劉秀娟，巢玉彬

（臨朐縣檢驗(yàn)檢測中心，山東濰坊 262619）

天然酶作為優(yōu)質(zhì)生物催化劑，在食品檢測領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，具有效率高、反應(yīng)溫和等優(yōu)勢，但同時也存在穩(wěn)定性差、成本高等缺陷。納米酶可依靠納米材料的酶促反應(yīng)動力增強(qiáng)酶反應(yīng)穩(wěn)定性，但類酶活性較低，因此其發(fā)展受到了限制。磁性納米酶屬于新型納米酶，可在固體載體上錨定具有催化活性的金屬原子，同時具有可控的孔尺寸和大比表面積等優(yōu)點(diǎn)，能提高類酶活性。研究表明，F(xiàn)e3O4NPs催化活性有利于顯色反應(yīng)進(jìn)行，同時穩(wěn)定性良好，促進(jìn)了磁性納米酶在食品檢測領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展[1]。本文從磁性納米酶顯色技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用著手，展望該技術(shù)應(yīng)用前景，可為設(shè)計(jì)高活性磁性納米酶和高效食品安全檢測技術(shù)提供借鑒。

1 磁性納米酶顯色技術(shù)

磁性納米酶顯色技術(shù)是利用磁性納米酶對過氧化物酶的催化活性使底物顯色的一種檢測技術(shù)，具有較強(qiáng)的靈敏度。作為具有催化功能的模擬酶，磁性納米酶兼具納米材料性能和類酶活性，在發(fā)揮較強(qiáng)催化效力的同時，相對于酶擁有更高的穩(wěn)定性。從磁性納米酶應(yīng)用角度上來看，可分別采用光學(xué)分析法和電化學(xué)檢測法實(shí)施目標(biāo)物檢測。其中，光學(xué)分析法以比色法為主，需在酸性條件下依靠具有類酶活性的磁性納米酶吸附H2O2，促使中心節(jié)點(diǎn)粒子發(fā)生價(jià)態(tài)改變，使過氧化氫中的O-O鍵斷裂，形成羥基自由基·OH[2]。在3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺等顯色物液體中，·OH能夠?qū)o色TMB氧化為藍(lán)色TMBOX。使用分光光度計(jì)開展定量檢測時，可利用還原性目標(biāo)物抑制磁性納米酶的活性，達(dá)到控制·OH生成量的目標(biāo)，且直接觀察也能分辨出顏色變化。采用電化學(xué)檢測法，主要是由于磁性納米酶和H2O2發(fā)生反應(yīng)，不僅導(dǎo)致體系顏色發(fā)生變化，還導(dǎo)致電化學(xué)體系性質(zhì)改變。將鄰苯二氨當(dāng)成底物，利用磁性納米酶氧化為鄰苯二胺聚合物，可根據(jù)電化學(xué)信號變化，定量檢測目標(biāo)物。相比較而言，采用比色法可簡化分析步驟，提高方法準(zhǔn)確度。應(yīng)用該技術(shù)研制的比色生物傳感器用于物質(zhì)檢測，能夠在裸眼條件下觀察顏色變化，具有成本低、操作便利和實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn)。

2 磁性納米酶顯色技術(shù)在食品安全檢測中的運(yùn)用

2.1 在農(nóng)獸藥殘留檢測中的運(yùn)用

在食品殘留農(nóng)藥檢測方面，采用Fe3O4NPs-乙酰膽堿酯酶-膽堿氧化酶比色傳感器，能夠依靠磁性納米酶顯色原理對神經(jīng)毒素類、有機(jī)磷類農(nóng)藥實(shí)施檢測。在農(nóng)藥作用下，乙酰膽堿酯酶的活性將受到抑制，導(dǎo)致乙酰膽堿在氧化酶的催化作用下產(chǎn)生H2O2，抑制顯色反應(yīng)。采用該技術(shù)能夠篩查乙酰磷酸鹽等有機(jī)磷農(nóng)藥，檢出限能夠達(dá)到5 μmol·L-1，檢測沙林等神經(jīng)毒素，最低檢出量為1 nmol·L-1。但在毒死蜱等農(nóng)藥檢測方面，方法選擇性不高，需要通過添加生物識別適配體解決問題。具體來講，就是在Fe3O4NPs磁珠表面固定毒死蜱cDNA標(biāo)記，通過信號探針實(shí)現(xiàn)堿基互補(bǔ)，遇到毒死蜱后脫離磁珠，導(dǎo)致酶活性受到抑制，達(dá)到影響顯色的目標(biāo)，檢出限可達(dá)到4.4 ng·mL-1[3]。在獸藥檢測方面，應(yīng)用該技術(shù)可檢測四環(huán)素類抗生素。在抗生素分子對磁珠表面二價(jià)鐵和三價(jià)鐵離子產(chǎn)生較強(qiáng)吸引力的情況下，能夠發(fā)生芬頓反應(yīng)，將H2O2氧化為TMB，檢出限能夠達(dá)到45 nmol·mL-1。在強(qiáng)力霉素、土霉素等獸藥檢測方面，應(yīng)用該技術(shù)檢出限分別達(dá)到48 nmol·mL-1和26 nmol·mL-1，相較于農(nóng)藥，獸藥檢測靈敏度有所下降。出現(xiàn)這一情況，主要是受到基質(zhì)復(fù)雜、殘留種類多等因素影響，可通過結(jié)合特異性識別元件實(shí)現(xiàn)痕量獸藥精準(zhǔn)檢測。例如，在磁珠上標(biāo)記氯霉素對抗體等，利用比色免疫分析法研制生物傳感器，可達(dá)到0.03 nmol·L-1的檢出限，適用于檢測雞蛋、牛奶等各種復(fù)雜基質(zhì)食品中的殘留獸藥。

2.2 在食源性病原體檢測中的運(yùn)用

食源性病原體為可引發(fā)食源性疾病的細(xì)菌、病毒和寄生蟲等物質(zhì)，如沙門氏菌、大腸桿菌、李斯特菌和諾如病毒等，將引發(fā)食品污染及安全問題?，F(xiàn)階段，采用磁性納米酶顯色技術(shù)可對多種致病菌進(jìn)行檢測，具有操作簡單、快速等特點(diǎn)。例如，在沙門氏桿菌檢測方面，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，通過在Fe3O4NPs和AuNPs表面固定適配體，利用短鏈ssDNA修飾材料表面，可與沙門氏菌表面長鏈ssDNA互補(bǔ)，構(gòu)成夾心型納米復(fù)合材料，經(jīng)過磁性富集后，可將溶液由紅色變?yōu)榈t色，檢出限達(dá)到10 CFU·mL-1。在李斯特菌檢測上，通常采用催化性能更優(yōu)的Fe3O4NPC磁性納米酶，將TMS當(dāng)成是顯色底物，利用適配體修飾后的比色探針，檢測牛奶中細(xì)菌含量，檢出限可達(dá)到5.4×103CFU·mL-1。實(shí)際對李斯特菌的三明治結(jié)構(gòu)進(jìn)行捕捉，采用基于Ag納米酶調(diào)控的AuNPs納米酶擁有較好特異性，通過與磁性納米酶結(jié)合，并通過磁珠和抗體修飾方法催化鄰苯二胺氧化，促進(jìn)聚集體聚集，可使溶液由藍(lán)變紅，用于對豬肉中的李斯特菌進(jìn)行檢測，可達(dá)到10 CFU·mL-1方法檢出限[4-5]。在大腸桿菌檢測方面，可將生物酶和磁性納米酶串聯(lián)起來，加強(qiáng)對H2O2氧化二氨基聯(lián)苯胺催化，相較于膠體金試紙條能夠達(dá)到更高靈敏度，檢出限為2 CFU·mL-1，可為現(xiàn)場活菌檢測提供有力技術(shù)支撐。此外，在諾如病毒檢測方面，需要利用核酸適配體，修飾磁性納米酶，充分發(fā)揮對類過氧化物酶催化活性的吸附抑制作用。運(yùn)用該技術(shù)對病原體給予現(xiàn)場檢測，相較于常規(guī)ELISA試紙等可達(dá)到更高靈敏度，并在10 min內(nèi)出結(jié)果。

2.3 在重金屬離子檢測中的運(yùn)用

在食品中重金屬離子檢測上，采用核酸適配體，修飾磁性納米酶表面，能夠加強(qiáng)催化活性控制，為實(shí)現(xiàn)Pb2+、Cd2+等離子檢測提供支持。在溶液中不含有金屬離子的情況下，F(xiàn)e3O4NPs催化活性將受到適配體抑制，不會發(fā)生明顯顏色變化。在溶液中含有特定金屬離子時，可與適配體進(jìn)行特異性結(jié)合，脫離酶表面，提升酶活性，促進(jìn)顯色反應(yīng)發(fā)生。應(yīng)用該技術(shù)研制比色傳感器，能夠在50 min內(nèi)對特定重金屬離子進(jìn)行檢測，如在Cd2+檢測上可達(dá)到0.108 μmol·L-1的方法檢出限，在Pb2+離子檢測上檢出限為0.117 μmol·L-1。但采用的適配體屬于小分子物質(zhì)，篩選難度較高，將造成技術(shù)應(yīng)用成本過高。為降低成本，采用帶有POD活性的Fe3O4@ZIF-67-GSH-H2O2-TMB顯色體系進(jìn)行重金屬離子檢測，可利用谷胱甘肽對材料表面進(jìn)行修飾，使磁性納米酶獲得清除自由基的能力。采用該技術(shù)對Hg2+離子進(jìn)行檢測，在發(fā)生催化氧化反應(yīng)的過程中，GSH可對TMB氧化產(chǎn)生抑制作用。而溶液中存在金屬離子，能夠與GSH中硫醇基團(tuán)結(jié)合，使溶液變色，檢出限能夠達(dá)到 0.36 nmol·L-1。

2.4 在食品添加劑檢測中的運(yùn)用

在食品生產(chǎn)過程中使用過量添加劑或國家禁用添加劑，也將帶來安全問題。應(yīng)用磁性納米酶顯色技術(shù)檢測添加劑，可檢測牛奶等食品中的過氧化氫等抑菌劑，依靠酶大表面積和活性位點(diǎn)研制基于紙基的生物傳感器，能夠完成比色檢驗(yàn)，達(dá)到0.03 μmol·L-1檢出限，體現(xiàn)較高選擇性和靈敏性。對三聚氰胺等非法添加物進(jìn)行檢測，可知溶液中同時存在H2O2時，將率先發(fā)生反應(yīng)降低·OH濃度，導(dǎo)致溶液顯色不明顯。利用磁性納米酶偶聯(lián)TMB-H2O2反應(yīng)，完成比色傳感器開發(fā)，能夠?qū)崿F(xiàn)奶粉等食品中的三聚氰胺定量檢測，檢出限達(dá)到0.2 nmol·L-1。亞硝酸鹽作為食品防腐劑，含量較高將誘發(fā)癌癥，采用磁性納米酶檢測，需要發(fā)揮AuNPs的協(xié)同作用，通過誘導(dǎo)AuNPs聚集提高類酶活性，增強(qiáng)顯色，檢出限能夠達(dá)到60 nmol·L-1。檢測GSH等食品抗氧化劑時，可采用帶有OXD活性的磁性納米酶，研制比色傳感器矩陣，同時定量檢測單個抗氧化劑，檢出限為100 nmol·L-1。采用傳感列陣形式，能夠?qū)Χ鄠€物質(zhì)進(jìn)行檢測，同時區(qū)分不同抗氧化劑，解決待測物相互干擾問題。目前，在食品添加劑檢測上，磁性納米酶顯色技術(shù)應(yīng)用實(shí)例較少，檢出限稍高，未來需要加強(qiáng)研究，為實(shí)現(xiàn)食品安全快速檢測提供新思路。

2.5 在真菌毒素檢測中的運(yùn)用

真菌廣泛存在于環(huán)境中，其產(chǎn)生的毒素將污染食物，并威脅人體健康，因此需要加強(qiáng)真菌毒素檢測。目前，磁性納米酶傳感器也能用于檢測真菌毒素，具有靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn)。例如，在黃曲霉毒素檢測上，采用比色免疫傳感器具有較高的檢測靈敏度，可通過磁性納米酶對TMB氧化產(chǎn)生催化活性，但需要搭配使用二維結(jié)構(gòu)氧化錳納米片，獲得超高比表面積，強(qiáng)力吸附TMB。在溶液中存在黃曲霉毒素的情況下，能夠減少氧化錳溶解生成的離子，確保抗壞血酸氧化酶保持較高濃度，使溶液發(fā)生明顯顏色變化。采用標(biāo)記的納米金和磁珠偶聯(lián)，可發(fā)生競爭反應(yīng)，對花生中黃曲霉毒素進(jìn)行測定，檢出限達(dá)到0.02 nmol·L-1。采用該方法檢測玉米中的赭曲霉毒素，加入適配體屏蔽酶表面活性點(diǎn)位，抑制顯色反應(yīng)，在溶液中存在待測物時，可加重顯色反應(yīng)程度，達(dá)到0.19 nmol·L-1的方法檢出限。實(shí)際應(yīng)用顯色技術(shù)檢測真菌毒素，需要對天然酶和磁性納米酶催化反應(yīng)進(jìn)行耦合，并通過適配體識別提高方法靈敏度和穩(wěn)定性。

3 結(jié)語

綜上所述，磁性納米酶顯色技術(shù)用于食品安全檢測，能夠突破納米酶應(yīng)用存在的活性低、穩(wěn)定性差等問題，通過高效催化和控制類酶活性，實(shí)現(xiàn)各種有毒有害物質(zhì)的定性檢測和定量分析。但總體來看，磁性納米酶的種類較少，在部分目標(biāo)物檢測中，需要借助適配體等增強(qiáng)選擇性，因此，應(yīng)通過結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、形貌調(diào)控等方式，完成可實(shí)現(xiàn)特異識別的材料研制，有效拓展技術(shù)應(yīng)用范圍。此外，磁性納米酶顯色技術(shù)主要用于對單一目標(biāo)物進(jìn)行檢測，未來想要用于現(xiàn)場高效檢測，還需引入微流控芯片技術(shù)等實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)物同時檢測，為該技術(shù)迎來較好的發(fā)展前景。