼠的免疫功能調(diào)控有差異。Th17/Treg細(xì)胞是機(jī)體免疫平衡調(diào)節(jié)的一組重要細(xì)胞對(duì)，已有研究發(fā)現(xiàn)慢性心理應(yīng)激會(huì)引起機(jī)體Th17/Treg細(xì)胞偏移[5]，但對(duì)具體中醫(yī)證型的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察比較了肝郁氣滯證和肝郁脾虛證慢性應(yīng)激大鼠外周血Th17/Treg細(xì)胞平衡偏移的異同，以探究慢性應(yīng)激模型大鼠中這兩種證型的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究已通過廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)審查，編號(hào)20200908001。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性健康大鼠40只，體質(zhì)量180～220 g，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(粵)2013-0034,分籠飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)溫度22 ℃，濕度50%～70%，光照時(shí)間12 h/d。

1.2 試劑

白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-17A、IL-10、IL-6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor,TGF)-βElisa試劑盒，貨號(hào)分別為MM-70049R2、MM-0195R2、MM-0163M2、MM-45041M2，購(gòu)自上海酶免公司；APC Anti-rat CD3(貨號(hào)：557030)、FITC Anti-rat CD4(貨號(hào)：561834)、BV421 Anti-rat CD25(貨號(hào)：565608)、Anti-rat CD32(貨號(hào)：550270)，購(gòu)自美國(guó)BD公司；PE Anti-rat FOXP3(貨號(hào)：12-5773-82)、PE-Cyanine7 Anti-rat IL-17A(貨號(hào)：25-7177-82)，購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司。

1.3 主要儀器

DigBehv行為學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，上海吉量科技有限公司；PE EnSpire多功能酶標(biāo)儀，上海珀金埃爾默公司；FACSCelesta流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型建立

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將40只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、肝郁氣滯組、肝郁脾虛組、脾虛組，每組10只，造模方法參照文獻(xiàn)[6-7]。肝郁氣滯模型建立：將大鼠置于長(zhǎng)22 cm，直徑6.5 cm的自制圓柱形透氣束縛瓶?jī)?nèi)，每天束縛6 h。肝郁脾虛模型建立：每天上午將大鼠束縛6 h，下午置于裝滿水，高50 cm、直徑30 cm的桶里強(qiáng)迫游泳10 min,并隔天飲食。脾虛模型建立：每天強(qiáng)迫游10 min,隔天飲食。空白組在其他組進(jìn)行束縛時(shí)禁食禁水，其余時(shí)間自由飲食。造模共計(jì)35 d。

2.2 檢測(cè)指標(biāo)與方法

2.2.1 體質(zhì)量測(cè)定和一般體征觀察 造模開始后，于第0，14，21，35天記錄各組大鼠體質(zhì)量變化。參照動(dòng)物外觀行為量表作為建模成功標(biāo)準(zhǔn)，每天觀察各組大鼠的毛發(fā)、口唇色澤，大便的形狀、修飾行為、精神狀態(tài)等的變化情況[7]。

2.2.2 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)先進(jìn)行糖水訓(xùn)練，即第1天每個(gè)鼠籠放2瓶1%濃度的蔗糖水，第2天換成1瓶糖水和1瓶純水[8]。第3天禁食禁水23 h，第4天同時(shí)放1瓶純水和1瓶糖水，1 h后測(cè)算糖水消耗量。分別在造模前、造模第18天、造模第35天進(jìn)行測(cè)量。糖水偏好率=(糖水消耗量/糖水消耗量+純水消耗量)×100%

2.2.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 于造模第35天進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)[9]。使用80 cm×80 cm×40 cm曠場(chǎng)箱，內(nèi)壁及底面均為黑色，攝像頭安置在曠場(chǎng)箱的正上方。將大鼠置于中央?yún)^(qū)，每只大鼠觀察5 min自由活動(dòng)情況，統(tǒng)計(jì)指標(biāo)為總路程、平均速度、中央路程。

2.2.4 取材 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第2天取材。用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉各組大鼠，普通采血管和抗凝采血管經(jīng)腹主動(dòng)脈分別取血5 mL和3 mL，后脫頸處死大鼠，剝離脾臟和胸腺。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)，胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

2.2.5 血清IL-17A、IL-6、TGF-β、IL-10、IL-23含量檢測(cè) 普通管采集的非抗凝血液分裝上層血清后，使用Elisa試劑盒嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)各組大鼠血清中IL-17A、IL-6、TGF-β、IL-10、IL-23水平。

2.2.6 外周血Th17、Treg細(xì)胞檢測(cè) 取3 mL新鮮抗凝血液,采用密度梯度離心法分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，加入含10%FBS和1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液,稀釋細(xì)胞至2×106個(gè)/mL,取細(xì)胞液接種在12孔板上，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)5 h。Th17細(xì)胞檢測(cè)：收集細(xì)胞，加入流式管內(nèi)，加入FITC標(biāo)記的CD4單克隆抗體，避光孵育20 min。PBS清洗2次，加入固定/破膜液，避光孵育20 min，PBS清洗2遍，加入IL-17A-PE抗體2 μL,避光孵育30 min,PBS清洗2次，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。Treg細(xì)胞檢測(cè)：按照上述方法收集細(xì)胞，加入FITC標(biāo)記的CD4、BV 421標(biāo)記的CD25抗體進(jìn)行胞外因子染色，透膜/固定30 min后，進(jìn)行FOXP3抗體染色，避光孵育30 min后上機(jī)檢測(cè)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠體質(zhì)量和一般表征觀察結(jié)果

如圖1所示，造模期間大鼠體質(zhì)量隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而增加，與空白組大鼠比較，肝郁氣滯組、肝郁脾虛組、脾虛組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯變慢(P<0.05)。肝郁氣滯組大鼠造模3周后由易激怒、焦躁不安逐漸轉(zhuǎn)為活動(dòng)與修飾行為減少，飲食下降且毛發(fā)欠順澤等表現(xiàn)；肝郁脾虛組大鼠從易激怒、焦躁不安逐漸轉(zhuǎn)為反應(yīng)遲鈍、爭(zhēng)斗減少、扎堆懶動(dòng)、大便不成形、毛發(fā)臟亂、飲食下降等表現(xiàn)。脾虛組大鼠逐漸出現(xiàn)食量下降、唇色變淡、扎堆懶動(dòng)、大便不成形等表現(xiàn)。

注：與空白組比較**P<0.01

3.2 糖水偏好結(jié)果

如表1所示，造模第18天及35天，肝郁氣滯組和肝郁脾虛組大鼠的糖水偏好率較空白組顯著下降(P<0.05)。

表1 各組大鼠造模期間糖水偏好率比較

3.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表2所示，造模第35天，肝郁氣滯組和肝郁脾虛組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的總路程、平均速度及中央路程較空白組明顯下降(P<0.05)。

表2 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.4 脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)結(jié)果

如表3所示，與空白組比較，肝郁氣滯組和脾虛組大鼠脾臟指數(shù)顯著降低(P<0.01,P<0.05)；各組大鼠胸腺指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)比較

3.5 血清IL-17A、IL-6、TGF-β、IL-10檢測(cè)結(jié)果

如表4所示，在Th17相關(guān)細(xì)胞因子中，肝郁氣滯組大鼠外周血清IL-17A、IL-6含量較空白組顯著下降(P<0.01)，肝郁脾虛組大鼠的IL-17A含量較空白組下降(P<0.05)，較肝郁氣滯組上升(P<0.05)；在Treg相關(guān)的細(xì)胞因子中，肝郁氣滯組和肝郁脾虛組外周血清的IL-10含量較空白組明顯下降(P<0.01)，肝郁脾虛組的TGF-β含量較空白組顯著下降(P<0.01)。與空白組比較，肝郁氣滯組的IL-17A/IL-10的比值下降(P<0.01)，肝郁脾虛組IL-17A/IL-10的比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 各組大鼠血清相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果

3.6 外周血Th17、Treg細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的占比結(jié)果

如圖2和圖3所示，與空白組比較，肝郁氣滯組和肝郁脾虛組大鼠外周血中Treg細(xì)胞占比明顯下降(P<0.01，P<0.05)，肝郁氣滯組大鼠外周血Th17細(xì)胞占比顯著降低(P<0.01)。與空白組比較，肝郁氣滯組大鼠外周血Th17/Treg的比值明顯下降(P<0.05)，肝郁脾虛組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 Th17和Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例流式圖

注：與空白組比較*P<0.05，**P<0.01；與肝郁氣滯組比較△P<0.05

4 討論

中醫(yī)學(xué)將抑郁癥歸為“郁病”范疇，其主要累及肝、心、脾三臟?！兜は姆ā酚小坝粽?結(jié)聚而不得發(fā)越也”，認(rèn)為肝氣郁結(jié)是抑郁癥的主要病機(jī)[10]?！督饏T要略》云“夫治未病者,見肝之病,知肝傳脾,當(dāng)先實(shí)脾”,肝木乘脾，易致脾虛，肝郁脾虛亦是抑郁癥的主要證型之一。肝郁氣滯證和肝郁脾虛證是抑郁癥中最常見的兩個(gè)證型[2-3,11]。肝主疏泄，調(diào)暢氣機(jī)，脾主運(yùn)化，參與衛(wèi)氣的生成，對(duì)機(jī)體防御功能起到重要作用[12-13]，而肝郁氣滯、肝郁脾虛證型慢性應(yīng)激大鼠的免疫功能調(diào)控有差異[4]。本文通過束縛、束縛+力竭游泳+飲食失節(jié)分別建立肝郁氣滯和肝郁脾虛證慢性應(yīng)激大鼠模型，進(jìn)一步探討其免疫功能的變化機(jī)制。

Th17和Treg細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞中的兩類亞群，是一組免疫平衡調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)，Th17細(xì)胞通過特異性轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt(retinoid-related orphan nuclear receptorγt,ROR-γt)調(diào)控分泌IL-17、IL-6等促炎性細(xì)胞因子，參與免疫激活與炎癥反應(yīng)。Treg細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白3(forkhead box protein 3,Foxp3)可促進(jìn)Treg分泌IL-10、TGF-β等免疫抑制因子，抑制Th17細(xì)胞分化、抑制免疫激活。二者相互拮抗，共同維持機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的平衡[14]。研究發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激可引起機(jī)體Th17/Treg細(xì)胞偏移[5]。本研究通過檢測(cè)了Th17、Treg相關(guān)指標(biāo)，從Th17/Treg的平衡角度來探討肝郁氣滯和肝郁脾虛抑郁癥大鼠模型的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)果顯示，肝郁氣滯組和肝郁脾虛組大鼠外周血中Th17、Treg細(xì)胞占比較空白組都有所降低，肝郁氣滯組Th17細(xì)胞的占比較肝郁脾虛組明顯下降。大鼠外周血清中，肝郁氣滯組的Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-17A、IL-6表達(dá)較空白組降低，肝郁脾虛組的IL-17A的表達(dá)較空白組下降；Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-10在肝郁氣滯組和肝郁脾虛組中較空白組顯著降低；Th17與Treg的比值可代表免疫偏移的方向，與空白組比較，肝郁氣滯組的比值顯著下降，提示肝郁氣滯組向免疫抑制方向偏移，IL-17A與IL-10的比值也指向肝郁氣滯組出現(xiàn)了免疫偏移，其余組與空白組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此可推測(cè)肝郁氣滯組是通過調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞及其相關(guān)炎癥因子的表達(dá)導(dǎo)致免疫失衡的。

綜上所述，肝郁氣滯證與肝郁脾虛證慢性應(yīng)激模型大鼠的機(jī)體免疫功能都有所下降，肝郁氣滯證模型大鼠的免疫功能傾向于Th17/Treg細(xì)胞偏移引起的免疫抑制，肝郁脾虛證模型大鼠的免疫功能下降與Th17/Treg平衡偏移無關(guān)。