崔佳斌 鄭棟棟 陳 奇 江岸林

海鹽縣中醫(yī)院 浙江 海鹽 314300

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除酒精和其他明確的肝損害因素所致的，因大量脂質(zhì)在肝臟沉積，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征，NAFLD可進(jìn)一步演變?yōu)榉蔷凭灾拘愿窝?、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌[1]，已逐漸成為最主要的肝臟疾病之一。二陳湯出自《太平惠民和劑局方》，由半夏、橘紅、白茯苓、甘草、烏梅和生姜組成，具有燥濕化痰、理氣和中之功效，廣泛用于NAFLD的治療[2]。近年來發(fā)現(xiàn)，法尼酯衍生物X受體（FXR）在物質(zhì)代謝及腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的作用，通過調(diào)節(jié)膽汁酸（BA）、脂類及糖等代謝，可調(diào)控NAFLD的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸[3]。本課題就二陳湯是否通過調(diào)控FXR信號(hào)通路干預(yù)NAFLD進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠51只，4周齡，體重（100±10）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分成2組：對(duì)照組8只，造模組43只，對(duì)照組予常規(guī)飼養(yǎng)，造模組予高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料配方：基礎(chǔ)飼料72.6%，豬油10%，膽固醇2%，膽鹽0.4%，蛋黃粉5%，蔗糖10%。造模組于造模第8、10和12周各處死1只大鼠，取肝臟組織做HE染色，判定造模情況。

1.2 藥物及試劑：奧貝膽酸（美國(guó)Sigma），二陳湯（法半夏、茯苓各9g，陳皮、烏梅、生姜各6g，炙甘草3g，由海鹽縣中醫(yī)院中藥房提供）；RNA純化試劑盒（北京天根生化），PCR試劑盒（上海士鋒生物），蛋白提取試劑盒（杭州聯(lián)科），F(xiàn)XR、小異二聚體伴侶（SHP）、膽固醇7α羥化酶（CYP7A1）和膽鹽輸出泵（BSEP）一抗（英國(guó)Abcom），二抗（北京中杉金橋），BA檢測(cè)試劑盒（上海武昊），引物（生工生物工程）。引物序列：FXR（5’-CCATTTACAAGCCACGGACG-3’、5’-CCCAGGTTGGAATAATAGGACG-3’），SHP（5’-CTCCCCCGATGAAGGTCGAT-3’、5’-CTCTAAGACGCTCACAGTCTCT-3’），CYP7A1（5’-TGAAGAGTACCACACCAGG-3’、5’-CATCAGACTATGGCGCAGGT-3’），BSEP（5’-GGGCATCTCAAGCAAACACC-3’、5’-AATGGCATTCCCTCCAGAGC-3’）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：精密電子秤（Sartorius，BT-224S），高速低溫離心機(jī)（Eooendorf，15R），全自動(dòng)生化分析儀（北京朗普，SMT-120VP），紫外/可見分光光度計(jì)（上海譜元，α-1860），恒溫水浴箱（上海精密實(shí)驗(yàn)，DK-S24），電子顯微鏡（Thermo Fihser，L120C TEM），熒光定量 PCR儀（ABI，7300），超凈工作臺(tái)（蘇凈，sW-CJ-2FD），電泳儀（Hexagon，DE214），全自動(dòng)蛋白印跡處理系統(tǒng)（廣州博鷺騰生物，WB-600Auto）。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及方案：造模12周后將造模組隨機(jī)分成模型組，奧貝膽酸組，中藥高、中、低劑量組，各組8只，進(jìn)行藥物干預(yù)。奧貝膽酸組：奧貝膽酸以成人25mg/d劑量，按體表面積換算成大鼠劑量為2.25mg/kg·d，以0.5%羧甲基纖維素鈉為溶劑；二陳湯高、中、低劑量組：分別為4.86g/kg·d，2.43g/kg·d和1.22g/kg·d；模型組及對(duì)照組予同等劑量的生理鹽水，灌胃體積為10mL/kg，2次/d，持續(xù)4周，干預(yù)期間，喂養(yǎng)方式不變。

1.5 樣本采集：干預(yù)結(jié)束后，禁食8小時(shí)后大鼠按30mg/kg腹腔注射1%戊巴比妥麻醉，腹主動(dòng)脈采血、離心后，取上層血清。處死大鼠后，取肝臟左葉固定位置，修剪其大小為5mm×5mm×3mm左右，放置10%中性福爾馬林溶液中固定，待HE染色。取大鼠肝右葉固定位置，2塊大小約5mm×5mm×5mm左右組織，以DEPC處理過的PBS沖洗干凈，分裝與凍存管中，先置于液氮中，后轉(zhuǎn)于-80℃保存待用。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法：分述如下。

1.6.1 肝臟組織石蠟切片HE染色：取大鼠肝組織常規(guī)石蠟包埋、切片（5μm）、脫蠟、脫水，蘇木素-伊紅（HE）染色后，在光鏡下觀察。

1.6.2 肝臟和血清BA檢測(cè)：取50mg肝組織，以酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定肝臟組織BA；生化儀檢測(cè)大鼠血清BA。

1.6.3 Realtime-PCR檢測(cè)：按Trizol Reagent試劑盒提取總RNA，檢測(cè)濃度及純度。反應(yīng)條件：94℃、2min變性，95℃、40s，50℃～65℃、40s循環(huán)40次。定量分析采用公式：△△Ct=（Ct1-Ct2）-（Ct3-Ct4），Ct1、Ct2為處理樣品待測(cè)基因和管家基因循環(huán)次數(shù)，Ct3、Ct4分別對(duì)照樣品待測(cè)基因和管家基因循環(huán)次數(shù)。

1.6.4 Western blot檢測(cè)：組織充分勻漿后提取蛋白，按提取試劑盒說明進(jìn)行操作。Bradford法檢測(cè)蛋白濃度后，上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濃縮膠80V、20min，分離膠100V、1h；轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上并以考馬斯亮藍(lán)染色，封閉2h，一抗雜交，4℃孵育過夜，洗膜后二抗雜交反應(yīng)1h，最后ECL發(fā)光照相測(cè)定蛋白表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行計(jì)算。本試驗(yàn)研究均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜0.05作為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法；不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示，用非參數(shù)檢驗(yàn)，如Wilcoxon秩和檢驗(yàn)、Kruskal-wallis的H檢驗(yàn)等。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)NAFLD大鼠肝臟組織學(xué)的影響：如圖1所示，正常組肝組織形態(tài)大致正常；模型組大鼠肝細(xì)胞呈中-重度脂肪變，肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核被擠向一邊，大量脂肪空泡充斥于包漿內(nèi)，可見大小不等的脂滴，符合NAFLD病理表現(xiàn)；經(jīng)奧貝膽酸及中藥治療后，肝細(xì)胞脂肪變有不同程度改善，脂肪空泡不同程度減少，以?shī)W貝膽酸及中藥高劑量組最為顯著。

圖1 肝臟病理學(xué)檢測(cè)

2.2 對(duì)NAFLD大鼠肝臟及血清BA的影響：如表1和圖2所示，經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)后，NAFLD模型大鼠肝臟和血清BA明顯升高，經(jīng)藥物干預(yù)后有不同程度的降低，以?shī)W貝膽酸和高劑量組最為顯著，且二陳湯各組呈劑量依賴性。說明在降低NAFLD肝臟BA方面，奧貝膽酸與二陳湯高劑量療效相當(dāng)，而在降低血清BA方面二陳湯高劑量?jī)?yōu)于奧貝膽酸。

表1 各組大鼠肝臟及血清BA對(duì)比（±s）

表1 各組大鼠肝臟及血清BA對(duì)比（±s）

注：與正常組對(duì)比，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組對(duì)比，cP＜0.01；與奧貝組對(duì)比，dP＜0.05，eP＜0.01；與高劑量組對(duì)比，fP＜0.05，gP＜0.01；與中劑量組對(duì)比，hP＜0.05，iP＜0.01。

組別正常組模型組奧貝組高劑量組中劑量組低劑量組例數(shù)8 8 8 8 8 8肝臟BA（μg/mg）25.6±4.5 106.5±14.2bc 54.6±7.4bc 43.8±7.3bcd 67.4±9.1bceg 83.6±9.3bcegi血清BA（μmol/L）4.2±1.0 14.9±2.7b 7.0±1.7bc 6.6±1.8ac 9.0±1.9bcdf 11.6±2.2bcegh

圖2 肝臟及血清BA水平對(duì)比

2.3 對(duì)NAFLD肝臟FXR信號(hào)通路的影響：如圖3所示，NAFLD模型組大鼠FXR、SHP及BSEP mRNA表達(dá)較正常組顯著下降，CYP7A1 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)；經(jīng)奧貝膽酸及二陳湯治療后，F(xiàn)XR、SHP及BSEP mRNA表達(dá)具有不同程度上調(diào)，CYP7A1 mRNA表達(dá)不同程度下調(diào)，其中以?shī)W貝膽酸及二陳湯高劑量最為顯著。

圖3 FXR、SHP、CYP7A1和BSEP mRNA表達(dá)的對(duì)比

對(duì)各組大鼠肝臟FXR、SHP、CYP7A1和BSEP蛋白表達(dá)的影響如圖4所示，NAFLD模型組大鼠FXR、SHP及BSEP蛋白表達(dá)較正常組顯著下降，CYP7A1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)；經(jīng)奧貝膽酸及二陳湯治療后，F(xiàn)XR、SHP及BSEP蛋白表達(dá)不同程度上調(diào)，CYP7A1蛋白表達(dá)不同程度下調(diào)，其中以?shī)W貝膽酸及二陳湯高劑量最為顯著。

圖4 FXR、SHP、CYP7A1和BSEP蛋白表達(dá)的對(duì)比

3 討論

本病可歸屬于中醫(yī)學(xué)“肝癖”“痰濁”“肥氣”等范疇，脾虛運(yùn)化失權(quán)、痰濕內(nèi)生是重要病機(jī)，痰、濕、濁、瘀、熱為主要病理因素[4]。由于現(xiàn)代飲食結(jié)構(gòu)及生活方式的改變，飲食因素在本病的發(fā)生發(fā)展中占有主導(dǎo)地位[5]?！度彘T事親》：“膏粱之人，奉養(yǎng)過度，起居閑逸，酒食所傷，以致中脘留飲脹悶?！盵6]痰濕停滯于臟腑、經(jīng)絡(luò)，妨礙氣血運(yùn)行，致氣血瘀滯、痰瘀互結(jié)，產(chǎn)生新的致病因素。學(xué)者統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，濕濁內(nèi)停證在NAFLD中占34.5%，是最常見的證型[7]。二陳湯是治療痰濕的代表方，亦是基礎(chǔ)方，廣泛用于NAFLD等代謝綜合征。

就本病發(fā)病機(jī)制而言，我們對(duì)本病的認(rèn)識(shí)，從最早的“二重打擊”學(xué)說逐漸發(fā)展到目前的“多重打擊”學(xué)說[8]。臨床研究發(fā)現(xiàn)NAFLD患者血清膽汁酸水平明顯升高[9]，Thompson等[10]亦發(fā)現(xiàn)NAFLD小鼠膽汁酸池增大，膽汁酸組成改變，提示膽汁酸過多引起的細(xì)胞毒性亦參與了本病的發(fā)生發(fā)展。膽汁酸是膽汁的主要成分，在肝臟依賴CYP7A1生成后，由BSEP泵入膽小管，儲(chǔ)存于膽囊，最后排放入小腸發(fā)揮生理作用[11]。

FXR可通過調(diào)節(jié)膽汁酸代謝，干預(yù)NAFLD的進(jìn)展。無論是人還是動(dòng)物研究均發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR表達(dá)下調(diào)與NAFLD進(jìn)展間存在正相關(guān)[12]。FXR激活后誘導(dǎo)SHP的表達(dá)，可促使肝臟核受體-4與肝受體同源物-1結(jié)合的共活化物解離并失活，從而降低對(duì)CYP7A1的轉(zhuǎn)錄活化作用，抑制膽汁酸的生成；此外，F(xiàn)XR還通過上調(diào)BSEP的表達(dá)促進(jìn)肝臟分泌膽汁酸，并使膽汁酸轉(zhuǎn)變?yōu)槟懼?，從而增加膽汁酸的排泄[13]。

本研究首次發(fā)現(xiàn)，二陳湯可激活NAFLD大鼠肝臟FXR，進(jìn)而上調(diào)SHP及BSEP，抑制CYP7A1的表達(dá)，從而降低肝臟及血清BA水平，改善肝臟脂肪病變情況，且二陳湯激活FXR信號(hào)通路的程度呈劑量依賴性。綜上所述，本研究為臨床二陳湯治療NAFLD提供了一定的理論支撐。