邵麗君，琚飛龍，鐘 楊，周穎娣，李貝貝，凌依凡，孫 玥，梁 進(jìn)，李雪玲

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品加工工程實驗室，安徽 合肥 230036）

多糖應(yīng)用廣泛，其可應(yīng)用在食品、藥品和化妝品領(lǐng)域，是目前研究熱點之一[1-3]。國內(nèi)外學(xué)者都在嘗試從自然界找到對人類有益的多糖，并且眾多研究也發(fā)現(xiàn)多糖的結(jié)構(gòu)決定其功效[4]。多糖的結(jié)構(gòu)受許多因素的影響，如提取條件[5]、脫色方式[6]等。其中，針對脫色方式對多糖結(jié)構(gòu)的影響，課題組前期研究已驗證了不同脫色處理對百蕊草（Thesium chinenseTurcz.）多糖的一級結(jié)構(gòu)存在影響[7]。多糖可以開發(fā)為藥品、保健品、食品添加劑及活性物質(zhì)遞送載體等。開發(fā)用途不同，多糖精制時采用的脫色方法可能也不同。

百蕊草多糖水溶性很好，但本身不易形成凝膠。目前卡拉膠工業(yè)化程度高、世界總產(chǎn)量高、應(yīng)用前景廣泛[8]，可作為與百蕊草多糖復(fù)配的材料。課題組前期研究比較了百蕊草多糖與瓜爾豆膠、黃原膠、海藻酸鈉、亞麻籽膠、卡拉膠和明膠6 種食用膠復(fù)配的效果，發(fā)現(xiàn)百蕊草多糖與卡拉膠的協(xié)同作用最明顯[9]。然而，百蕊草多糖與卡拉膠之間的復(fù)配特性卻鮮見報道。

在前期研究的基礎(chǔ)上，本實驗以百蕊草多糖為研究對象，進(jìn)一步比較過氧化氫和活性炭兩種脫色方式處理得到的多糖樣品在結(jié)構(gòu)、抑制肝癌細(xì)胞以及與κ-卡拉膠復(fù)配等方面的差異，旨在為百蕊草多糖的結(jié)構(gòu)解析以及生物活性的研究提供一定理論依據(jù)，同時為多糖的脫色工藝提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百蕊草 安徽省亳州市中藥材市場；活性炭上海羅恩試劑有限公司；κ-卡拉膠 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑皆為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

H-H恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市金城國勝實驗儀器廠；TTR-型X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀 日本理學(xué)株式會社；YRE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 河南省鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；DHR-1旋轉(zhuǎn)流變儀 美國TA儀器公司；Forma 3111二氧化碳培養(yǎng)箱 美國Thermo Electron公司；DelsaMax Pro粒度分析儀 美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖的制備

參考課題組前期研究的方法[7]，以百蕊草為實驗材料，采用水提醇沉的方式提取粗多糖，分別用過氧化氫和活性炭對百蕊草粗多糖進(jìn)行脫色，過氧化氫脫色的樣品記為HTP，活性炭脫色的樣品記為CTP。

1.3.2 百蕊草多糖物理特性測定

1.3.2.1 XRD測定[10]

將多糖樣品冷凍干燥，磨成粉末后過200 目篩，利用TTR型XRD儀進(jìn)行分析。掃描范圍2θ0°～60°，掃描步長0.02°，電壓40 kV，電流200 mA，掃描頻率8°/min。樣品無損檢測結(jié)束后進(jìn)行回收。

1.3.2.2 熱力學(xué)性質(zhì)測定[11]

采用熱重（thermo-gravimetric，TG）法進(jìn)行分析。稱取樣品3～5 mg，以氮氣作為載體，采用程序升溫，升溫速率10.0 K/min，起始溫度為30 ℃。

1.3.2.3 粒徑分布測定[12]

將凍干后的樣品用蒸餾水配制成適宜濃度的溶液。所有樣品均過0.45 μm纖維素濾膜后，使用DelsaMax Pro粒度分析儀在25 ℃測定樣品的平均粒徑以及粒徑分布，本實驗以半徑表示粒徑。每個樣品測定5 次。

1.3.2.4 表觀黏度測定[13]

利用旋轉(zhuǎn)流變儀對樣品的流變學(xué)行為進(jìn)行測定。分別稱取多糖樣品配制成不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（1%、2%和4%）的多糖溶液，渦旋溶解均勻，80 ℃水浴30 min充分溶脹后取出。冷卻至室溫，置于4 ℃冰箱中過夜。測量前將多糖樣品轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)流變儀上。樣品周圍涂一層硅油以防止水分蒸發(fā)，測量溫度25 ℃，剪切速率范圍0.01～100 s-1。記錄樣品表觀黏度隨剪切速率的變化。

1.3.3 HTP、CTP與κ-卡拉膠復(fù)配凝膠樣品制備及動態(tài)流變學(xué)參數(shù)測定[14]

將不同質(zhì)量的多糖樣品充分溶解在蒸餾水中，添加κ-卡拉膠粉末，使得整個體系中多糖與κ-卡拉膠質(zhì)量比分別為0∶2.0、0.2∶1.8和0.6∶1.4。將混合溶液調(diào)節(jié)至pH 7.0，80 ℃恒溫水浴30 min。將混合凝膠樣品轉(zhuǎn)移到已經(jīng)預(yù)熱至70 ℃的動態(tài)旋轉(zhuǎn)流變儀平板上，并在平板周圍用硅油封邊，防止水分揮發(fā)對樣品產(chǎn)生影響，70 ℃平衡5 min，松弛混合凝膠中存在的螺旋結(jié)構(gòu)，首先進(jìn)行降溫掃描，再進(jìn)行升溫掃描，測定不同溫度下混合凝膠的儲能模量（G’）與損耗模量（G”），測定復(fù)配凝膠的膠凝溫度（Tg）及溶膠溫度（Tm）。設(shè)置升溫掃描溫度范圍為25～80 ℃，降溫掃描溫度范圍為80～25 ℃，階躍溫度為3 ℃/min，固定頻率為1 Hz，儀器修邊間隙設(shè)置為1050 μm，測量間隙為1000 μm。

1.3.4 HTP、CTP對人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖的抑制活性測定

根據(jù)Pires等[15]的方法，使用DMEM培養(yǎng)基，在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。本研究中使用的細(xì)胞介于第20代和第30代之間。

使用MTT法研究不同質(zhì)量濃度的多糖樣品對HepG2細(xì)胞的毒性。將處于指數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種到96 孔板（4×104個/孔，37 ℃）中，孵育24 h后除去培養(yǎng)基，多次沖洗孔板，除去多余培養(yǎng)基及死細(xì)胞。隨后將50 μL不同質(zhì)量濃度（1.0～10.0 mg/mL）的多糖樣品分別添加到細(xì)胞中，孵育4 h。孵育結(jié)束后分別將20 μL 0.5 mg/mL MTT添加到每個孔中，反應(yīng)1 h。最后，將生成的結(jié)晶溶解在二甲基亞砜中，并在570 nm波長處測定吸光度，通過下式計算細(xì)胞存活率：

式中：AS為多糖樣品處理組吸光度；AC為不含多糖樣品處理組吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同脫色處理對百蕊草多糖熱力學(xué)性質(zhì)的影響

由圖1A可知，隨著溫度升高樣品的質(zhì)量減少。由圖1B可知，導(dǎo)數(shù)熱重（derivative thermogravimetry，DTG）曲線中HTP和CTP第1個失重峰發(fā)生在150 ℃前，這是由樣品中水分的蒸發(fā)造成整體質(zhì)量減少引起，說明HTP和CTP中含有一定量的結(jié)合水[16]。在這一階段HTP質(zhì)量損失率為8.87%，CTP質(zhì)量損失率為5.43%（圖1A）。隨著溫度的增加，兩種樣品的第2個失重峰分別出現(xiàn)在150～400 ℃（CTP）、200～400 ℃（HTP）范圍內(nèi)。在此溫度范圍內(nèi)，HTP的TG值由90.91%降低至47.20%，CTP的TG值由95.57%降低至54.54%（圖1A）。這說明兩種樣品在此期間都發(fā)生了劇烈的分解反應(yīng)。此外，DTG曲線中HTP的第2個失重峰值對應(yīng)的溫度大于CTP，說明HTP在150～400 ℃具有更好的熱穩(wěn)定性。這可能與多糖本身的大分子結(jié)構(gòu)有關(guān)系。CTP具有更高的分子質(zhì)量、側(cè)鏈多、結(jié)構(gòu)松散[7]。部分外圍側(cè)鏈在較低溫度下就會發(fā)生分解。當(dāng)溫度升高到500 ℃后，兩種樣品都發(fā)生了緩慢分解，這可能是多糖的主鏈開始分解；溫度升至800 ℃時，兩種樣品的質(zhì)量損失率分別為59.33%（HTP）、53.21%（CTP）（圖1A），這說明HTP熱分解程度大于CTP。

圖1 HTP和CTP的TG分析圖譜Fig.1 TG analysis of hydrogen peroxide-and activated carbon-treated samples

2.2 不同脫色處理對百蕊草多糖表觀黏度的影響

如圖2所示，HTP和CTP的表觀黏度都表現(xiàn)出隨剪切速率的增加而逐漸減小的趨勢，這是典型的剪切稀釋現(xiàn)象，說明HTP和CTP都是非牛頓流體。這是因為在剪切稀釋過程中，聚合物大分子長而無序的鏈結(jié)構(gòu)越來越趨向一致，使彼此間的交互作用減弱。這一現(xiàn)象也發(fā)生在其他植物多糖中[17-18]。除此之外，兩種樣品的黏度都表現(xiàn)出隨多糖添加量增加而變大的現(xiàn)象，這是由于多糖含量增多會增加分子間的相互作用，導(dǎo)致多糖的聚合度增加[19]?？傮w上，CTP樣品的表觀黏度大于相同添加量的HTP樣品，這可能與HTP及CTP之間結(jié)構(gòu)的差異有關(guān)。聚合物分子質(zhì)量大，流動性差，表觀黏度高[20-21]。而CTP的摩爾質(zhì)量（3.064×105g/mol）遠(yuǎn)大于HTP（8.349×104g/mol），故CTP樣品的表觀黏度大于相同添加量的HTP樣品。

圖2 不同剪切速率的HTP和CTP表觀黏度Fig.2 Apparent viscosity of hydrogen peroxide-and activated carbontreated samples at different shear rates

2.3 不同脫色處理的百蕊草多糖XRD圖譜分析

由圖3可知，HTP是一種典型的半晶聚合物，在測量角度范圍內(nèi)無定形組分比晶體組分占優(yōu)勢；CTP在多角度具有尖銳的衍射峰，這說明CTP比HTP具有更高的結(jié)晶度[22]。這與兩種樣品間單糖組成、分子質(zhì)量差異有關(guān)[23]。結(jié)晶度會對樣品的熱穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，CTP的熱穩(wěn)定性優(yōu)于HTP，這兩項結(jié)果也相互印證。

圖3 HTP和CTP的XRD圖譜Fig.3 XRD pattern of hydrogen peroxide-and activated carbontreated samples

2.4 不同脫色處理的百蕊草多糖粒徑分布分析

如圖4A所示，HTP多糖樣品的粒徑分布圖上存在3 個峰，其各組分峰值對應(yīng)的粒徑大小分別是6.5、63.0、545.3 nm，其中粒徑大小為63.0 nm左右的多糖分子分布較多。如圖4B所示，CTP多糖樣品的粒度分布圖上只出現(xiàn)2 個峰，其峰值對應(yīng)的粒徑大小分別為5.5 nm和82.7 nm，粒徑分布相對集中。因此，HTP和CTP多糖分子在粒徑分布上存在一定差異，HTP多糖樣品的粒徑分布圖在500 nm左右出現(xiàn)了一個小峰，說明HTP多糖樣品中可能存在較大粒徑的多糖分子聚集體，這可能與HTP多糖分子中含有較多的極性基團(tuán)有關(guān)。因為，溶液中的多糖大分子做布朗運動，多糖分子之間會相互碰撞發(fā)生聚集，當(dāng)聚集達(dá)到一定程度后有可能出現(xiàn)較大的多糖分子聚集體，從而呈現(xiàn)出較大的粒徑分布[24]。結(jié)合前期研究發(fā)現(xiàn)，HTP含有更多醛基和羥基，化學(xué)性質(zhì)更加活潑，更容易形成氫鍵，聚合成大分子。

圖4 HTP（A）和CTP（B）粒徑分布圖Fig.4 Particle size distribution of hydrogen peroxide-(A) and activated carbon-treated (B) samples

2.5 不同脫色處理的百蕊草多糖對肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用

天然的硫酸多糖較少，且以藻類為主[25]。已有較多報道表明，硫酸多糖或者硫酸化的多糖具有多種生物活性，如抑制癌細(xì)胞增殖、抗凝血、抗炎等[26-27]。

由圖5可知，在低質(zhì)量濃度（1～6 mg/mL）時，HTP和CTP對肝癌細(xì)胞抑制作用較小且劑量效應(yīng)不明顯；在實驗設(shè)置的高質(zhì)量濃度（6～10 mg/mL）范圍內(nèi)，CTP表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)，質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，肝癌細(xì)胞的存活率只有46.20%，此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，HTP對肝癌細(xì)胞的抑制作用較小。因此，CTP和HTP對肝癌細(xì)胞的抑制作用有明顯差異，推測可能是CTP和HTP的硫酸基團(tuán)數(shù)量和水溶性不同所致。前期研究發(fā)現(xiàn)，CTP的硫酸基團(tuán)含量為（14.33±0.04）%，而HTP的硫酸基團(tuán)含量只有（7.03±0.03）%，且二者水溶性差異明顯（HTP：（75.33±0.12）%，CTP：（99.70±0.15）%）；楊東達(dá)[28]發(fā)現(xiàn)多糖的抗腫瘤活性與硫酸基團(tuán)數(shù)量及其水溶性有極大關(guān)聯(lián)性，這些與圖5的結(jié)果一致。

圖5 不同質(zhì)量濃度HTP和CTP對HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.5 Effects of different concentrations of hydrogen peroxide-and activated carbon-treated samples on survival rate of HepG2 cells

2.6 不同脫色處理的百蕊草多糖對卡拉膠Tg及Tm的影響

溫度降溫掃描過程中，G’及G”發(fā)生變化；當(dāng)G’與G”出現(xiàn)交叉點時，該點對應(yīng)的溫度為Tg。升溫掃描過程中，G’＝G”時，該點對應(yīng)的溫度為Tm。溫度滯后性就是Tg遠(yuǎn)低于Tm，其在食品工業(yè)生產(chǎn)中有重要的意義；有些制品要求在熱處理過程中凝膠結(jié)構(gòu)能保持相對穩(wěn)定，如瓊脂的很多應(yīng)用就依賴于其顯著的溫度滯后現(xiàn)象[29]。

由圖6和表1可知，添加了HTP及CTP復(fù)配膠的溫度滯后幅度都增加，且CTP的增加幅度大于HTP。通過改變HTP及CTP添加量，可以得到滿足需要的各種卡拉膠膠凝劑復(fù)配產(chǎn)品，如低添加量（0.2%）可以提高Tg、Tm，這對于要求在熱處理過程中凝膠結(jié)構(gòu)能保持相對穩(wěn)定的制品較有利；而高添加量（0.6%）可以降低Tg、Tm，這對于卡拉膠應(yīng)用于培養(yǎng)基膠凝劑有利。

圖6 不同添加量HTP和CTP對κ-卡拉膠共混凝膠G’和G”的影響Fig.6 Effects of different concentrations of hydrogen peroxide-and activated carbon-treated polysaccharides on G’ and G” of their blends with κ-carrageenan

表1 不同添加量HTP和CTP對κ-卡拉膠共混凝膠Tg和Tm的影響Table 1 Effects of different concentrations of hydrogen peroxide-and activated carbon-treated polysaccharides on Tg and Tm of their blends with κ-carrageenan

3 結(jié)論

經(jīng)過氧化氫脫色制備的百蕊草多糖，分子質(zhì)量小，分子中含有更多半乳糖醛酸基團(tuán)，熱穩(wěn)定性稍差；而活性炭脫色制備的百蕊草多糖，分子質(zhì)量大，分子中含有較多硫酸基團(tuán)，熱穩(wěn)定性好。與HTP相比，CTP表現(xiàn)出更大的表觀黏度。結(jié)構(gòu)上的差異使兩種多糖HTP、CTP在應(yīng)用特性上也表現(xiàn)出不同，CTP對肝癌細(xì)胞HepG2表現(xiàn)出更強的抑制活性，而HTP在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對肝癌細(xì)胞HepG2的抑制活性較低；同時，CTP對復(fù)配膠的溫度滯后增加幅度大于HTP，這有利于擴大κ-卡拉膠在食品加工行業(yè)中的應(yīng)用。本實驗可為開發(fā)多糖時選擇合適的脫色方式提供一定參考。