韓翠萍，段佳玉，曹 晨，李 戈，楊 雪，江連洲，于殿宇

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

玉米分布極為廣泛，成為世界第3大糧食作物，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，可以為人體提供能量，提高新陳代謝，調(diào)節(jié)人體神經(jīng)系統(tǒng)[1]。近幾年我國玉米產(chǎn)量不斷增加，2021年總產(chǎn)量達2.72億 t[2]，但我國玉米的利用率較低，利用方式單一，玉米深加工工業(yè)仍存在加工規(guī)模小、深加工產(chǎn)業(yè)鏈條短等問題。因此，提高玉米的利用率及經(jīng)濟價值，加快玉米工業(yè)化的轉(zhuǎn)化速度，具有重要意義。

隨著微生物技術(shù)的發(fā)展，發(fā)酵技術(shù)也被后人不斷創(chuàng)新、發(fā)揚。食品發(fā)酵過程中，微生物猶如“靈魂”般的存在，是發(fā)酵成敗的關(guān)鍵，微生物在發(fā)酵過程中主要通過水解已有的化合物產(chǎn)生新的化合物[3]，通過降解復(fù)雜化合物，達到改善感官品質(zhì)和提高營養(yǎng)價值的目的。Decimo等[4]研究植物乳桿菌發(fā)酵對玉米麩皮的影響，結(jié)果表明，可溶性膳食纖維顯著增加，植酸下降，有利于人體對重要礦物質(zhì)元素的吸收。Daria[5]將糖化與釀酒酵母發(fā)酵玉米粉同步進行，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過發(fā)酵后的玉米粉保水性和黏彈性顯著增強。Khan等[6]對比釀酒酵母菌單一發(fā)酵和加入乳酸菌共發(fā)酵對膨化糙米糖化溶液抗氧化性的影響，研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后的溶液抗氧化性更強，釀酒酵母菌和乳酸菌共發(fā)酵還能提高肉桂酸、山柰酚等抗氧化活性物的含量，說明共培養(yǎng)能明顯改善膨化糙米的加工特性。但是對于應(yīng)用植物乳桿菌、釀酒酵母菌及二者復(fù)配發(fā)酵對玉米粉品質(zhì)和風(fēng)味的對比研究鮮見報道。

本研究以未發(fā)酵玉米粉為對照，對自然發(fā)酵、植物乳桿菌、釀酒酵母菌及復(fù)配菌種（植物乳桿菌和釀酒酵母菌）發(fā)酵制得的玉米粉品質(zhì)進行分析，綜合比較玉米粉的糊化特性、微觀結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)成分、風(fēng)味以及發(fā)酵效率確定最佳發(fā)酵方式，以此改善玉米粉的品質(zhì)，提高玉米的利用率，旨在為發(fā)酵玉米粉的菌種選擇和發(fā)酵玉米粉在食品中的進一步應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米碴品種為先玉335；植物乳桿菌菌粉 鄭州宇控生物科技有限公司；釀酒酵母菌菌粉 安琪酵母股份有限公司；硫酸、氫氧化鈉、鹽酸、乙醇、對硝基苯酚、考馬斯亮藍G-250 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；硫酸銅 上海源葉生物科技有限公司；牛血清白蛋白 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9240A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；V-5000可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；ARRW60型電子精密天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 攻義市英峪高科儀器廠；Hitachi SU-8010鎢絲燈掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；PEN3電子鼻 德國Airsense公司；RVA-Super3-型快速黏度分儀 澳大利亞新港科學(xué)儀器公司；PHS-3C pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米粉發(fā)酵工藝

以玉米碴為原料進行發(fā)酵，工藝流程如下：

根據(jù)前期實驗結(jié)果，以玉米粉的溶解度和膨脹勢為指標(biāo)，獲得不同發(fā)酵方式最佳條件為：自然發(fā)酵：25 ℃，13 d；植物乳桿菌發(fā)酵：35 ℃，72 h，10%；釀酒酵母菌發(fā)酵：35 ℃，18 h，4%；復(fù)配菌種發(fā)酵：28 ℃，48 h，6%，1∶1。以此發(fā)酵制得的玉米粉為處理組，以未發(fā)酵玉米粉為對照組，對比不同發(fā)酵方式對玉米粉品質(zhì)和風(fēng)味的影響。

1.3.2 發(fā)酵液pH值及可滴定酸度的測定

按照參照文獻[7]的方法。取適量發(fā)酵液，用pH計測定pH值，酸堿滴定法測定可滴定酸度。

1.3.3 糊化特性的測定

稱取玉米粉樣品3.50 g，與25 mL蒸餾水一并倒入RVA測試罐中，攪拌至無結(jié)塊狀態(tài)后，安裝測試罐和漿葉進行測定。程序設(shè)定為：起始溫度50 ℃，持續(xù)1 min，再以12 ℃/min速率升溫至95 ℃，保持2.5 min，再以12 ℃/min速率降溫至50 ℃，保持2 min，測定過程總計13 min。

1.3.4 微觀結(jié)構(gòu)的測定

將少許玉米粉固定于樣品載體片上，放置于鎢燈絲掃描電子顯微鏡下拍攝有代表性的顆粒形貌。觀察時放大倍率為3500 倍和5000 倍，壓力5.00 kV。

1.3.5 營養(yǎng)成分的測定

水分含量：參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》直接干燥法；粗蛋白質(zhì)含量：參照考馬斯亮藍比色法[8]；粗脂肪含量：參照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》酸水解法；粗灰分含量：參照GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》干法灰化；粗纖維含量：參照GB/T 5515—2008《糧油檢驗 糧食中粗纖維素含量測定》介質(zhì)過濾法；淀粉含量：參照GB 5009.9—2016《食品中淀粉的測定》酶水解法。

1.3.6 風(fēng)味分析

參照文獻[9]的方法用電子鼻測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵方式對玉米發(fā)酵液pH值和可滴定酸度的影響

如圖1所示，隨著發(fā)酵時間的延長，4 種發(fā)酵方式的發(fā)酵液pH值呈下降趨勢，可滴定酸度呈上升趨勢。

圖1 發(fā)酵過程中發(fā)酵液的pH值和可滴定酸度的變化Fig.1 Changes in pH and titratable acidity of fermentation broth during fermentation process

自然發(fā)酵前期0～8 d，pH值下降和可滴定酸度升高比較明顯，此時發(fā)酵液中的乳酸菌可能成為優(yōu)勢菌群，乳酸菌活力較強，但是相比菌種發(fā)酵而言，其發(fā)酵液內(nèi)優(yōu)勢菌菌落數(shù)較少，會與雜菌爭奪營養(yǎng)物質(zhì)，發(fā)酵周期相對較長。發(fā)酵8～13 d，發(fā)酵液的pH值和可滴定酸度趨于穩(wěn)定，此時的優(yōu)勢菌群為乳酸菌和酵母菌[10]，兩種菌可以互相利用產(chǎn)生次代謝產(chǎn)物，使發(fā)酵環(huán)境達到平衡。隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液的pH值逐漸上升，可滴定酸度逐漸下降，發(fā)酵液也逐漸開始變渾濁，出現(xiàn)酸臭味。

植物乳桿菌發(fā)酵前期0～72 h，pH值從5.34降至3.36，可滴定酸度從0.07%上升至3.64%，該階段營養(yǎng)豐富，植物乳桿菌活力強，菌落數(shù)量多且是發(fā)酵液內(nèi)唯一的優(yōu)勢菌，繁殖加快，產(chǎn)酸量較大。72 h后pH值和可滴定酸度逐漸趨于平穩(wěn)。發(fā)酵后期，pH值開始回升，可滴定酸度呈下降趨勢，說明植物乳桿菌的產(chǎn)酸能力逐漸降低。

釀酒酵母菌在發(fā)酵前期0～12 h，pH值下降和可滴定酸度上升相對較快，說明釀酒酵母能夠利用玉米中的營養(yǎng)物質(zhì)，并且產(chǎn)生部分酸性物質(zhì)；發(fā)酵后期pH值有回升現(xiàn)象，可滴定酸度也開始下降，可能是釀酒酵母菌生長需要消耗糖，隨著糖含量的減少，釀酒酵母菌開始利用乙酸與鈉離子結(jié)合生成乙酸鈉，與此同時也會利用氨基酸的羧基，導(dǎo)致羥基相對較多，造成酸含量下降[11]。

復(fù)配菌種發(fā)酵前期0～12 h，pH值下降速度和可滴定酸度上升速度相對緩慢，釀酒酵母菌優(yōu)先利用營養(yǎng)物質(zhì)，對植物乳桿菌產(chǎn)酸稍有抑制。有研究表示，酵母菌與乳酸菌的共存體系中存在適應(yīng)反應(yīng)機制，如果這種機制被激活，兩種菌會產(chǎn)生“交叉保護”的現(xiàn)象，隨著發(fā)酵時間的推進，兩種菌的活力并沒有降低，而是互相利用，達到穩(wěn)定共生的平衡體系[12]，產(chǎn)酸量增大，pH值下降和可滴定酸度上升趨勢加快，相比自然發(fā)酵，復(fù)配菌種代謝活躍，幾乎不與其他雜菌產(chǎn)生種內(nèi)競爭。60 h后，兩種菌的活力逐漸下降，營養(yǎng)物質(zhì)越來越少，因此走向自溶或衰亡。

2.2 發(fā)酵方式對玉米粉糊化特性的影響

圖2結(jié)合表1可知，發(fā)酵后的玉米粉糊化溫度和峰值時間顯著增高（P＜0.05）。復(fù)配菌種發(fā)酵的玉米粉糊化溫度達到73.6 ℃，顯著高于自然發(fā)酵（72.3 ℃）、植物乳桿菌（73 ℃）和釀酒酵母菌發(fā)酵的玉米粉（73 ℃）（P＜0.05），說明在發(fā)酵過程中，總淀粉含量增加，淀粉分子結(jié)構(gòu)降解，直鏈淀粉含量的增加，使淀粉分子之間相互作用增加，分子間有序性提高，支鏈淀粉的增加使玉米粉不易糊化[13]。玉米粉峰值黏度和最終黏度經(jīng)過發(fā)酵后顯著降低（P＜0.05），經(jīng)過自然發(fā)酵、植物乳桿菌、釀酒酵母菌和復(fù)配菌種發(fā)酵后，玉米粉的峰值黏度分別降低了27%、22.8%、7.7%和26.4%。植物乳桿菌和復(fù)配菌種發(fā)酵的玉米粉的保持黏度顯著低于未發(fā)酵、自然發(fā)酵和釀酒酵母菌發(fā)酵的玉米粉（P＜0.05），可能這兩種發(fā)酵方式產(chǎn)乳酸量較大，破壞了淀粉無定形區(qū)域的結(jié)構(gòu)，使淀粉增強了與水的結(jié)合能力[14]。

圖2 玉米粉的RVA糊化曲線Fig.2 RVA pasting curves of maize flour

表1 玉米粉的糊化特征值分析Table 1 Pasting characteristics of maize flour

衰減值反映淀粉在加熱過程中的穩(wěn)定性，衰減值越小，淀粉顆粒穩(wěn)定性越好，加熱攪拌時越不容易被破壞[15]?；厣捣从车氖堑矸酆罄匣厣乃俣?，淀粉的回生值越高，越容易老化[16]。未發(fā)酵玉米粉衰減值為2254 cP，回生值為2253 cP，發(fā)酵后對玉米粉衰減值和回生值均顯著下降（P＜0.05）。自然發(fā)酵和復(fù)配菌種發(fā)酵的玉米粉衰減值分別降低了45.7%和45%，同樣，經(jīng)過這兩種發(fā)酵后的玉米粉回生值分別降低了40%和37.4%，說明經(jīng)過自然發(fā)酵和復(fù)配菌種發(fā)酵后的玉米粉穩(wěn)定性和抗老化性能得到進一步提高。

2.3 發(fā)酵方式對玉米粉微觀結(jié)構(gòu)的影響

將玉米粉顆粒放大3500 倍可見，發(fā)酵后的玉米粉顆粒表面破壞性較大，類似侵蝕的痕跡較明顯。相比來說，未發(fā)酵玉米粉顆粒（圖3A1）較大，復(fù)配菌種發(fā)酵后的玉米顆粒（圖3E1）相對較小，主要是由于發(fā)酵過程中無定形區(qū)域和部分結(jié)晶區(qū)域水解造成的[17]。圖3B2和圖3D2分別是經(jīng)過自然發(fā)酵和釀酒酵母菌發(fā)酵后的玉米粉顆粒，顆粒表面出現(xiàn)許多大小不同的孔洞，因為發(fā)酵過程中會產(chǎn)生許多蛋白酶，經(jīng)過酶水解，致使淀粉和蛋白分離[18]。將顆粒放大5000 倍可見，經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵過后的玉米粉顆粒，顆粒的結(jié)構(gòu)較松散（圖3C2），發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)和脂肪被降解，致密表面結(jié)構(gòu)被破壞，形成空心骨架，表面積增加，有利于吸收其他化合物[19]。復(fù)配菌種發(fā)酵后的玉米粉顆粒，表面結(jié)構(gòu)破壞最嚴重（圖3E2），由于發(fā)酵過程中植物乳桿菌和釀酒酵母菌的協(xié)同作用，營養(yǎng)物質(zhì)被降解的同時，分子鏈也受到嚴重破壞，使支鏈淀粉中短鏈含量增加，導(dǎo)致分子鏈之間的高度松散[20]，這有助于提高玉米粉的理化性質(zhì)和功能特性。

圖3 玉米粉微觀結(jié)構(gòu)Fig.3 Microstructure of maize flour

2.4 發(fā)酵方式對玉米粉營養(yǎng)成分的影響

發(fā)酵是食品中的重要加工技術(shù)，不但可以提高感官品質(zhì)，還可以減少病原微生物，增強食品的營養(yǎng)價值，滿足人類的需求[21]。結(jié)合表2可知，發(fā)酵前后玉米粉的水分含量均無顯著差異。經(jīng)過發(fā)酵后的玉米粉粗蛋白含量顯著降低（P＜0.05），可能是乳酸中的α-羥基結(jié)構(gòu)與多肽鏈上的基團相互作用，形成氫鍵，促進蛋白的溶出[22]，經(jīng)釀酒酵母菌和復(fù)配菌種發(fā)酵的玉米粉粗蛋白含量下降幅度較大，分別降低了4.9%和5.98%。原因主要分為以下兩方面：一方面因為這兩種發(fā)酵方式在發(fā)酵過程中不但產(chǎn)生乳酸，釀酒酵母菌還會產(chǎn)生有機酸，通過三羧酸循環(huán)參與酶反應(yīng)，可以加速蛋白酶的產(chǎn)生，從而加速蛋白的降解[23]，另一方面，蛋白質(zhì)在水解過程中會產(chǎn)生游離氨基酸和多肽，這是微生物生長和植物乳桿菌產(chǎn)有機酸所必需的[24]，因此復(fù)配菌種發(fā)酵對粗蛋白的影響最大，同樣，脂肪在發(fā)酵過程中也被產(chǎn)生的脂肪氧化酶降解[25]。發(fā)酵后的玉米粉粗脂肪含量顯著下降（P＜0.05），復(fù)配菌種發(fā)酵的玉米粉粗脂肪含量降低了1.32%。由于發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)和脂肪被降解，所以包裹在其中的礦物質(zhì)也被釋放出來，而且在植物乳桿菌發(fā)酵過程中也會產(chǎn)生葡萄糖苷酶，對粗纖維有降解作用[26]，發(fā)酵后的玉米粉粗灰分和粗纖維均顯著降低（P＜0.05）。同時發(fā)酵過程中支鏈淀粉結(jié)構(gòu)相對疏松，會優(yōu)先被利用，支鏈淀粉質(zhì)量分數(shù)相對會有所下降，但是隨著發(fā)酵過程中微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的消耗以及產(chǎn)生的蛋白酶和脂肪酶的作用，蛋白質(zhì)和脂肪被降解，包裹在蛋白質(zhì)和脂肪中的淀粉被釋放出來[27]。

表2 玉米粉中主要營養(yǎng)成分質(zhì)量分數(shù)Table 2 Content of major nutrients in maize flour before and after fermentation%

2.5 發(fā)酵方式對玉米粉風(fēng)味特性的影響

主成分分析（principal component analysis，PCA）累計貢獻率主要反映樣品的信息，貢獻率越大，信息越清晰；不同樣品所對應(yīng)的橫縱坐標(biāo)距離表示不同樣品間的風(fēng)味差異，距離越大，風(fēng)味差異越大[28]。電子鼻PCA如圖4所示，PC1貢獻率為93.44%，PC2貢獻率為5.38%，總貢獻率為98.82%，說明2 個PC能夠反映指標(biāo)的信息。5 種玉米粉樣品在圖中分布相對比較明顯，其中未發(fā)酵玉米粉樣品與植物乳桿菌發(fā)酵玉米粉重合較多，說明二者揮發(fā)性成分相差不大，由于發(fā)酵過程水解了玉米粉中的有機物復(fù)合大分子，部分芳香類有機物被釋放，但是又流失了一部分游離態(tài)芳香類有機物，而且發(fā)酵過程中會有部分有機物相互抵消，所以產(chǎn)品風(fēng)味的變化相似[29]。植物乳桿菌、釀酒酵母菌和復(fù)配菌種發(fā)酵玉米粉之間距離較遠，說明三者的揮發(fā)性物質(zhì)差異較大，自然發(fā)酵和其他3種發(fā)酵方式都有小部分重合，因為植物乳桿菌和釀酒酵母菌都存在于自然發(fā)酵的過程中，有些揮發(fā)性物質(zhì)也是由它們產(chǎn)生的，所以揮發(fā)性物質(zhì)會有重合的部分?？傮w看來，電子鼻PCA可以明顯對未發(fā)酵及不同發(fā)酵方式的玉米粉進行區(qū)分。

圖4 玉米粉的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)PCAFig.4 PCA plot of volatile flavor substances in maize flour

利用電子鼻的10 個傳感器鑒定5 種不同玉米粉中的揮發(fā)性成分（圖5）。未發(fā)酵玉米粉樣品中，W6S、W5C、W1S傳感器相對敏感，表明樣品中氫化物、烷烴和芳香類物質(zhì)相對較多。經(jīng)過發(fā)酵后，W3C、W1S、W2S傳感器數(shù)據(jù)均有明顯增加，說明發(fā)酵對芳香類物質(zhì)、烷烴和醇類物質(zhì)影響較大。由于釀酒酵母菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生酒精，增加玉米粉醇類化合物的產(chǎn)生，醇類會賦予發(fā)酵產(chǎn)物不同的芳香，例如酒香、果香等[30]，所以W2S和W3C所對應(yīng)的傳感器響應(yīng)值較強。植物乳桿菌是自然發(fā)酵玉米粉中的優(yōu)勢菌群，單菌發(fā)酵過程中，由于缺少其他菌種的協(xié)同作用，所以與自然發(fā)酵相比，響應(yīng)值差異不明顯。經(jīng)過復(fù)配菌種發(fā)酵制得的玉米粉相比其他3 種方式發(fā)酵粉，W1C、W5S、W1S傳感器對其較敏感，響應(yīng)值增加較多，說明經(jīng)植物乳桿菌和釀酒酵母菌復(fù)配發(fā)酵的玉米粉可以更好提高芳烴化合物、氮氧化合物和醇類物質(zhì)的揮發(fā)，同時，由于植物乳桿菌和釀酒酵母菌的協(xié)同作用，發(fā)酵過程中會產(chǎn)生更多有機酸、多糖和酶等物質(zhì)，使玉米粉帶有淡淡水果香氣[31]。W2W傳感器對有機硫化物較靈敏，大多硫化物對樣品的氣味會產(chǎn)生消極影響，例如臭雞蛋味，經(jīng)過釀酒酵母菌和復(fù)配菌種發(fā)酵后，傳感器響應(yīng)值降低。

圖5 玉米粉的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析Fig.5 Analysis of volatile flavor substances in maize flour

3 結(jié)論

利用植物乳桿菌和釀酒酵母菌復(fù)配發(fā)酵玉米粉，發(fā)酵后的玉米粉糊化溫度顯著升高（P＜0.05），衰減值和回生值顯著降低（P＜0.05），經(jīng)復(fù)配菌種發(fā)酵后制得的玉米粉衰減值和回生值降幅最大，分別降低了45%和37.4%；發(fā)酵前后水分含量差異不顯著，其他成分均顯著下降（P＜0.05），總淀粉含量顯著上升（P＜0.05），粗蛋白、粗脂肪等在發(fā)酵過程中被降解，其中植物乳桿菌和復(fù)配菌種發(fā)酵對玉米粉表面破壞較嚴重，改變了玉米粉的結(jié)構(gòu)；釀酒酵母菌和復(fù)配菌種發(fā)酵產(chǎn)生的香氣及代謝產(chǎn)物有效改善了發(fā)酵玉米粉的不良氣味。植物乳桿菌、釀酒酵母菌和復(fù)配菌種發(fā)酵可以將玉米粉自然發(fā)酵所需的13 d分別縮短至72、18 h和48 h，有效提高了生產(chǎn)效率。經(jīng)復(fù)配菌種發(fā)酵后制得品質(zhì)、風(fēng)味且加工性能更加優(yōu)良的玉米粉。此研究為玉米粉的品質(zhì)改善與應(yīng)用、提高玉米的加工利用率以及發(fā)酵玉米粉的菌種選擇提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。