■李嘉輝 龔建剛 鄒 俊 高新磊 張磊正 郝艷霜 馮志華* 趙國(guó)先

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定 071001；2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定 071001）

腸道是動(dòng)物進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)消化吸收的重要場(chǎng)所[1]。隨著世界范圍內(nèi)對(duì)畜產(chǎn)品需求的增加導(dǎo)致了放養(yǎng)密度的增加，使得動(dòng)物更容易受到包括免疫應(yīng)激在內(nèi)的各種應(yīng)激刺激，一些動(dòng)物的腸道很容易受到感染[2]。腸道健康失衡后，動(dòng)物對(duì)各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用受到負(fù)面影響，機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育受到影響，使得養(yǎng)殖成本增加，造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失[3]。應(yīng)用健康綠色的飼料添加劑控制家畜的腸道功能和微生物環(huán)境被認(rèn)為是提高生長(zhǎng)性能和飼料效率的重要手段[4]。

白藜蘆醇（3，4，5-trihydroxystilbene，RES）作為一種天然多酚化合物，具有抗氧化、抗炎和延緩機(jī)體衰老等眾多生理功能[5-7]。Zhang 等[7]發(fā)現(xiàn)，日糧中添加400 mg/kg RES 可顯著改善21～42 日齡肉雞料重比。Ahmed等[8]報(bào)道，斷奶仔豬中添加200 mg/kg RES 可通過提高免疫功能和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率，促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)。在反芻動(dòng)物上的研究表明，日糧添加RES可改善血清抗氧化指標(biāo)，顯著增加犢牛體重[9]。此外，最近的研究表明，RES 在保護(hù)腸道健康方面有著積極作用。Mayangsari等[10]證實(shí)，RES可通過增加緊密連接蛋白在腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)來促進(jìn)腸道屏障的完整性。另外，據(jù)報(bào)道，RES 可通過緩解腸道黏膜損傷，提高腸道免疫、抗氧化功能及調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生物菌群，發(fā)揮對(duì)腸道屏障功能的保護(hù)作用，緩解畜禽的多種應(yīng)激[11-15]。而目前很少有關(guān)于RES 對(duì)免疫應(yīng)激條件下肉雞生長(zhǎng)性能和腸道健康方面的研究。脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，是先天免疫反應(yīng)的有力激活劑，腹腔注射LPS 是構(gòu)建動(dòng)物免疫應(yīng)激模型最常用的方法之一[16]。本研究通過LPS注射模擬肉雞免疫應(yīng)激模型，旨在探討日糧添加RES 對(duì)LPS 刺激肉雞生長(zhǎng)性能、腸黏膜形態(tài)、黏膜二糖酶活性和腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

RES 購(gòu)自西安瑞盈生物科技有限公司，純度98%，白色粉末。LPS（血清型O55∶B5，L2880），來源于大腸桿菌，購(gòu)自Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用2（是否LPS 刺激）×2（RES 添加量，0 或400 mg/kg）雙因素隨機(jī)分組設(shè)計(jì)，選用1 日齡健康體重相近[（42.20±0.30）g]的AA 肉公雛240 只，隨機(jī)分為4 組，包括CON、RES、LPS 組和L-RES 組，每組6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)（籠）10 只雞。其中，CON 組和LPS 組飼喂基礎(chǔ)日糧，RES 組和L-RES 組在基礎(chǔ)日糧中添加400 mg/kg 的RES，RES 添加劑量參照之前的研究確定[17-18]。LPS組和L-RES 組肉雞分別在16、18日齡和20 日齡早8：00 腹腔注射500 μg/kg BW LPS，其余兩組肉雞則注射等量的生理鹽水（注射之前空腹12 h，斷料不斷水）。LPS 的給藥途徑和劑量參考Li 等[19]的研究。

1.3 基礎(chǔ)日糧與飼養(yǎng)管理

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能

分別于1 日齡和21 日齡時(shí)對(duì)各重復(fù)試驗(yàn)雞進(jìn)行空腹稱重，每日記錄各重復(fù)采食量。試驗(yàn)結(jié)束后統(tǒng)計(jì)各組肉雞1～21 日齡平均日增重、平均日采食量和料重比。

1.4.2 十二指腸形態(tài)學(xué)指標(biāo)和杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)

21日齡時(shí)，每個(gè)重復(fù)選擇1只接近整籠平均體重的健康肉雞（空腹12 h），放血處死并解剖。迅速取十二指腸中段2 cm，于4%多聚甲醛中固定24 h后，進(jìn)行常規(guī)脫水與石蠟包埋，5 μm厚度切片。蘇木精-伊紅染色（H.E.）后在40倍顯微鏡視野下觀察，測(cè)量絨毛高度和隱窩深度，并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度比值，每張切片選取8 個(gè)良好的絨毛和隱窩進(jìn)行測(cè)量，取“平均值”進(jìn)行計(jì)算；使用高碘酸希夫式（PAS）染色，在400倍顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)取5 個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)每100 個(gè)腸上皮細(xì)胞中杯狀細(xì)胞的數(shù)量，取平均值進(jìn)行計(jì)算。

1.4.3 回腸黏膜二糖酶活性測(cè)定

對(duì)上述動(dòng)物進(jìn)行屠宰時(shí)，摘取回腸，無菌采取食糜于2 mL凍存管，置于液氮中速凍，備測(cè)回腸食糜菌群結(jié)構(gòu)。使用生理鹽水緩慢將回腸剩余食糜沖洗干凈，隨后用無菌載玻片刮取回腸黏膜，收集在2 mL 凍存管中，最后將回腸食糜和黏膜儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱待測(cè)。使用南京建成生物工程研究所有限公司的試劑盒測(cè)定肉雞回腸黏膜中蔗糖酶和麥芽糖酶的活性，嚴(yán)格按照試劑盒說明書所示的試驗(yàn)條件和操作步驟進(jìn)行測(cè)定。

1.4.4 回腸食糜微生物組成

根據(jù)TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit（Illumina 公司）試劑盒構(gòu)建文庫，用特異性引物擴(kuò)增16S rRNA 的V3～V4 區(qū)（338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'；806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。使用TruSeq DNA PCR-樣品制備試劑盒（Illumina 公司）生成測(cè)序文庫。使用Illumina MiSeq 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，文庫制備和測(cè)序工作委托上海派森諾生物技術(shù)有限公司完成。

10.根據(jù)廠址區(qū)域的地形和工程具體條件，按電廠的規(guī)劃容量作好發(fā)電廠的防排洪（澇）規(guī)劃。充分利用現(xiàn)有防排洪（澇）設(shè)施；當(dāng)必須新建時(shí)，經(jīng)比選可因地制宜的采用防排洪（澇）堤、防排洪（澇）溝和擋水圍墻等構(gòu)筑物。防排洪（澇）設(shè)施應(yīng)在初期工程中同步規(guī)劃。同時(shí)要防止破壞山體，注意水土保持。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件的一般線性模型（GLM）程序進(jìn)行單因素方差分析，Duncan’s法進(jìn)行多重比較。同時(shí)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析，模型主效應(yīng)包括LPS、RES 及兩者的互作效應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P＜0.05 表示差異顯著，0.05＜P＜0.10表示有趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RES對(duì)LPS刺激肉雞生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，從主效應(yīng)來看，LPS刺激顯著降低了肉雞1～21 日齡平均日增重和平均日采食量（P＜0.05），對(duì)料重比未產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）；日糧添加RES 有提高肉雞1～21 日齡平均日增重的趨勢(shì)（P=0.081），對(duì)平均日采食量和料重比無顯著影響（P＞0.05）。日糧添加RES 與LPS刺激對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能無顯著互作效應(yīng)（P＞0.05）。由多重比較結(jié)果可知，應(yīng)激狀態(tài)下，RES可顯著改善肉雞平均日增重（P＜0.05）。

表2 RES對(duì)LPS刺激肉雞1～21日齡生長(zhǎng)性能的影響

2.2 RES 對(duì)LPS 刺激肉雞十二指腸形態(tài)和杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響

由表3可知，從主效應(yīng)來看，LPS刺激使肉雞十二指腸絨毛高度、絨毛高度/隱窩深度值和杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著降低（P＜0.05），有提高隱窩深度的趨勢(shì)（P=0.069）；日糧添加RES顯著提高了肉雞十二指腸絨毛高度/隱窩深度值和杯狀細(xì)胞數(shù)量（P＜0.05）。由多重比較結(jié)果可知，非應(yīng)激狀態(tài)下，日糧RES的添加可顯著提高肉雞十二指腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度值（P＜0.05）；應(yīng)激狀態(tài)下，RES可顯著增加肉雞十二指腸絨毛高度（P＜0.05）。

表3 RES對(duì)LPS刺激肉雞十二指腸形態(tài)和杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響

2.3 RES對(duì)LPS刺激肉雞回腸黏膜二糖酶活性的影響

由表4可知，從主效應(yīng)來看，LPS刺激顯著降低了肉雞回腸黏膜麥芽糖酶和蔗糖酶活性（P＜0.05），而日糧添加RES 使肉雞回腸黏膜麥芽糖酶和蔗糖酶活性顯著提高（P＜0.05）。日糧添加RES 與LPS 刺激對(duì)回腸黏膜麥芽糖酶活性有顯著的交互作用（P＜0.05）。由多重比較結(jié)果可知，非應(yīng)激狀態(tài)下，日糧RES 的添加可顯著提高肉雞回腸麥芽糖酶和蔗糖酶活性（P＜0.05）；應(yīng)激狀態(tài)下，日糧添加RES可顯著提高肉雞回腸麥芽糖酶活性（P＜0.05）。

表4 RES對(duì)LPS刺激肉雞回腸黏膜二糖酶活性的影響（U/mg prot.）

2.4 RES對(duì)LPS刺激肉雞回腸菌群的影響

2.4.1 RES對(duì)LPS刺激肉雞回腸微生物多樣性的影響由表5可知，從主效應(yīng)來看，LPS刺激顯著降低了回腸微生物OUT數(shù)量、Chao1和Shannon指數(shù)；日糧添加RES 有提高OUT 數(shù)量的趨勢(shì)（P=0.075），并顯著提高Chao1 指數(shù)（P＜0.05）。由多重比較結(jié)果可知，在應(yīng)激狀態(tài)下，日糧RES 的添加可顯著提高肉雞回腸Chao1指數(shù)（P＜0.05）。

表5 RES對(duì)LPS刺激肉雞回腸微生物OUT數(shù)量及α多樣性指數(shù)的影響

2.4.2 RES 對(duì)LPS 刺激肉雞回腸菌群門水平相對(duì)豐度的影響

肉雞回腸食糜門水平優(yōu)勢(shì)菌門主要是厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門。由表6 可知，從主效應(yīng)來看，LPS 刺激顯著降低了厚壁菌門相對(duì)豐度（P＜0.05），同時(shí)顯著增加變形菌門的相對(duì)豐度（P＜0.05）。日糧添加RES 有提高厚壁菌門相對(duì)豐度的趨勢(shì)（P=0.089），同時(shí)添加RES 使變形菌門相對(duì)豐度顯著降低（P＜0.05）。日糧添加RES 與LPS 刺激對(duì)回腸食糜變形菌門相對(duì)豐度有顯著的交互作用（P＜0.05）。由多重比較結(jié)果可知，在應(yīng)激狀態(tài)下，日糧RES 的添加顯著降低了肉雞回腸變形菌門的相對(duì)豐度（P＜0.05）。

表6 RES對(duì)LPS刺激肉雞回腸菌群門水平相對(duì)豐度的影響

3 討論

3.1 RES對(duì)LPS刺激肉雞生長(zhǎng)性能的影響

大量研究表明，肉雞腹腔注射Lps會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)性能顯著降低[19-23]。本研究也證實(shí)了LPS對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的負(fù)面影響，表現(xiàn)為平均日增重和平均日采食量顯著下降，也提示本試驗(yàn)通過注射LPS構(gòu)建的肉雞免疫應(yīng)激模型成功。LPS 導(dǎo)致的肉雞生長(zhǎng)性能受損可能與動(dòng)物食欲降低、腸道屏障功能損傷及營(yíng)養(yǎng)吸收被破壞有關(guān)[24-26]。馬政等[27]發(fā)現(xiàn)，日糧添加500 mg/kg RES有提高肉雞平均日增重和降低料重比的趨勢(shì)。Zhang等[7]表明，400 mg/kg 劑量RES 可顯著降低21～42 日齡科寶肉雞料重比。本研究中，日糧RES 的添加有提高肉雞1～21 日齡平均日增重的趨勢(shì)，表明RES 對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能有一定積極作用，這與上述研究結(jié)果相似。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，日糧添加RES 顯著改善了LPS 刺激肉雞的生長(zhǎng)性能。張彩云[28]報(bào)道，日糧添加400 mg/kg RES可通過提高機(jī)體抗氧化能力和免疫功能顯著改善LPS 刺激肉雞的平均日增重和料重比。Zhang 等[29]報(bào)道，日糧添加400 mg/kg RES 類似物（紫檀芪）可保護(hù)腸道形態(tài)、減輕腸道炎癥和黏膜損傷，緩解LPS 刺激肉雞平均日增重。本研究顯示，RES 對(duì)LPS刺激肉雞生長(zhǎng)性能的積極作用可能與其改善LPS刺激肉雞腸道形態(tài)、腸黏膜二糖酶活性及腸道微生物屏障功能有關(guān)。

3.2 RES 對(duì)LPS 刺激肉雞腸道形態(tài)和杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響

腸道的消化和吸收能力通常通過絨毛高度、隱窩深度和絨隱比指標(biāo)來反映[30]。腸道上皮被杯狀細(xì)胞分泌的黏液覆蓋，可保護(hù)腸黏膜免受病原體和毒素的攻擊，因此，杯狀細(xì)胞對(duì)于腸黏膜屏障功能十分重要[17]。本研究中，腹腔注射LPS 造成了肉雞腸黏膜屏障的損傷，表現(xiàn)為十二指腸絨毛高度、絨隱比和杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著降低，這與之前的研究結(jié)果基本一致[19-20，31]。Gan等[32]發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬日糧中添加RES可顯著提高空腸及回腸絨毛高度。Qiu 等[14]研究表明，日糧添加RES可顯著提高斷奶仔豬空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度值，并顯著提高空腸杯狀細(xì)胞數(shù)量。與以上研究類似，本研究中，日糧補(bǔ)充RES 有提高肉雞十二指腸絨毛高度的趨勢(shì)，并顯著增加十二指腸絨隱比和杯狀細(xì)胞數(shù)量。以往的研究表明，日糧添加植物提取物可顯著緩解LPS刺激引起的動(dòng)物腸道形態(tài)受損[33-34]。本研究中，RES 顯著提高了LPS 刺激肉雞腸道絨毛高度，表明RES 可在一定程度上減輕LPS誘導(dǎo)的腸道損傷，保護(hù)腸道形態(tài)。

3.3 RES 對(duì)LPS 刺激肉雞腸道黏膜二糖酶活性的影響

食物中的二糖不能被小腸直接吸收，腸黏膜二糖酶（如麥芽糖酶、蔗糖酶和乳糖酶等）在動(dòng)物對(duì)碳水化合物的吸收中起著不可或缺的作用[35]。二糖酶活性的高低可反映腸道上皮細(xì)胞的發(fā)育程度和功能強(qiáng)弱[36]。研究表明，LPS 可導(dǎo)致動(dòng)物腸道二糖酶活性顯著降低[37-38]。本研究也證實(shí)，在LPS刺激下，肉雞回腸黏膜麥芽糖酶和蔗糖酶活性顯著降低，這表明LPS刺激對(duì)腸道的消化吸收功能產(chǎn)生損傷。與未添加RES相比，日糧補(bǔ)充RES 顯著提高了肉雞回腸麥芽糖酶和蔗糖酶活性，這與Cheng 等[39]在小鼠上的研究一致。Gan等[32]表明，RES 可顯著提高斷奶仔豬回腸麥芽糖酶活性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，添加RES 顯著緩解了LPS 引起的肉雞回腸麥芽糖酶活性的降低，這與前面提到的RES 改善LPS 刺激肉雞腸道形態(tài)的結(jié)果一致。有研究表明，保持腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性，更有利于黏膜二糖酶的分泌，進(jìn)而更好地消化和吸收日糧中的養(yǎng)分，提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能。

3.4 RES對(duì)LPS刺激肉雞回腸菌群的影響

腸道微生物菌群在抑制病原體感染和調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)消化吸收等方面發(fā)揮著重要作用，腸道菌群的平衡有利于保持動(dòng)物機(jī)體的健康[40]。本研究使用16S rRNA測(cè)序檢測(cè)了肉雞回腸食糜微生物群落的多樣性和組成。通過Chao1 和Shannon 指數(shù)等α多樣性指標(biāo)來評(píng)價(jià)回腸菌群的物種多樣性。OUT 數(shù)量能夠反映腸道菌群中物種的量[41]。本研究中，LPS 刺激顯著降低肉雞回腸微生物OUT數(shù)量、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)，表明LPS 刺激使肉雞腸道微生物群落多樣性降低。而日糧添加RES 顯著提高了LPS 刺激肉雞回腸微生物Chao1指數(shù)，表明RES有助于維持腸道菌群的多樣性。Song 等[42]發(fā)現(xiàn)，RES 可提高環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)，證實(shí)了RES 對(duì)腸道菌群多樣性的積極作用。厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門是肉雞回腸微生物區(qū)系中主要的優(yōu)勢(shì)菌門，這與之前的研究結(jié)果一致[43-44]。厚壁菌門與碳水化合物的代謝及纖維分解有關(guān)[45]，擬桿菌門能夠降解非纖維性碳水化合物及蛋白質(zhì)，促進(jìn)胃腸道免疫系統(tǒng)發(fā)育[46-47]。而變形菌門中有許多病原微生物（如幽門螺桿菌和沙門氏菌等），變形菌的增加是菌群失調(diào)的一個(gè)標(biāo)志[48-49]。LPS刺激顯著降低了肉雞腸道中厚壁菌門相對(duì)豐度，同時(shí)顯著提高了變形菌門相對(duì)豐度，打破了腸道菌群的平衡狀態(tài)。而日糧補(bǔ)充RES顯著緩解了由LPS 刺激引起的肉雞腸道變形菌門相對(duì)豐度的增加。表明RES 可通過減少肉雞腸道變形菌數(shù)量，在一定程度上緩解由LPS 刺激引起的菌群失調(diào)，改善免疫應(yīng)激肉雞的微生物菌群紊亂。

4 結(jié)論

日糧中添加400 mg/kg能夠提高肉雞生長(zhǎng)性能并改善腸道屏障功能，在一定程度緩解LPS引起的免疫應(yīng)激。