■陳 玥 龔玉石

（廣東藥科大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510006）

豆粕是大豆種子提油后的副產(chǎn)品，粗纖維含量低（31～72 g/kg），粗蛋白含量高（440～530 g/kg）。由于豆粕易獲得，富含氨基酸，具有高營養(yǎng)價值，并且供應(yīng)充足，是十分有價值的植物蛋白質(zhì)來源，也是重要的蛋白質(zhì)資源，長期以來一直被認(rèn)為是食品和動物飼料的重要和廉價的蛋白質(zhì)來源[1-3]。但由于豆粕適口性低、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量較大，并且含有大量抗?fàn)I養(yǎng)因子（antinutritional factors，ANF），如大豆球蛋白（11S）、β-伴大豆球蛋白（7S）、胰蛋白酶抑制因子、植酸等，嚴(yán)重影響豆粕營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，限制豆粕的營養(yǎng)價值和應(yīng)用價值[4-6]。一些研究表明，益生菌固態(tài)濕發(fā)酵有助于提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化率和蛋白質(zhì)質(zhì)量[7]，并且是處理ANF 和大分子營養(yǎng)物質(zhì)的有效策略。在發(fā)酵過程中益生菌的生長會產(chǎn)生許多酶（如蛋白酶、纖維素酶和植酸酶等），從而增加了豆粕的功能[5]。盡管有足夠研究表明發(fā)酵能夠提高豆粕的質(zhì)量，但不同益生菌破壞ANF和釋放營養(yǎng)物質(zhì)的機制各不相同，許多研究也認(rèn)為不同益生菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶與底物相互作用的活性不同，是發(fā)酵豆粕品質(zhì)參差不齊的主要原因[8]。鑒于少有研究對比不同益生菌降解ANF和產(chǎn)生各種活性酶的能力不同之處，因此本研究將探究地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、羅伊氏乳桿菌、米曲霉、釀酒酵母、沼澤紅假單胞菌等6種益生菌發(fā)酵豆粕對其營養(yǎng)品質(zhì)的影響，以此為篩選混菌發(fā)酵的益生菌種類奠定基礎(chǔ)，也為優(yōu)化豆粕營養(yǎng)、充分利用加工的豆粕作為飼料蛋白，特別是為豬、家禽等非反芻動物的高品質(zhì)飼料的開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 菌種及試驗材料

飼用純豆粕為市場采購，使用前過60目篩。

地衣芽孢桿菌（Bac-l）、凝結(jié)芽孢桿菌（Bac-c）、米曲霉（Asp）、釀酒酵母（Sac）均購置于山東偉多豐生物技術(shù)有限公司；羅伊氏乳桿菌（Lac）購于聚生原生物科技有限公司；沼澤紅假單胞菌（Pho）采購于山東鑫卓源化工有限公司；紅糖（純度100%）采購于廣東南字科技有限公司；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠配制試劑盒、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（Marker）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白酶、植酸酶、纖維素酶ELISA試劑盒購買于上海酶聯(lián)生物科技有限公司；抗?fàn)I養(yǎng)因子ELISA試劑盒購買于天津龍舟方科工程技術(shù)有限公司；發(fā)酵袋購置于河南鑫科包裝材料有限公司；其余試劑耗材均由化學(xué)試劑供應(yīng)商提供。

1.2 菌種活化最適宜條件篩選

1.2.1 不同紅糖添加量對菌種活化程度的影響

在保持其他活化條件相同的情況下，在100 mL純化水中按照紅糖添加量分別為0、0.25、0.5、1.0、2.0 g配制不同濃度的紅糖活化培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌20 min，然后按照5%的添加量分別將6種益生菌接入不同濃度培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min 分別培養(yǎng)48 h，在紫外分光光度計600 nm波長下測定OD值，選取最適宜的紅糖添加量。

1.2.2 不同活化時間對益生菌活化程度的影響

在保持紅糖濃度及其他活化條件不變的情況下，在100 mL純化水中按照最適宜紅糖添加量配制紅糖培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌，以5%的添加量分別將6 種益生菌接入不同濃度培養(yǎng)基，37 ℃，150 r/min培養(yǎng)0、12、24、36、48、60 h，分別在紫外分光光度計600 nm波長下測定OD值，確定最適宜培養(yǎng)時間。

1.3 發(fā)酵試驗

取20 g 豆粕置于發(fā)酵袋中，接入羅伊氏乳桿菌，裝入安有單向排氣閥的發(fā)酵袋中，按照5%接種量分別接種已活化的地衣芽孢桿菌（Bac-l）、凝結(jié)芽孢桿菌（Bac-c）、羅伊氏乳桿菌（Lac）、米曲霉（Asp）、釀酒酵母（Sac）、沼澤紅假單胞菌（Pho），將水分活度調(diào)整到45%，每組4個平行，用滅菌玻璃棒攪拌混合均勻，羅伊氏乳桿菌發(fā)酵袋扎緊封口，其余菌種豆粕發(fā)酵袋自然敞口，放在室溫滅菌操作臺上培養(yǎng)48 h后不進行傳統(tǒng)高溫烘干，以四分法取樣直接測定6組益生菌發(fā)酵豆粕的營養(yǎng)指標(biāo)、酶活性、抗?fàn)I養(yǎng)因子含量指標(biāo)，比較不同益生菌發(fā)酵豆粕的營養(yǎng)品質(zhì)變化以及不同菌種對豆粕營養(yǎng)品質(zhì)改變的差異，以期篩選最優(yōu)混菌發(fā)酵的益生菌菌種。

1.4 指標(biāo)測定及方法

1.4.1 發(fā)酵豆粕營養(yǎng)指標(biāo)測定方法

pH：取樣品3.00 g，加入90 mL的純化水，磁力攪拌器攪拌30 min，5 000 r/min 離心5 min，取上清液（為浸提液）測定pH。

干物質(zhì)回收率（dry matter recovery rate, DMR）：準(zhǔn)確稱量發(fā)酵前后物料質(zhì)量，測定發(fā)酵前后物料含水量，計算發(fā)酵前后干物質(zhì)質(zhì)量。

粗蛋白：參照GB/T 6432—2018 的方法進行粗蛋白含量的測定。

酸溶蛋白：參照NY/T 3801—2020 及相關(guān)資料的方法進行酸溶蛋白含量的測定。

1.4.2 發(fā)酵豆粕酶活性測定

蛋白酶：使用對應(yīng)體系的緩沖溶液分別提取豆粕中的酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶[9-10]，用ELISA試劑盒檢測酶活性。

植酸酶和纖維素酶：取1.5 g 豆粕，加入40 mL 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH 5.5），振蕩0.5 h，在0～4 ℃條件下避光1 h，搖勻離心取上清液[11]，采用ELISA 試劑盒分別檢測豆粕中植酸酶活性和纖維素酶活性[11]，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進行。

1.4.3 發(fā)酵豆粕抗?fàn)I養(yǎng)因子含量測定

1.4.3.1 SDS-PAGE凝膠電泳

按照Laemmli[12]、張夢媛[13]的方法并適當(dāng)改良，提取上清液與上樣緩沖液混合后進行SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳結(jié)束后使用考馬斯亮藍染液染色，甲醇-冰醋酸溶液脫色完全后放入凝膠成像系統(tǒng)進行拍照和分析。

1.4.3.2 ELISA法測定

按照ELISA試劑盒方法，分別提取并檢測發(fā)酵前后豆粕中大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子含量，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進行。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用SPSS 22 進行單因素方差分析（one-way ANOVA），用LSD 法和Duncan’s 法進行數(shù)據(jù)間的多重比較，P＜0.05 認(rèn)為存在統(tǒng)計學(xué)差異。采用Excel 軟件和Origin 9.4軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基紅糖濃度及益生菌活化時間篩選

2.1.1 最佳培養(yǎng)基紅糖添加量的確定

將紅糖分別按照0、0.25、0.5、1.0、2.0 g 配制成濃度分別為0、0.25%、0.5%、1.0%、2.0%的紅糖活化培養(yǎng)基，將6種益生菌接入不同紅糖濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，結(jié)果如圖1 所示。隨著紅糖添加量的增加，地衣芽孢桿菌和米曲霉呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，其余4 種益生菌菌群數(shù)量出現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢，由圖1 可見，在添加量為2.0 g 時紅糖活化培養(yǎng)基有良好的活化效果，為避免培養(yǎng)基物質(zhì)濃度對發(fā)酵豆粕結(jié)果測定產(chǎn)生影響，因此以2.0 g 作為最佳培養(yǎng)基紅糖添加量。

圖1 不同紅糖添加量對6種益生菌活化菌數(shù)的影響

2.1.2 最佳活化時間的確定

在保持紅糖添加量及其他活化條件不變的情況下，將6 種益生菌培養(yǎng)0、12、24、36、48、60 h，結(jié)果如圖2所示。在圖2中可看出，6種益生菌的菌體密度隨活化時間的增加整體呈現(xiàn)先上升后有所下降的趨勢。這是由于益生菌在達到穩(wěn)定期后繼續(xù)活化而進入到衰亡期。從圖2 可見6 種益生菌在活化48 h 時，菌體密度均達到較為理想的水平，因此認(rèn)為48 h可作為益生菌的最佳活化時間。

圖2 不同活化時間對6種益生菌活化菌數(shù)的影響

2.2 不同益生菌固態(tài)濕發(fā)酵對豆粕營養(yǎng)成分的影響

測定益生菌發(fā)酵后豆粕中pH、DMR、粗蛋白及酸溶蛋白含量，結(jié)果如表1所示。在濕發(fā)酵過程中，Lac發(fā)酵豆粕的DMR 相較于其他5 種益生菌發(fā)酵豆粕顯著提高（P＜0.05），達到94%以上，其余益生菌發(fā)酵豆粕的DMR并無顯著差別（P≥0.05）。與未發(fā)酵豆粕相比，Lac 和Asp 發(fā)酵豆粕的pH 明顯下降（P＜0.05），其中Lac下降最多（pH 4.93）。6種益生菌發(fā)酵豆粕中的粗蛋白含量均得到顯著提高（P＜0.05），其中Bac-l、Pho的粗蛋白含量增加明顯，由未發(fā)酵豆粕的12.05%增加至30.39%與31.55%。6 種益生菌發(fā)酵豆粕的酸溶蛋白含量也均有明顯提高（P＜0.05），其中Sac和Pho發(fā)酵豆粕的酸溶蛋白含量提升最為顯著，由6.09%提升至12.98%。

表1 不同益生菌固態(tài)濕發(fā)酵對豆粕營養(yǎng)成分的影響

2.3 不同益生菌固態(tài)濕發(fā)酵對豆粕酶含量的影響

2.3.1 發(fā)酵豆粕中蛋白酶活性變化

6 種益生菌發(fā)酵豆粕的酸性蛋白酶、中性蛋白酶及堿性蛋白酶活性改變?nèi)鐖D3所示，可以看出益生菌發(fā)酵豆粕的酶活性較未發(fā)酵豆粕有顯著改變（P＜0.05）。其中Sac、Pho發(fā)酵豆粕的酸性蛋白酶活性均顯著提升（P＜0.05），Pho發(fā)酵豆粕的酸性蛋白酶活性最高，達到2 527.09 U/g；Bac-l、Lac、Sac、Pho 發(fā)酵豆粕能夠影響豆粕中中性蛋白酶的活性，與未發(fā)酵豆粕相比，Sac發(fā)酵豆粕的中性蛋白酶活性提升最多，從441.61 U/g 提升至899.49 U/g；Bac-l、Bac-c、Sac都有良好的產(chǎn)堿性蛋白酶能力，能夠有效提升發(fā)酵豆粕中堿性蛋白酶的活性（P＜0.05），以Bac-l活性最高，達434.52 U/g。

圖3 不同益生菌固態(tài)濕發(fā)酵對豆粕三種蛋白酶活性的影響

2.3.2 發(fā)酵豆粕中纖維素酶和植酸酶活性變化

圖4、圖5 分別顯示發(fā)酵豆粕中纖維素酶和植酸酶的活性。由圖4 可知，相較于未發(fā)酵豆粕，Bac-c、Lac、Sac、Pho發(fā)酵豆粕的纖維素酶活性提升，Sac、Pho兩種益生菌對纖維素酶活性的影響最大，分別達到1 938.05 U/g和1 697.76 U/g。如圖5所示，Bac-l、Lac、Sac 發(fā)酵豆粕的植酸酶活性較發(fā)酵前均有提高，Sac、Lac的植酸酶活性分別達到1 297.47 U/g和933 U/g。

圖4 不同益生菌固態(tài)濕發(fā)酵對豆粕纖維素酶活性的影響

圖5 不同益生菌固態(tài)濕發(fā)酵對豆粕植酸酶活性的影響

2.4 不同益生菌固態(tài)濕發(fā)酵對豆粕抗?fàn)I養(yǎng)因子成分及含量的影響

2.4.1 不同益生菌發(fā)酵豆粕的抗原蛋白條帶變化

SDS-PAGE 凝膠電泳結(jié)果見圖6，Asp 發(fā)酵的豆粕大分子蛋白質(zhì)基本都被降解為分子量小于15 ku的小分子蛋白質(zhì)；Pho 發(fā)酵的豆粕，35 ku 以下的小分子蛋白質(zhì)也有明顯提升。Bac-l、Bac-c、Asp、Sac、Pho發(fā)酵的豆粕β-伴大豆球蛋白的蛋白質(zhì)條帶也明顯減弱；Asp和Sac的大豆球蛋白條帶有明顯變化，尤其是Asp發(fā)酵的豆粕抗原蛋白條帶基本消失，抗原蛋白的降解效率較高。

圖6 不同益生菌固態(tài)濕發(fā)酵豆粕SDS-PAGE電泳結(jié)果

2.4.2 不同益生菌固態(tài)濕發(fā)酵對豆粕抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的影響

由表2 可知，Asp 發(fā)酵豆粕的β-伴大豆球蛋白降解率達64.71%，Bac-c、Lac、Pho對β-伴大豆球蛋白含量也有顯著影響（P＜0.05）；6 種益生菌中只有Lac、Asp、Sac這3種益生菌發(fā)酵的豆粕大豆球蛋白含量有顯著降低（P＜0.05），Lac 和Asp 發(fā)酵豆粕中大豆球蛋白降解率分別達到68.61%、78.94%；6 種益生菌均能夠顯著降低發(fā)酵豆粕中胰蛋白酶抑制因子含量（P＜0.05）。其中Bac-l和Asp發(fā)酵豆粕對豆粕原料中的胰蛋白酶抑制因子含量影響最大，胰蛋白酶抑制因子降解率分別達到97.84%和98.07%。

表2 不同益生菌固態(tài)濕發(fā)酵對豆粕抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的影響(mg/g)

3 討論

本試驗選取地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、羅伊氏乳桿菌、米曲霉、釀酒酵母、沼澤紅假單胞菌這6種益生菌用于豆粕發(fā)酵，其中沼澤紅假單胞菌作為光合細(xì)菌的一種在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用較廣[14]，添加羅伊氏乳桿菌的飼料能夠顯著增加仔豬的體重，并表現(xiàn)出促進生長肥育豬生長性能的趨勢[15]，但羅伊氏乳桿菌和沼澤紅假單胞菌在豆粕發(fā)酵的應(yīng)用中未見或少見報道。本試驗以各項營養(yǎng)指標(biāo)的含量為基準(zhǔn)，試圖發(fā)現(xiàn)新的適用于豆粕固態(tài)濕發(fā)酵的益生菌，篩選適宜混合發(fā)酵的益生菌，充分優(yōu)化豆粕成為高品質(zhì)飼料原料。為適應(yīng)實際大規(guī)模生產(chǎn)工藝，采用紅糖（純度100%）作為培養(yǎng)基碳源對益生菌菌粉進行活化。本試驗對于紅糖的添加量和菌粉活化的時間進行了探討，最終確定在紅糖添加量為2.0 g、活化時間為48 h時，6種益生菌菌數(shù)均達到理想狀態(tài)。

固態(tài)濕發(fā)酵中益生菌的生長繁殖需要一定的能量來源，吳慶宇等[16]研究發(fā)現(xiàn)，豆粕經(jīng)益生菌的分解作用會造成部分干物質(zhì)損失，DMR 是反應(yīng)發(fā)酵過程中底物營養(yǎng)損失程度的一個指標(biāo)。在本試驗使用的6 種益生菌中，羅伊氏乳桿菌發(fā)酵豆粕的DMR提升最顯著。這可能與羅伊氏乳桿菌發(fā)酵豆粕pH 降低相關(guān)，pH降低限制了細(xì)胞酶的活性，能夠有效減少干物質(zhì)的損失，這與毛銀等[17]、謝全喜等[18]的研究結(jié)果十分相似。豆粕中粗蛋白含量和酸溶蛋白的量也是評價發(fā)酵豆粕營養(yǎng)品質(zhì)的重要指標(biāo)，Dai等[19]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵后，豆粕中的粗蛋白和可溶性蛋白含量分別從38.25%和6.26%顯著提高到44.82%和22.78%；Sharawy 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌發(fā)酵豆粕后豆粕粗蛋白含量能夠提升至50%。本試驗的6 種益生菌均能夠有效提高豆粕的粗蛋白和酸溶蛋白含量，其中地衣芽孢桿菌和沼澤紅假單胞菌的粗蛋白含量是未發(fā)酵豆粕的2.52倍和2.62倍，酸溶蛋白則未發(fā)酵豆粕的1.71倍和2.13倍。

蛋白酶酶解豆粕可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，因此能夠降低大豆蛋白免疫反應(yīng)性。益生菌發(fā)酵提高蛋白酶的活性可以降低直接使用酶解法降解蛋白質(zhì)帶來的副作用，減少對環(huán)境的影響并增加蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值[21]。6種益生菌發(fā)酵豆粕對豆粕酶活性的影響也不相同，沼澤紅假單胞菌發(fā)酵豆粕的酸性蛋白酶活性最高，達到2 527.09 U/g，釀酒酵母發(fā)酵豆粕的中性蛋白酶活性提升至899.49 U/g；地衣芽孢桿菌發(fā)酵的豆粕堿性蛋白酶活性達434.52 U/g。植酸是豆粕中非常重要的抗?fàn)I養(yǎng)因子，降低植酸含量能夠有效地提高豆粕營養(yǎng)價值。植酸酶可有效降解豆粕中植酸。纖維素酶活性提高不僅能夠提高益生菌對豆粕纖維素的利用程度，也可以在底物中為植酸酶提供更多降解植酸的機會，因此也能夠有助于減少植酸含量[8]。試驗選取的6 種益生菌中釀酒酵母和羅伊氏乳桿菌對豆粕植酸酶和纖維素酶的活性提升作用最為明顯。

豆粕中大分子蛋白質(zhì)和抗?fàn)I養(yǎng)因子的存在在一定程度上會阻礙豆粕營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用。馬靜等[22]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌發(fā)酵能夠有效降低豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量，Aguirre等[23]、Medeiros等[24]也發(fā)現(xiàn)益生菌具有蛋白質(zhì)水解活性，能夠降解蛋白質(zhì)。觀察6種益生菌發(fā)酵豆粕蛋白相對分子質(zhì)量條帶分布，米曲霉發(fā)酵豆粕的大分子蛋白質(zhì)基本被降解為分子量小于15 ku的小分子蛋白質(zhì)，沼澤紅假單胞菌發(fā)酵豆粕35 ku以下的小分子蛋白質(zhì)含量也明顯提升。6種益生菌發(fā)酵均能夠降低豆粕中β-伴大豆球蛋白的含量，其中米曲霉發(fā)酵豆粕β-伴大豆球蛋白降解率達到64.71%；羅伊氏乳桿菌和米曲霉發(fā)酵豆粕中大豆球蛋白降解率分別達到68.61%、78.94%；相比于未發(fā)酵豆粕，6種益生菌均能夠顯著降低發(fā)酵豆粕中胰蛋白酶抑制因子含量，其中地衣芽孢桿菌和米曲霉發(fā)酵對豆粕原料中的胰蛋白酶抑制因子降解率分別能夠達到97.84%和98.07%，幾乎能夠完全消除。由此可見米曲霉發(fā)酵在消除豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量、降解大分子蛋白質(zhì)方面都有非常大的優(yōu)勢。

4 結(jié)論

綜上所述，在固態(tài)濕發(fā)酵豆粕的過程中，6種不同的益生菌對發(fā)酵豆粕營養(yǎng)品質(zhì)的影響各不相同，各有優(yōu)劣。從營養(yǎng)成分變化、抗?fàn)I養(yǎng)因子含量變化和酶含量變化三個角度綜合指標(biāo)來看，米曲霉、沼澤紅假單胞菌、羅伊氏乳桿菌能夠顯著優(yōu)化豆粕營養(yǎng)品質(zhì)，尤其以米曲霉固態(tài)濕發(fā)酵提升豆粕營養(yǎng)品質(zhì)的能力最佳。因此，可以進一步探討益生菌復(fù)合發(fā)酵方式，使不同益生菌優(yōu)勢互補，能夠更有效地優(yōu)化發(fā)酵豆粕的營養(yǎng)品質(zhì)。