凌思雨，王 洲，張會敏，李 闖，劉慶濤，劉 艷，薛正蓮

（安徽工程大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽省工業(yè)微生物分子育種工程實驗室，微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 蕪湖 241000）

谷胱甘肽是一種由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的非蛋白類三肽化合物[1]，廣泛存在于大多數(shù)真核生物和某些原核生物中[2]。在生物體內(nèi)具有還原型和氧化型兩種形式[3]，其中還原型谷胱甘肽占大多數(shù)，約為90%[4-5]。由于其具有抗氧化性[6]、清除自由基[7]、解毒[8]、美白[9]等功能，谷胱甘肽被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)[3,10]。因此，近年來國內(nèi)外對谷胱甘肽的需求呈現(xiàn)出一種上升趨勢[11]。目前，酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽是工業(yè)生產(chǎn)上的主流，常用的生產(chǎn)菌種主要包括釀酒酵母[12-13]、產(chǎn)朊假絲酵母[14]和畢赤酵母[15]。

由于傳統(tǒng)的菌種選育方法過程繁瑣、效率低下[16]，由清華大學(xué)與天木生物科技有限公司合作研發(fā)的常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變技術(shù)可有效解決上述問題。ARTP誘變具有高突變率、操作簡單、誘變速度快且對環(huán)境無污染等優(yōu)點[17-18]，是一種新型誘變技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用到各類微生物菌種篩選過程中[19]。同時，基于液滴微流控技術(shù)研發(fā)而成的一款全自動高通量微生物微液滴培養(yǎng)（microbial microdroplet culture system，MMC）系統(tǒng)具有高通量、微量化及自動培養(yǎng)和傳代等功能[20-21]，為菌種誘變之后的復(fù)雜篩選工作提供了一種高效方法[22-23]。目前，將ARTP與MMC聯(lián)合應(yīng)用于菌種選育的相關(guān)研究還鮮見報道，因此具有一定的研究前景和理論價值。

為了獲得高產(chǎn)谷胱甘肽的畢赤酵母菌株，以實驗室保藏的1 株畢赤酵母BY-1作為出發(fā)菌株，首先通過ARTP誘變技術(shù)并結(jié)合梯度濃度1,2,4-三氮唑平板篩選方法，驗證在高質(zhì)量濃度1,2,4-三氮唑抗性平板上生長菌株的谷胱甘肽產(chǎn)量，明顯高于低濃度1,2,4-三氮唑平板上生長的菌株。然后進(jìn)一步以1,2,4-三氮唑作為篩選因子，利用MMC對經(jīng)過誘變的菌株進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化，提高出發(fā)菌株對1,2,4-三氮唑耐受性的同時篩選出高產(chǎn)谷胱甘肽的畢赤酵母菌株。本實驗旨在將ARTP誘變技術(shù)與MMC適應(yīng)性進(jìn)化聯(lián)合應(yīng)用于高產(chǎn)谷胱甘肽畢赤酵母菌株的選育，相比傳統(tǒng)的物理誘變、化學(xué)誘變和生物合成學(xué)手段相比，提供一種簡便高效的育種方式，具有廣泛的市場應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

畢赤酵母（Pichia pastoris）菌株，本實驗室命名為BY-1。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種培養(yǎng)用液體和固體培養(yǎng)基為酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，胰蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L；固體培養(yǎng)基中額外添加20 g/L瓊脂粉。誘變菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)所用液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母提取物10 g/L，硫酸銨5 g/L，無水磷酸二氫鉀5 g/L，七水硫酸鎂5 g/L，氯化鈉0.1 g/L，氯化鈣0.1 g/L。培養(yǎng)基需115 ℃滅菌30 min后使用。

1.1.3 試劑

1,2,4-三氮唑、Tris-HCl緩沖液、2-硝基苯甲酸（2-nitrobenzoic acid，DTNB） 生工生物工程（上海）股份有限公司；40%乙醇溶液 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ARTP-IIS ARTP誘變育種儀 無錫源清天木生物科技有限公司；MMC-B2 MMC培養(yǎng)儀 洛陽華清天木生物科技有限公司；1510酶標(biāo)儀 賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；D3024高速微量離心機(jī) 大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）股份公司；ZQZY-78BN恒溫培養(yǎng)搖床 上海知楚儀器有限公司；Mixer 4K微型旋渦混合儀 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 畢赤酵母ARTP誘變

1.3.1.1 BY-1菌株生長曲線制作及對數(shù)生長期的確定

將活化好的畢赤酵母菌（BY-1）轉(zhuǎn)移至裝液量為30 mL的250 mL搖瓶中，置于恒溫培養(yǎng)搖床中30 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)。將BY-1菌懸液濃度稀釋到OD600nm約1.0，轉(zhuǎn)入MMC專用進(jìn)樣瓶，在MMC系統(tǒng)中創(chuàng)建液滴培養(yǎng)單元，并使用MMC系統(tǒng)自帶的光密度檢測裝置檢測液滴中BY-1菌株生長過程中OD600nm值的變化，用于制作生長曲線，以確定BY-1進(jìn)入對數(shù)生長期的時間。

1.3.1.2 ARTP誘變致死率曲線的制作及最佳ARTP誘變處理時間的確定

取對數(shù)生長期的BY-1菌液，稀釋菌液濃度到OD600nm約為0.6～0.8。取10 μL稀釋好的菌液，將其均勻涂布在ARTP專用載片上，置于ARTP誘變育種儀中對BY-1菌株進(jìn)行誘變處理[24]。ARTP誘變育種儀配備純度超過99.99%的氦氣；設(shè)置處理參數(shù)：入射功率120 W，氣體流量10 L/min，照射距離2 mm。設(shè)置不同誘變處理時間：40、80、120、160、200 s和240 s，并計算不同處理時間的菌株致死率，以繪制ARTP誘變致死率曲線。菌株致死率的計算方法為：將處理結(jié)束的載片裝入含有990 μL無菌生理鹽水中，經(jīng)微型旋渦混合儀充分振蕩，以未經(jīng)誘變處理過的菌液作為對照，稀釋成不同梯度后均勻涂布于YPD固體培養(yǎng)基。而后置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，并計算致死率。根據(jù)ARTP誘變致死率曲線確定最佳誘變處理時間。致死率的計算公式如下：

1.3.1.3 1,2,4-三氮唑梯度濃度平板法篩選突變菌株

將熔化好的YPD固體培養(yǎng)基倒入直徑為9 cm的無菌培養(yǎng)皿中，傾斜一定角度（約15°），使得位于液面高處的培養(yǎng)基處于培養(yǎng)皿邊與皿底之間，待其凝固后，水平放置培養(yǎng)皿，將含有2 g/L 1,2,4-三氮唑的YPD培養(yǎng)基加入其中，制得含有不同質(zhì)量濃度1,2,4-三氮唑（0～2 g/L）的固體平板。隨后將經(jīng)過誘變并稀釋好的酵母菌液均勻涂布于梯度平板中，倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3～5 d，觀察不同質(zhì)量濃度梯度下菌體的生長情況，并驗證在高質(zhì)量濃度抗性下生長的菌落與其谷胱甘肽產(chǎn)量是否正相關(guān)。

1.3.1.4 對數(shù)生長期初篩菌株在最佳ARTP誘變時間下的ARTP誘變

將經(jīng)過ARTP誘變及梯度平板篩選獲得的優(yōu)勢菌株，在最佳誘變時間下再次處理，隨后均勻涂布于YPD固體平板中，挑選單菌落用于后續(xù)MMC適應(yīng)性進(jìn)化。通過ARTP誘變和MMC篩選后獲得的畢赤酵母菌株，在30 ℃、220 r/min條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，測定其谷胱甘肽產(chǎn)量和細(xì)胞生物量，以優(yōu)選高產(chǎn)谷胱甘肽的誘變菌株。

1.3.2 DTNB法測定谷胱甘肽產(chǎn)量

取2 mL搖瓶培養(yǎng)液，8000 r/min離心5 min后獲得上清液和細(xì)胞沉淀，使用上清液檢測胞外谷胱甘肽產(chǎn)量，使用細(xì)胞沉淀檢測胞內(nèi)谷胱甘肽產(chǎn)量，本實驗谷胱甘肽總產(chǎn)量為胞外和胞內(nèi)產(chǎn)量之和[25-26]。對于胞內(nèi)谷胱甘肽的檢測需要額外使用40%乙醇溶液，30 ℃水浴破壁2 h，8000 r/min離心5 min后取上清液進(jìn)行顯色反應(yīng)。在pH 8.0的Tri-HCl緩沖液中，谷胱甘肽與DTNB反應(yīng)可以生成黃色的5-硫代-2硝基苯甲酸，在波長412 nm處有最大吸收峰，利用酶標(biāo)儀檢測OD412nm，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測谷胱甘肽產(chǎn)量[27]。

1.3.3 細(xì)胞生物量的測定

取2 mL搖瓶培養(yǎng)液，8000 r/min離心5 min，棄上清液，而后用蒸餾水洗滌菌體3 次，85 ℃烘干至質(zhì)量恒定，減去空離心管質(zhì)量后除以搖瓶培養(yǎng)液體積2 mL即可得到細(xì)胞干質(zhì)量（g/L）。

1.3.4 優(yōu)選菌株的MMC適應(yīng)性進(jìn)化

將經(jīng)過ARTP誘變且經(jīng)過搖瓶培養(yǎng)證實生產(chǎn)性能較穩(wěn)定的菌株BY-1-26，接入到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min條件下過夜培養(yǎng)，調(diào)節(jié)OD600nm，使其控制在1.0以下。設(shè)置傳代方式（time）及傳代參數(shù)（24 h）后，在不同濃度梯度的1,2,4-三氮唑篩選因子條件下進(jìn)行BY-1-26菌株的MMC適應(yīng)性進(jìn)化，實時檢測OD600nm以跟蹤菌株的適應(yīng)性進(jìn)化生長情況。隨著培養(yǎng)時間的延長，1,2,4-三氮唑濃度逐漸遞增，達(dá)到最高設(shè)定濃度時，將生長情況良好的液滴提取出來，通過平板劃線，分離單菌落后，作為下次實驗的出發(fā)菌株。

1.3.5 突變菌株遺傳穩(wěn)定性分析

將最終經(jīng)過篩選獲得的優(yōu)勢菌株，經(jīng)過固體平板劃線連續(xù)傳代7 次，于30 ℃、220 r/min條件下檢測每代的生長情況（生物量）及谷胱甘肽產(chǎn)量，驗證其遺傳穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2019進(jìn)行處理，圖像采用Origin 2018進(jìn)行繪制。實驗結(jié)果以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 畢赤酵母菌株的ARTP誘變篩選條件

BY-1畢赤酵母菌株為ARTP誘變的出發(fā)菌株，其具有代謝產(chǎn)生谷胱甘肽能力，已知其在搖瓶培養(yǎng)48 h可達(dá)到最高谷胱甘肽產(chǎn)量（胞內(nèi)產(chǎn)量與胞外產(chǎn)量總量）（133.24±0.86）mg/L，對應(yīng)生物量（15.22±0.21）g/L（圖1a）。圖1b為BY-1菌株在MMC培養(yǎng)中的生長曲線，不同液滴培養(yǎng)單元之間一致性良好，菌株BY-1從3 h起開始進(jìn)入對數(shù)生長期，20 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。進(jìn)一步檢測BY-1菌株在不同ARTP誘變處理時間下的致死率，由圖1c可知，隨著處理時間的延長，菌株的死亡率也在逐漸提高。處理時間為120 s時，致死率高達(dá)80%；處理時間增加到160 s，致死率為90%；進(jìn)一步增加處理時間至200 s，致死率達(dá)到100%。根據(jù)文獻(xiàn)報道[28]，致死率在80%～90%之間，更有利于后續(xù)誘變菌株的篩選工作。為此，考慮到誘變菌株的篩選效率，本研究將160 s確定為后續(xù)ARTP誘變的最佳處理時間。

圖1 菌株BY-1的谷胱甘肽產(chǎn)量及生物量（a）、生長曲線（b）和ARTP誘變致死率曲線（c）Fig.1 GSH yield and biomass (a),growth curve (b) and ARTP mutagenicity lethality curve (c) of strain BY-1

2.2 突變菌株的篩選結(jié)果

畢赤酵母經(jīng)ARTP誘變后，涂布在含有梯度質(zhì)量濃度（0～2 g/L）的1,2,4-三氮唑YPD培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 d，如圖2a所示，在相對低質(zhì)量濃度1,2,4-三氮唑培養(yǎng)基中，誘變菌株生長良好，數(shù)量多且菌落形態(tài)較大。隨著1,2,4-三氮唑質(zhì)量濃度增大，畢赤酵母生長情況受到抑制，形態(tài)變小且數(shù)量減少。平板中高質(zhì)量濃度與低濃度區(qū)域分別選取30 個單菌落，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)驗證。結(jié)果表明，低質(zhì)量濃度抗性突變株的產(chǎn)量普遍低于高質(zhì)量濃度抗性突變株，且低濃度區(qū)域谷胱甘肽產(chǎn)量的中位數(shù)明顯低于高質(zhì)量濃度區(qū)域（圖2b）。在高質(zhì)量濃度區(qū)域發(fā)現(xiàn)編號為26的突變株（圖2a），其谷胱甘肽產(chǎn)量最高，達(dá)到（203.20±4.18）mg/L，將其命名為BY-1-26。在后續(xù)的ARTP誘變中，選擇BY-1-26作為新的出發(fā)菌株。

圖2 畢赤酵母誘變菌株梯度平板篩選結(jié)果（a）及其谷胱甘肽產(chǎn)量測定結(jié)果（b）Fig.2 Results of gradient plate screening (a) and yield of GSH produced by mutant (b)

2.3 搖瓶培養(yǎng)過程中添加1,2,4-三氮唑?qū)Ξ叧嘟湍府a(chǎn)谷胱甘肽的影響

已知1,2,4-三氮唑的抗性突變株具有較高的谷胱甘肽合成能力[29]。本研究通過ARTP誘變結(jié)合1,2,4-三氮唑梯度濃度的平板篩選方法，驗證了其對高產(chǎn)谷胱甘肽的畢赤酵母菌株具有很好的篩選效果。目前尚無在發(fā)酵階段添加1,2,4-三氮唑以提升谷胱甘肽產(chǎn)量的報道。因此需要確定好1,2,4-三氮唑在發(fā)酵過程中的適宜添加時間和添加濃度，以準(zhǔn)確考察1,2,4-三氮唑?qū)Ξ叧嘟湍赴l(fā)酵過程中產(chǎn)谷胱甘肽的影響。

2.3.1 搖瓶培養(yǎng)中初步添加1,2,4-三氮唑?qū)入赘孰漠a(chǎn)量的影響

在搖瓶培養(yǎng)的不同階段添加1,2,4-三氮唑，會直接影響到菌體的生長及谷胱甘肽產(chǎn)量[30]。參考圖2結(jié)果，選擇1,2,4-三氮唑在“高質(zhì)量濃度區(qū)域”的中位數(shù)質(zhì)量濃度1.5 g/L初步進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)中的1,2,4-三氮唑添加實驗。為此根據(jù)出發(fā)菌株的生長曲線（圖1b），在菌株BY-1-26進(jìn)入搖瓶培養(yǎng)的0、5、10、15、20、25、30 h分別添加1.5 g/L的1,2,4-三氮唑，以確定其生長曲線的不同階段對菌株BY-1-26代謝產(chǎn)生谷胱甘肽的影響。以未加入1,2,4-三氮唑的BY-1-26菌株搖瓶培養(yǎng)實驗為對照，分別分析加入1.5 g/L 1,2,4-三氮唑后搖瓶培養(yǎng)48、60、72 h后其谷胱甘肽產(chǎn)量。

如圖3所示，搖瓶培養(yǎng)48 h后，誘變菌株BY-1-26生物量在48 h達(dá)到最高值，同時其谷胱甘肽產(chǎn)量也達(dá)到最大值，胞內(nèi)谷胱甘肽達(dá)到（153.85±2.80）mg/L，胞外谷胱甘肽達(dá)到（49.34±2.11）mg/L，總量達(dá)到（203.20±4.18）mg/L，比出發(fā)菌株增產(chǎn)52.51%。表明ARTP誘變可有效提升畢赤酵母菌株BY-1代謝產(chǎn)生谷胱甘肽的能力。

圖3 菌株BY-1-26在不同培養(yǎng)時間下的谷胱甘肽產(chǎn)量（a）和生物量（b）Fig.3 GSH yield (a) and biomass (b) of strain BY-1-26 at different incubation times

進(jìn)一步加入1,2,4-三氮唑，搖瓶培養(yǎng)48 h 后（圖4a），胞外谷胱甘肽產(chǎn)量增加3.9%～80.9%，達(dá)到89.25 mg/L，胞內(nèi)谷胱甘肽產(chǎn)量降低5.3%～33.9%，達(dá)到101.73 mg/L，推測加入1,2,4-三氮唑使BY-1-26菌株細(xì)胞壁滲透性增強(qiáng)，使代謝產(chǎn)生的谷胱甘肽更容易從胞內(nèi)釋放到胞外。不同時間添加1,2,4-三氮唑的樣本相比，谷胱甘肽總量分別在培養(yǎng)5、10、20 h加入1,2,4-三氮唑的樣本中有所增加（2.3%～9.2%），而在培養(yǎng)0、15、25、30 h后加入1,2,4-三氮唑的樣本中有所減少（3.3%～17.9%），在搖瓶培養(yǎng)10 h后加入1,2,4-三氮唑的樣本，谷胱甘肽產(chǎn)量增加最多（9.2%，221.83 mg/L），推測可能與對數(shù)期菌株細(xì)胞壁通透性更容易受1,2,4-三氮唑影響，谷胱甘肽釋放到胞外有利于解除產(chǎn)物抑制促進(jìn)菌株谷胱甘肽的進(jìn)一步合成[31]。

搖瓶培養(yǎng)60 h后（圖4b），與培養(yǎng)48 h（圖4a）相比，胞內(nèi)谷胱甘肽產(chǎn)量略有提高（1.38%，133.06 mg/L），胞外谷胱甘肽平均產(chǎn)量顯著降低為48 h 的94.06%（61.91 mg/L），推測可能與長時間發(fā)酵營養(yǎng)物質(zhì)損耗及菌株代謝能力降低有關(guān)。與未加入1,2,4-三氮唑（圖3a）相比，加入1,2,4-三氮唑的樣本，胞內(nèi)谷胱甘肽產(chǎn)量減少9.4%～26.1%，胞外谷胱甘肽產(chǎn)量變?yōu)?3.6%～162.7%，總量變?yōu)?1.1%～104.9%。其中，搖瓶培養(yǎng)10 h后加入1,2,4-三氮唑的樣本中谷胱甘肽總量最高（210.46 mg/L），其中胞外谷胱甘肽產(chǎn)量提高62.7%（78.49 mg/L），胞內(nèi)谷胱甘肽產(chǎn)量下降13.4%（131.97 mg/L）。

搖瓶培養(yǎng)72 h后（圖4c），與培養(yǎng)60 h（圖4b）相比，胞內(nèi)谷胱甘肽產(chǎn)量與胞外谷胱甘肽產(chǎn)量分別顯著降低為60 h的28.52%（37.82 mg/L）和70.43%（42.39 mg/L）。推測長時間發(fā)酵使菌株代謝生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)嚴(yán)重不足。與未加入1,2,4-三氮唑（圖3a）相比，加入1,2,4-三氮唑的樣本，胞內(nèi)谷胱甘肽產(chǎn)量減少24.19%～28.41%，胞外谷胱甘肽產(chǎn)量變?yōu)?0.00%～104.18%，總量變?yōu)?8.38%～44.60%（73.72～85.65 mg/L）。其中，搖瓶培養(yǎng)20 h后加入1,2,4-三氮唑的樣本中谷胱甘肽總量最高（85.65 mg/L），胞外谷胱甘肽產(chǎn)量47.83 mg/L，胞內(nèi)谷胱甘肽產(chǎn)量37.82 mg/L。

圖4 不同時間添加1,2,4-三氮唑?qū)?8（a）、60 h（b）和72 h（c）培養(yǎng)液中谷胱甘肽的影響Fig.4 Effects of different addition times of 1,2,4-triazole on GSH yield in 48 (a),60 (b) and 72 h (c) cultures

綜上，與出發(fā)菌株相比（（133.24±0.86）mg/L），ARTP誘變可以顯著提高BY-1-26菌株在發(fā)酵48 h的谷胱甘肽產(chǎn)量52.51%（（203.20±4.18）mg/L）；在搖瓶培養(yǎng)10 h添加1,2,4-三氮唑有助于胞內(nèi)谷胱甘肽釋放到胞外，可以進(jìn)一步提高其在發(fā)酵48 h的谷胱甘肽產(chǎn)量66.49%（（221.83±2.10）mg/L）。誘變菌株在搖瓶培養(yǎng)48 h其谷胱甘肽產(chǎn)量達(dá)到最高值，隨著培養(yǎng)時間延長到60 h和72 h，其谷胱甘肽產(chǎn)量持續(xù)下降。

2.3.2 搖瓶培養(yǎng)過程中添加高質(zhì)量濃度1,2,4-三氮唑?qū)Ξ叧嘟湍府a(chǎn)谷胱甘肽的影響

由2.3.1節(jié)結(jié)果可知，在搖瓶培養(yǎng)10 h添加1,2,4-三氮唑可顯著提高菌株的谷胱甘肽產(chǎn)量。為了進(jìn)一步探索更高質(zhì)量濃度1,2,4-三氮唑?qū)φT變菌株代謝谷胱甘肽的影響，繼續(xù)嘗試在搖瓶培養(yǎng)10 h添加終質(zhì)量濃度為1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8 g/L的1,2,4-三氮唑，并且分別在48 h測定谷胱甘肽產(chǎn)量和生物量，結(jié)果如圖5所示。與未加入1,2,4-三氮唑（圖3）相比，菌株在48 h的生物量（（15.66±0.49）g/L）基本沒有變化；菌株在48 h的谷胱甘肽產(chǎn)量提高2.66%～13.22%，其中，加入終質(zhì)量濃度為2.4 g/L 1,2,4-三氮唑的樣本谷胱甘肽產(chǎn)量最高，提高13.22%（（230.07±1.26）mg/L）。與加入1.5 g/L的1,2,4-三氮唑的樣本（圖3a，（221.83±2.10）mg/L）相比，其谷胱甘肽產(chǎn)量有進(jìn)一步增加；與出發(fā)菌株相比（（133.24±0.86）mg/L），提高72.67%。以上研究表明，提高1,2,4-三氮唑質(zhì)量濃度可以進(jìn)一步提高畢赤酵母菌株產(chǎn)谷胱甘肽的能力。

圖5 添加不同質(zhì)量濃度1,2,4-三氮唑于BY-1-26菌株搖瓶培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后的谷胱甘肽產(chǎn)量（a）和生物量（b）Fig.5 GSH yield (a) and biomass (b) of BY-1-26 after 48 h shake flask culture with the addition of different concentrations of 1,2,4-triazole

2.4 BY-1-26菌株在高質(zhì)量濃度1,2,4-三氮唑條件下的MMC適應(yīng)性進(jìn)化

以上實驗證實，ARTP誘變技術(shù)結(jié)合添加1,2,4-三氮唑培養(yǎng)可以有效篩選并促進(jìn)畢赤酵母菌株高產(chǎn)谷胱甘肽。為此，本研究使用MMC儀，繼續(xù)對誘變菌株BY-1-26進(jìn)行1,2,4-三氮唑的適應(yīng)性進(jìn)化。

2.4.1 BY-1-26菌株對1,2,4-三氮唑的適應(yīng)進(jìn)化質(zhì)量濃度分析

基于2.3節(jié)實驗，BY-1-26菌株培養(yǎng)液可以耐受2.8 g/L的1,2,4-三氮唑。在MMC體系初步嘗試在更大的0～5 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)檢測1,2,4-三氮唑?qū)Y-1-26菌株的適應(yīng)性進(jìn)化影響。根據(jù)24 個液滴在8 個質(zhì)量濃度梯度的生長曲線（圖6a），當(dāng)1,2,4-三氮唑質(zhì)量濃度增加到4.444 g/L時，BY-1-26菌株的生長盡管受到一定抑制，其仍顯示出較好的生長趨勢。BY-1-26菌株在0～10 g/L范圍內(nèi)的適應(yīng)性進(jìn)化曲線（圖6b）顯示，BY-1-26菌株在10 g/L 1,2,4-三氮唑質(zhì)量濃度條件下顯示明顯的不均一性，表明其生長一致性受到影響。BY-1-26菌株在10～12 g/L范圍內(nèi)的適應(yīng)性進(jìn)化曲線（圖6c）顯示，BY-1-26菌株在12 g/L的1,2,4-三氮唑質(zhì)量濃度顯示明顯的不均一性。BY-1-26菌株在更高的1,2,4-三氮唑質(zhì)量濃度（12～15 g/L）下無法顯示規(guī)律性的適應(yīng)性進(jìn)化曲線（圖6d）。因此，本研究將BY-1-26菌株對1,2,4-三氮唑的適應(yīng)進(jìn)化濃度范圍設(shè)定為5～12 g/L，以獲得可耐受更高1,2,4-三氮唑抗性的畢赤酵母菌株。

圖6 菌株BY-1-26在不同1,2,4-三氮唑質(zhì)量濃度下的生長結(jié)果Fig.6 Growth status of strain BY-1-26 with different 1,2,4-triazole concentrations

使用MMC體系將BY-1-26菌株在5～12 g/L的1,2,4-三氮唑質(zhì)量濃度范圍下進(jìn)行1 輪適應(yīng)性進(jìn)化后，挑選長勢較好的液滴提取出來，通過劃線培養(yǎng)，提取單菌落菌株，繼續(xù)進(jìn)行下一輪適應(yīng)性進(jìn)化，以此類推，直到獲得耐受較高質(zhì)量濃度（接近12 g/L）1,2,4-三氮唑且適應(yīng)性進(jìn)化曲線良好的菌株。最終挑選了24 個液滴進(jìn)行后續(xù)的菌株純化和搖瓶培養(yǎng)驗證實驗。

2.4.2 適應(yīng)性進(jìn)化菌株的生物量和谷胱甘肽產(chǎn)量分析

將經(jīng)過適應(yīng)性進(jìn)化得到的24 個液滴，經(jīng)過平板劃線，挑取單菌落，各得到1 株分離的單菌株。將分離的24 個單菌株進(jìn)一步進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后，檢測每個菌株胞內(nèi)和胞外谷胱甘肽含量。

經(jīng)過MMC適應(yīng)性進(jìn)化，搖瓶培養(yǎng)后，24 個菌株的谷胱甘肽平均產(chǎn)量達(dá)到（292.68±7.76）mg/L（圖7a），對比適應(yīng)性進(jìn)化之前BY-1-26菌株的谷胱甘肽產(chǎn)量（圖3a，（203.20±4.18）mg/L），進(jìn)一步提高了44.04%。其中胞外平均產(chǎn)量為（64.39±2.57）mg/L，對比適應(yīng)性進(jìn)化之前BY-1-26菌株的胞外產(chǎn)量（（49.34±2.11）mg/L），提高了30.50%；胞內(nèi)平均產(chǎn)量為（228.33±6.55）mg/L，對比適應(yīng)性進(jìn)化之前B Y-1-26 菌株的胞內(nèi)產(chǎn)量（（153.85±2.80）m g/L），提高了48.41%。24 個菌株的平均生物量達(dá)到（31.75±2.02）g/L（圖7 b），與未經(jīng)過MMC適應(yīng)性進(jìn)化生物量相比（圖3 b，（15.65±0.43）g/L），提高了102.8%，表明MMC適應(yīng)性進(jìn)化促進(jìn)了菌株的生長能力。推測通過MMC適應(yīng)性進(jìn)化，加強(qiáng)了誘變菌株谷胱甘肽的胞外滲透性，促進(jìn)了菌株代謝合成谷胱甘肽的能力。其中液滴編號為24的菌株谷胱甘肽產(chǎn)量最高，達(dá)到（312.13±2.62）mg/L，相比BY-1-26的谷胱甘肽產(chǎn)量（（203.20±4.18）mg/L）提高53.61%，將其命名為BY-2-24。由此可以得出結(jié)論，經(jīng)過ARTP誘變所得到的菌株，將其接入MMC進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化培養(yǎng)后，菌株的生長能力得到加強(qiáng)，而且其谷胱甘肽生產(chǎn)能力也高于馴化之前，更為誘變育種之后的篩選方法提供了新的嘗試。

圖7 搖瓶培養(yǎng)適應(yīng)高質(zhì)量濃度1,2,4-三氮唑進(jìn)化的畢赤酵母菌株谷胱甘肽產(chǎn)量（a）和生物量（b）Fig.7 GSH yield (a) and biomass (b) of 24 single strains obtained by adaptive evolution with high concentrations of 1,2,4-triazoles

2.4.3 適應(yīng)性進(jìn)化的高產(chǎn)谷胱甘肽菌株的遺傳穩(wěn)定性

為了驗證突變菌株遺傳性狀是否穩(wěn)定，將畢赤酵母BY-2-24連續(xù)傳代培養(yǎng)7 次，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，待發(fā)酵結(jié)束測定每代的谷胱甘肽產(chǎn)量和生物量，如圖8所示，經(jīng)過7 次固體平板劃線培養(yǎng)，BY-2-24仍能保持較好的生長趨勢，每代的谷胱甘肽產(chǎn)量波動較小、基本穩(wěn)定（（310.17±3.87）mg/L），生物量穩(wěn)定在（32.67±0.55）g/L。由此說明經(jīng)過誘變及馴化獲得的突變株，其遺傳穩(wěn)定性良好，為后續(xù)谷胱甘肽的發(fā)酵生產(chǎn)研究提供了穩(wěn)定的菌種。

圖8 傳代培養(yǎng)7 次后畢赤酵母BY-2-24的谷胱甘肽產(chǎn)量（a）和生物量（b）Fig.8 GSH yield (a) and biomass (b) of P.pastoris BY-2-24 after one to seven passages

3 結(jié)論

通過ARTP誘變技術(shù)與MMC適應(yīng)性進(jìn)化相結(jié)合，構(gòu)建了一種谷胱甘肽高產(chǎn)畢赤酵母菌株的高效誘變篩選方法。以畢赤酵母菌株BY-1為出發(fā)菌株，通過ARTP誘變初步提高菌株BY-1-26的谷胱甘肽產(chǎn)量52.51%，達(dá)到（203.20±4.18）mg/L，進(jìn)一步通過在搖瓶培養(yǎng)10 h加入終質(zhì)量濃度為2.4 g/L的1,2,4-三氮唑，提高了菌株的谷胱甘肽產(chǎn)量72.67%，達(dá)到（230.07±1.26）mg/L，而對菌株的生物量基本無影響（提高2.9%，達(dá)到（15.66±0.49）mg/L）。本研究最終經(jīng)過高質(zhì)量濃度1,2,4-三氮唑（5～12 g/L）的MMC適應(yīng)性進(jìn)化，提高畢赤酵母菌株BY-2-24生物量118.33%，達(dá)（33.23±0.60）g/L，其中提高胞外谷胱甘肽產(chǎn)量47.12%，達(dá)（67.57±1.12）mg/L，提高胞內(nèi)谷胱甘肽產(chǎn)量179.15%，達(dá)（243.39±2.33）mg/L，提高谷胱甘肽總產(chǎn)量134.26%，達(dá)（312.13±2.62）mg/L。推測與出發(fā)菌株相比，誘變菌株谷胱甘肽的細(xì)胞壁滲透性增強(qiáng)，解除產(chǎn)物抑制，促進(jìn)了菌株代謝合成谷胱甘肽的能力。目前傳統(tǒng)的誘變育種方法主要是通過物理誘變（如紫外誘變）和化學(xué)誘變（如硫酸二乙酯誘變、甲基磺酸乙酯誘變）進(jìn)行，陳葉福等[32]通過紫外誘變結(jié)合鎘鹽抗性篩選，最終獲得了1 株谷胱甘肽產(chǎn)量達(dá)151.88 mg/L的釀酒酵母突變株，比出發(fā)菌株提高15.89%。孫姜等[33]通過制備釀酒酵母原生質(zhì)體，利用多輪亞硝酸誘變處理，最終篩選到1 株胞內(nèi)谷胱甘肽產(chǎn)量達(dá)14.85 mg/g干質(zhì)量的突變菌株，僅比出發(fā)菌株的產(chǎn)量提升24%。另外，目前研究人員已經(jīng)通過基因工程手段開展了高產(chǎn)谷胱甘肽酵母菌株的選育工作，高宇豪等[15]以畢赤酵母GS115為出發(fā)菌株，通過基因的串聯(lián)表達(dá)、前體氨基酸的添加和優(yōu)化檸檬酸鈉添加量的方法，使得谷胱甘肽產(chǎn)量達(dá)到（371.12±8.47）mg/L，對比出發(fā)菌株提升288%。本實驗以野生型畢赤酵母為出發(fā)菌株，最終谷胱甘肽產(chǎn)量提高134.26%，達(dá)（312.13±2.62）mg/L，相比傳統(tǒng)的誘變篩選效率有了大幅提升。盡管與基因工程手段獲得的產(chǎn)量相比尚有差距，后續(xù)可將BY-2-24菌株作為新的基因工程出發(fā)菌株，以進(jìn)一步提升谷胱甘肽產(chǎn)量。

綜上，本研究表明，1,2,4-三氮唑作為抗性篩選標(biāo)記，不僅可以在梯度平板篩選過程中提高篩選效率，還可以在液體篩選（適應(yīng)性進(jìn)化）過程中發(fā)揮出色作用。本研究將ARTP結(jié)合微液滴培養(yǎng)技術(shù)聯(lián)合運用于谷胱甘肽生產(chǎn)菌株的篩選過程，與傳統(tǒng)的物理誘變、化學(xué)誘變和合成生物學(xué)手段相比，不僅操作簡便，而且提升了篩選效率，為現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用所需菌株的誘變篩選工作提供了一定的借鑒與參考。