康夢(mèng)雪，孫禹凡，宋晗鈺，鐘明明，王 帥，齊寶坤

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

姜黃素是一種存在于姜黃根莖中的低分子質(zhì)量親脂性多酚化合物[1]。姜黃隸屬于姜科，被東南亞等地用作香料、調(diào)味劑、著色劑、防腐劑和傳統(tǒng)藥物。姜黃素是姜黃中最具生物活性的成分，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗糖尿病、抗腫瘤和抗癌等活性；但其水溶性差、化學(xué)不穩(wěn)定、光降解、代謝降解率較高、生物利用度較低等缺點(diǎn)阻礙著姜黃素在食品中的應(yīng)用[2]。近年來(lái)，研究人員通過(guò)包埋，利用乳液、凝膠、脂質(zhì)體、納米晶體等遞送體系穩(wěn)定姜黃素，提高其生物利用度[3]。

油體是植物種子細(xì)胞中貯存脂質(zhì)的細(xì)胞器，是具有內(nèi)核為三酰甘油、被單層磷脂和蛋白質(zhì)包裹、直徑為0.5～2 μm的球形結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)、磷脂和油脂含量分別為0.59%～3.46%、0.59%～1.57%和94.28%～98.17%[4]。由于其天然單層磷脂-蛋白膜結(jié)構(gòu)，油體能均勻分散在水中，形成天然水包油乳液且具有良好穩(wěn)定性[5]。同時(shí)，油體的疏水內(nèi)核可用于溶解油溶性維生素、多酚等非極性生物活性物質(zhì)，為油體作為天然運(yùn)載體提供了可能，但由于其穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)較難封裝疏水性營(yíng)養(yǎng)成分，使得該特性并未得到充分利用[6]。近年來(lái)，研究人員試圖利用油體作為載體，通過(guò)加熱法、pH值驅(qū)動(dòng)法、油溶乳化等方法包埋營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行應(yīng)用[6-7]，但由于營(yíng)養(yǎng)成分的不穩(wěn)定性，探究如何將活性物質(zhì)裝載到油體中仍具有重要意義。

pH值偏移法是一種有效改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的方法[8]。其通過(guò)將蛋白質(zhì)等置于堿性或酸性環(huán)境，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，然后調(diào)整到中性環(huán)境，使蛋白質(zhì)分子發(fā)生完全或部分展開(kāi)和重新折疊[9]。蔣將[10]和Kuwajima[11]發(fā)現(xiàn)極端pH值偏移處理有效誘導(dǎo)了大豆蛋白熔球態(tài)，即一種處于變性與未變性之間的穩(wěn)定態(tài)，具有與未變性蛋白相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)，但三級(jí)結(jié)構(gòu)松散。Wang Yuying等[12]研究了pH值偏移處理過(guò)程中大豆蛋白的去折疊-重折疊過(guò)程，并成功制備姜黃素大豆蛋白納米顆粒。

本研究以大豆為原料，采用濕法磨漿的方式從原料中分離富集油體，試圖通過(guò)pH值偏移法使油體蛋白處于熔球態(tài)，制備姜黃素油體乳液，并探究不同pH值偏移法制備姜黃素油體乳液的包封率、粒子特性、顯微結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性，從而考察油體對(duì)親脂性多酚的包埋效果，為油體應(yīng)用提供一種新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆（東農(nóng)52號(hào)） 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所；姜黃素 上海源葉生物科技有限公司；尼羅紅、尼羅藍(lán)美國(guó)Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-21M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HK-02萬(wàn)能粉碎機(jī) 廣州鴻興機(jī)械有限公司；JY92-IIN超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；F-4500型熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；Zetasizer Nano ZS9型粒度及電位分析儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司；UV-6100紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；PHSJ-4A型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；AUY120分析天平（0.0001 g） 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 油體的提取

參照Tzen[13]和李楊[14]等的方法，并稍作修改。清洗大豆，在4～6 ℃下與蒸餾水以1∶5（g/mL）的比例浸泡18～20 h，用組織搗碎機(jī)以18000 r/min磨漿5 min，用4 層脫脂紗布過(guò)濾，除去豆渣、收集濾液。向?yàn)V液中加入20%蔗糖溶液，冰水浴攪拌15 min，并用2 mol/L NaOH溶液將pH值調(diào)節(jié)至11.0，轉(zhuǎn)移至離心桶內(nèi)，4 ℃、15000 r/min離心30 min，收集上層乳狀物，并重復(fù)此步驟2 次，獲得大豆油體富集物。用去離子水清洗大豆油體富集物即得大豆油體，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 姜黃素-油體的制備

取適量姜黃素粉末分散于去離子水中，置于攪拌器上攪拌至分散均勻。用去離子水將油體稀釋?zhuān)⒂? mol/L NaOH溶液將pH值調(diào)至11.0，攪拌均勻，分別用4 mol/L HCl溶液將pH值調(diào)至6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0。加入姜黃素分散液，充分?jǐn)嚢杌旌?、超聲?00 W，4 min）使其接觸均勻。用4 mol/L NaOH溶液將各樣品pH值調(diào)至中性，加去離子水至乳液中油體含量為10%、姜黃素質(zhì)量濃度為2.4 mg/10 mL，并結(jié)合超聲（150 W，8 min）促使其作用均勻。4 ℃、2000 r/min離心2 min去除未包封姜黃素，透析2 d（截留分子質(zhì)量8000 Da）去除乳液中鹽離子。

1.3.3 包封率的測(cè)定

參考Zheng Bingjing等[15]的方法，并稍作改動(dòng)。取1 mL乳液與9 mL二甲基亞砜混合，3000 r/min離心10 min，離心后收集有機(jī)層，重復(fù)萃取2 次合并萃取液。將萃取液稀釋至適宜濃度，420 nm處測(cè)定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.1354x-0.0498，相關(guān)系數(shù)（R2）＝0.9991，計(jì)算姜黃素含量。

按式（1）計(jì)算包封率：

式中：CE為乳液中姜黃素的添加質(zhì)量濃度/（mg/mL）；CI為樣品中測(cè)定的姜黃素質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.4 粒徑、Zeta電位和多相分散指數(shù)的測(cè)定

將油體乳液均勻分散于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中，利用Zetasizer Nano ZS90型粒度與電位分析儀于25 ℃下測(cè)定0.05%油體乳液Zeta電位、平均粒徑和多相分散指數(shù)（polydispersity index，PDI），分散相和連續(xù)相的折射率分為1.456和1.330。

1.3.5 超高分辨顯微鏡觀察

參考Sun Yufan等[16]的方法，并稍作改動(dòng)。將制備好的樣品用PBS（pH 7.4，10 mmol/L）稀釋15 倍，將尼羅藍(lán)、尼羅紅溶于異丙醇中，制成1.0%尼羅藍(lán)染液和0.1%尼羅紅染液。向1 mL樣品中分別加入50 μL尼羅藍(lán)染液、50 μL尼羅紅染液，混合均勻，各避光15 min。將樣品置于載玻片上，蓋上蓋玻片，使用超高分辨率顯微鏡在488 nm和633 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下觀察脂滴形態(tài)、大小。

1.3.6 內(nèi)源熒光光譜的測(cè)定

根據(jù)孫禹凡等[17]的方法，并稍作修改，測(cè)定油體乳液的內(nèi)源熒光光譜。將樣品用10 mmol/L PBS釋至10 倍，將樣品放置在石英比色皿的固體樣品支架中，利用熒光分光光度計(jì)記錄內(nèi)源熒光光譜。激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為300～400 nm，狹縫寬度為5 nm，掃描速率為600 nm/min。

1.3.7 油體表面蛋白提取及表征

參考Ding Jian等[18]的方法，并稍作改動(dòng)。將樣品與丙酮1∶3（V/V）混合，室溫下緩慢搖晃30 min。12000×g離心15 min，收集下層物質(zhì)，重復(fù)上述過(guò)程3 次。最終獲得油體表面蛋白，氮?dú)獯蹈?，冷凍干燥?/p>

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分離膠為12%、濃縮膠為5%，將油體表面蛋白溶于水至蛋白質(zhì)量濃度為3 mg/mL，加入上樣緩沖液，沸水浴5 min，上樣量15 μL，80 V運(yùn)行30 min，120 V運(yùn)行至結(jié)束。用考馬斯亮藍(lán)染液染色后脫色至條帶清晰，利用凝膠成像儀拍照保留。

1.3.8 油體乳析指數(shù)測(cè)定

將新制樣品置于帶塞試管，在常溫下放置14 d，放置后乳液分為兩層，上層為乳析層，下層為清液層。按式（2）計(jì)算乳析指數(shù)：

式中：HS為乳清層的高度；HE為玻璃管中乳液的總高度。

1.3.9 油體pH值穩(wěn)定性的測(cè)定

用1 mol/L HCl或NaOH溶液將新制樣品的pH值分別調(diào)至2、4、6、8、10，利用Zetasizer Nano ZS90型粒度與電位分析儀在25 ℃條件下測(cè)定0.05%不同pH值下油體乳液的Zeta電位和平均粒徑。

1.3.10 油體氧化穩(wěn)定性測(cè)定

將新制樣品乳液放置于45 ℃恒溫恒濕箱中，加速其氧化，利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

1.3.10.1 氫過(guò)氧化物測(cè)定

參考Zhao Luping等[19]的方法，并稍作改動(dòng)。取0.3 mL樣品加入至1.5 mL異辛烷-異丙醇（2∶1，V/V）中，旋渦振蕩30 s，2000×g離心2 min。取200 μL上層有機(jī)相加入至2.8 mL甲醇-正丁醇（2∶1，V/V）中，分別加入30 μL 3.94 mol/L硫氰酸鹽和0.072 mol/L Fe2＋，旋渦混合，避光反應(yīng)20 min。使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品的吸光度，以過(guò)氧化氫異丙苯作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝0.419x-0.0658，R2＝0.990。

1.3.10.2 硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）值測(cè)定

參考武利春等[20]的方法，并稍作改動(dòng)。取1 mL樣品加入至2 mL硫代巴比妥酸測(cè)試液（由15%三氯乙酸、0.375%硫代巴比妥酸和0.25 mol/L HCl組成）中，旋渦混合，沸水浴30 min后冷卻至室溫，過(guò)0.22 μm濾膜。使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度，以1,1,3,3-四乙氧基丙烷作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝0.545x＋0.0732，R2＝0.991。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃素大豆油體乳液的包封率

如圖1所示，隨著pH值減小，油體中姜黃素的包封率由35.46%增加至65.55%。這可能因?yàn)殡S著pH值降低，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生去折疊現(xiàn)象，疏水性增強(qiáng)、二硫鍵打開(kāi)，姜黃素進(jìn)入油體油相內(nèi)核，且處于極端酸性環(huán)境時(shí)，蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)得以充分暴露，蛋白質(zhì)具有相對(duì)柔性的構(gòu)象，更多姜黃素進(jìn)入油體內(nèi)核油相中[21-22]。當(dāng)pH值偏移為1.0時(shí)，油體包封率最高，為65.55%。這可能因?yàn)閜H值偏移引起蛋白質(zhì)產(chǎn)生的“熔球”狀態(tài)，相關(guān)蛋白質(zhì)的側(cè)鏈相互作用變?nèi)?，結(jié)構(gòu)充分展開(kāi)，姜黃素溶于油體油相中，姜黃素包封率達(dá)到最佳[23-24]。

圖1 不同pH值偏移制備的姜黃素油體乳液的包封率Fig.1 Encapsulation efficiencies of curcumin-loaded oil body emulsions prepared at different pH levels

2.2 姜黃素大豆油體乳液的物理特性分析

乳液中脂滴的Zeta電位和平均粒徑是衡量乳液穩(wěn)定性的重要指標(biāo)之一[25]。由表1可知，經(jīng)pH值偏移處理后乳液Zeta電位絕對(duì)值顯著小于未處理樣品（P＜0.05）；除pH值偏移為6.0時(shí)，不同pH值偏移處理的乳液Zeta電位無(wú)顯著區(qū)別（P＞0.05）；處理后樣品PDI顯著大于未處理油體（P＜0.05）。這可能由于油體蛋白分子的N和C末端帶電荷，其正電荷指向內(nèi)部，負(fù)電荷暴露于乳液微環(huán)境中；酸性條件下，油體相關(guān)蛋白發(fā)生質(zhì)子化，產(chǎn)生正電荷，中性條件下時(shí)，蛋白發(fā)生去質(zhì)子化；同時(shí)，酸性環(huán)境使油體蛋白結(jié)構(gòu)擴(kuò)展、表面蛋白結(jié)構(gòu)打開(kāi)，姜黃素得以進(jìn)入油體油相中，但疏水基團(tuán)等相關(guān)基團(tuán)暴露，影響了電荷結(jié)合能力和表面電荷分布，從而導(dǎo)致當(dāng)乳液環(huán)境回到中性時(shí)，表面負(fù)電荷減少，乳液穩(wěn)定性下降[22,26]。

表1 不同pH值偏移制備的姜黃素油體乳液的性質(zhì)表征Table 1 Characteristics of curcumin oil-loaded body emulsions prepared at different pH levels

由圖2可知，不同pH值偏移制備的姜黃素油體乳液粒徑分布形成的峰相似；當(dāng)pH 1.0時(shí)，與其他pH值相比，粒徑明顯增大，粒徑分布形成的峰右移，并呈單峰分布。結(jié)合圖1可得，隨著pH值的降低，油體對(duì)姜黃素的包封率增大，內(nèi)核油相中姜黃素含量增多，從而導(dǎo)致乳液粒徑增大[2]；而當(dāng)pH值處在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（pH 4.0～5.0）附近時(shí)，乳液液滴的雙峰分布可能是由于油體之間靜電斥力不足，其聚集行為使乳液穩(wěn)定性喪失、產(chǎn)生絮凝和分層；pH值恢復(fù)至中性時(shí)，部分乳液因構(gòu)象緊密，未實(shí)現(xiàn)全部分離[22,27]。故經(jīng)pH值偏移后，油體乳液穩(wěn)定性略有降低；而當(dāng)pH值偏移為1.0時(shí)，乳液粒徑呈均勻的單峰分布，表明乳液再次重新排列成相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。

圖2 不同pH值偏移制備的姜黃素油體粒徑體積分布Fig.2 Particle size volume distribution of curcumin-loaded oil body emulsions prepared at different pH levels

2.3 姜黃素大豆油體乳液的微觀結(jié)構(gòu)觀察

如圖3所示，乳液為O/W型，與Sun Yufan等[16]研究結(jié)果一致，油相基本成橢球形或球形，蛋白錨定在油相表面形成閉環(huán)，將油相包裹。

圖3 不同pH值偏移制備的姜黃素油體乳液的微觀結(jié)構(gòu)Fig.3 Microstructure of curcumin-loaded oil body emulsions prepared at different pH levels

由圖3可知，未處理油體脂滴呈球形分布、粒徑最?。划?dāng)pH≤2.0時(shí)，乳液中脂滴分散良好，蛋白和油脂錨定緊實(shí)；當(dāng)pH＞2.0時(shí)，脂滴出現(xiàn)聚集且多呈橢球狀或不規(guī)則狀分布，這與粒徑結(jié)果一致。當(dāng)pH 5.0時(shí)，油脂和蛋白質(zhì)分別聚集，部分蛋白質(zhì)未包裹油相，這可能因?yàn)楫?dāng)環(huán)境接近油體蛋白等電點(diǎn)時(shí)，油體蛋白之間的靜電排斥不足以克服相互吸引作用，蛋白質(zhì)發(fā)生絮集[22]。當(dāng)pH 6.0時(shí)，部分蛋白成雙層殼形網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成不規(guī)則橢球形，這可能由于pH值回歸中性時(shí)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)柔性降低，油脂聚集，為將油脂全部包裹，形成不規(guī)則橢球閉環(huán)；同時(shí)，部分小分子蛋白在閉環(huán)內(nèi)部與其相連接，部分疏水端錨入油脂中，從而形成殼形網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)pH 1.0時(shí)，脂滴多呈球狀分布，這可能因?yàn)樵诙虝旱臉O酸環(huán)境中，油體蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)保持相對(duì)完整，當(dāng)恢復(fù)至中性環(huán)境時(shí)，蛋白結(jié)構(gòu)得以恢復(fù)，使其結(jié)構(gòu)與未處理油體結(jié)構(gòu)相似[22,28]。

2.4 姜黃素大豆油體乳液油體的內(nèi)源熒光光譜分析

內(nèi)源熒光對(duì)色氨酸殘基微環(huán)境和蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化高度敏感。通常，若色氨酸熒光λmax＜330 nm，則將色氨酸指定為掩埋且處于“非極性”環(huán)境中；若λmax＞330 nm，則色氨酸被指定為處于“極性”環(huán)境中。如圖4所示，姜黃素油體的發(fā)射熒光光譜在306 nm波長(zhǎng)處有一個(gè)峰值（小于330 nm），因此油體的色氨酸基團(tuán)處于“非極性”環(huán)境中[28]。

圖4 不同pH值偏移制備的姜黃素油體乳液的內(nèi)源熒光光譜圖Fig.4 Endogenous fluorescence spectra of curcumin-loaded oil body emulsions prepared at different pH levels

如圖4所示，當(dāng)油體經(jīng)極端酸性pH值偏移處理后，其最大波長(zhǎng)未發(fā)生紅移、藍(lán)移，而當(dāng)pH≥4.0時(shí)，λmax紅移1 nm。這可能由于蛋白質(zhì)在極端酸性pH值偏移處理過(guò)程中更容易形成能保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)完整的“熔球”結(jié)構(gòu)，從而減少蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水氨基酸的暴露，這與Yan Shizhang等[24]的研究結(jié)果一致；而當(dāng)偏移環(huán)境接近等電點(diǎn)時(shí)，蛋白分子部分發(fā)色基團(tuán)暴露，色氨酸基團(tuán)向更親水的微環(huán)境移動(dòng)。pH 1.0時(shí)，熒光強(qiáng)度與未處理油體相似，這表明pH 1.0時(shí)，pH值偏移處理未破壞蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)；而pH≥2時(shí)，與未處理油體相比，熒光強(qiáng)度增大，油體蛋白發(fā)生一定的變性和解離。這可能因?yàn)槎虝旱臉O酸環(huán)境未對(duì)油體蛋白結(jié)構(gòu)造成不可逆影響，該結(jié)果與2.3節(jié)中推測(cè)結(jié)果一致；其他pH值下熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，這是因?yàn)樵谡Ｇ闆r下，發(fā)色團(tuán)通常隱藏在分子內(nèi)部，從而表現(xiàn)出較低熒光強(qiáng)度，經(jīng)歷pH值偏移處理后，油體蛋白結(jié)構(gòu)松散，蛋白質(zhì)內(nèi)部的色氨酸殘基等疏水基團(tuán)暴露出來(lái)，從而使熒光強(qiáng)度增加[25]。

2.5 姜黃素大豆油體乳液油體蛋白的SDS-PAGE

油體表面蛋白在維持油體的穩(wěn)定性和調(diào)整油體大小方面起重要作用，為進(jìn)一步探明pH值偏移對(duì)姜黃素油體乳液穩(wěn)定性的影響，不同pH值偏移得到的姜黃素油體相關(guān)蛋白的亞基結(jié)構(gòu)如圖5所示。不同油體蛋白均顯示出內(nèi)源蛋白（分子質(zhì)量15～25 kDa）條帶和外源蛋白（分子質(zhì)量＞33 kDa）條帶。

圖5 不同pH值偏移制備的姜黃素油脂體乳液油體蛋白的SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE patterns of curcumin-loaded oil body emulsions prepared at different pH levels

隨著pH值偏移的增加，外源蛋白含量逐漸增多，同時(shí)出現(xiàn)分子質(zhì)量小于15 kDa的肽；這可能因?yàn)閜H值偏移處理使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)疏散，影響了蛋白質(zhì)分子之間的相互作用，促使外源蛋白分子發(fā)生重排，形成亞基的交聯(lián)[10,29]。而pH 1.0時(shí)，蛋白質(zhì)亞基的種類(lèi)和含量未發(fā)生明顯改變；這可能因?yàn)闃O酸環(huán)境僅打開(kāi)了蛋白質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)，并在中性環(huán)境時(shí)發(fā)生重組、結(jié)構(gòu)恢復(fù)[10]。故當(dāng)pH值偏移為1.0時(shí)，蛋白質(zhì)未發(fā)生實(shí)質(zhì)性改變，與以上研究結(jié)果一致。

2.6 姜黃素大豆油體乳液的穩(wěn)定性分析

2.6.1 貯藏穩(wěn)定性分析

如圖6所示，與未處理油體乳液對(duì)比，經(jīng)pH值偏移制備的姜黃素油體乳液貯藏穩(wěn)定性較差，這與表1結(jié)果一致。這可能由于pH值偏移處理后，油體油-水界面被破壞，油體蛋白疏水基團(tuán)等相關(guān)基團(tuán)暴露，進(jìn)而改變了乳液液滴表面電荷分布，表面負(fù)電荷減少，乳液穩(wěn)定性下降，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，液滴間靜電相互作用減弱，乳液發(fā)生聚集和絮凝[17,22]。

圖6 不同pH值偏移制備的姜黃素油脂體乳液的貯藏穩(wěn)定性Fig.6 Storage stability of curcumin-loaded oil body emulsions prepared at different pH levels

2.6.2 pH值穩(wěn)定性分析

如圖7所示，隨著pH值增加，乳液平均粒徑先增加后減小，Zeta電位逐漸減小。pH 4.0時(shí)，平均粒徑達(dá)到最大，Zeta電位絕對(duì)值最小，乳液表現(xiàn)出不穩(wěn)定；pH 2.0和pH 6.0～10.0時(shí)，乳液表現(xiàn)出較低的平均粒徑和較大的Zeta電位絕對(duì)值，乳液較為穩(wěn)定[30]。這是由于pH 4接近油體蛋白的等電點(diǎn)（pH 4.0～5.0），此時(shí)液滴表面電荷較少，液滴之間靜電相互作用較弱，導(dǎo)致顆粒聚集[7]。

圖7 不同pH值偏移制備的姜黃素油脂體乳液的pH值穩(wěn)定性Fig.7 pH stability of curcumin-loaded oil body emulsions prepared at different pH levels

同時(shí)，與未處理油體乳液對(duì)比，經(jīng)pH值偏移處理的油體乳液具有較大的平均粒徑和較小的Zeta電位絕對(duì)值；此外，在不同pH值偏移處理的姜黃素油體乳液中，pH值偏移為1.0時(shí)，乳液具有較大的Zeta電位絕對(duì)值。結(jié)合圖5可知，因?yàn)閜H值偏移為1.0時(shí)，未顯著破壞油體蛋白結(jié)構(gòu)，對(duì)表面電荷分布的破壞較小，靜電相互作用較強(qiáng)，所以Zeta電位絕對(duì)值較大，乳液較為穩(wěn)定[31]。

2.6.3 氧化穩(wěn)定性分析

通過(guò)監(jiān)測(cè)貯存期間油脂氧化的初級(jí)產(chǎn)物（氫過(guò)氧化物）和次級(jí)產(chǎn)物（TBARS）含量，反映不同pH值偏移制備的姜黃素油體乳液的氧化穩(wěn)定性。

如圖8所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，未處理油體氫過(guò)氧化物的含量隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，整體呈緩慢上升趨勢(shì)，處理過(guò)的油體呈先減少后增大趨勢(shì)，且油體氧化穩(wěn)定性得以改善。這可能因?yàn)橛腕w本身的特殊結(jié)構(gòu)，其外層緊實(shí)的蛋白-磷脂層將內(nèi)核油脂與外界環(huán)境相隔離，并含有少量的生育酚和植物甾醇等抗氧化物質(zhì)[32]，部分結(jié)合在油體表面的姜黃素提供了一定的抗氧化能力[5]。貯藏4～10 d，pH 5.0的樣品中氫過(guò)氧化物含量上升趨勢(shì)明顯，而pH 1.0時(shí)的變化趨勢(shì)與未處理油體趨于一致。結(jié)合圖3研究，這可能由于pH 5.0時(shí)，油體聚集、部分油脂暴露于空氣中，加速油脂氧化，而pH 1.0時(shí)，姜黃素油體成球狀結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)未發(fā)生顯著變化，氧化穩(wěn)定性較好。同時(shí)，初始狀態(tài)下，處理過(guò)的油體氫過(guò)氧化物含量大于未處理油體，這可能由于經(jīng)過(guò)處理的油體表面油水界面被破壞，導(dǎo)致氧化穩(wěn)定性下降[33]。

由圖8可知，貯藏0～2 d，TBARS值快速增加；貯藏6 d后，全部油體TBARS值呈上升趨勢(shì)，此時(shí)，樣品出現(xiàn)乳析現(xiàn)象，油體穩(wěn)定性喪失，氧化加速進(jìn)行。貯藏2～6 d，樣品TBARS值整體呈下降趨勢(shì)；貯藏結(jié)束時(shí)，不同pH值處理過(guò)的油體TBARS值均低于未處理油體，這可能由于姜黃素改變了油體清除自由基和螯合金屬離子的能力，姜黃素將氫離子提供給過(guò)氧化自由基從而避免進(jìn)一步降解，從而抑制油體次級(jí)氧化物的生成[5,34-35]。

圖8 不同pH值偏移制備的姜黃素油脂體乳液的氧化穩(wěn)定性Fig.8 Oxidation stability of curcumin-loaded oil body emulsions prepared at different pH levels

3 結(jié)論

通過(guò)pH值偏移處理，姜黃素可成功被油體包埋，pH值偏移為1.0時(shí)，包埋效果及氧化穩(wěn)定性最佳。包封特性研究表明，隨著pH值的減小，乳液包封率由35.46%增加至65.55%，脂滴聚集減少并逐漸呈均勻的橢球或球形分布。內(nèi)源熒光光譜、SDS-PAGE結(jié)果表明，pH值偏移處理使油體蛋白結(jié)構(gòu)疏散，發(fā)生一定解離，同時(shí)，促使外源蛋白分子發(fā)生重排，形成亞基交聯(lián)；但pH 1.0時(shí)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化，與天然油體蛋白結(jié)構(gòu)相似。穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，pH值偏移法降低了油體的貯藏穩(wěn)定性，油體pH穩(wěn)定性略差，但姜黃素的存在提高了油體的氧化穩(wěn)定性；pH值偏移為1.0時(shí)，氧化穩(wěn)定性最佳。本實(shí)驗(yàn)為設(shè)計(jì)姜黃素運(yùn)載體系和開(kāi)發(fā)油體遞送體系提供一定理論依據(jù)。