聶向民 朱傳福 朱海峰 張 毅 喬文本 劉 艷 邵靜茹

（山東省血液中心中華骨髓庫山東省分型實驗室/HLA研究室，濟南 250014）

人 類 白 細 胞 抗 原（human leukocyte antigen， HLA）是人類最復雜、最具多態(tài)性的免疫遺傳系統(tǒng)，在自我識別和免疫應答中發(fā)揮重要作用。HLA等位基因的發(fā)現(xiàn)鑒定對于闡明人類免疫系統(tǒng)的基因多樣性十分重要。截至2021年9月，已發(fā)現(xiàn)報道HLA等位基因30 862個［1］。隨著分子生物學技術(shù)與測序分型技術(shù)的發(fā)展，越來越多的HLA新等位基因被發(fā)現(xiàn)報道。一般僅對HLA新等位基因序列進行一般性描述，未對其編碼氨基酸差異在MHC分子結(jié)構(gòu)中的可能影響進行分析，對其血清學表型一般也較少檢測鑒定。本實驗室在對山東地區(qū)中華骨髓庫造血干細胞供者進行HLA高分辨分型時，發(fā)現(xiàn)1例HLA-B位點新等位基因，被世界衛(wèi)生組織HLA因子命名委員會命名為B*46：30。通過SWISS-MODEL同源建模及RCSB PDB軟件，對其氨基酸變異在MHC編碼蛋白分子三維結(jié)構(gòu)中的可能影響進行模擬分析，應用Histocheck、FATCAT軟件在線對比分析其蛋白分子間差異，并對其血清型表型進行檢測鑒定，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 資料 樣本來自中華骨髓庫，造血干細胞志愿捐獻者為山東淄博地區(qū)的漢族男性。

1.2 方法

1.2.1 Luminex液相流式PCR-SSOP分型 HLAA、B、DRB1高分辨分型采用Luminex平臺液相流式PCR-SSOP雜交分型，使用美國One Lambda LABType?HD分型試劑。首先進行HLA位點PCR擴增，然后對DNA擴增產(chǎn)物進行變性、中和，磁珠探針雜交，洗滌，SAPE（Streptavidin phycoerythrin）熒光標記，洗滌，上機檢測讀取數(shù)據(jù)。

1.2.2 PCR-SBT分型 PCR-SBT（Sequence based typing）復核使用ROSE Europe HLA SBT分型試劑。進行HLA位點PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)ExoI/SAP酶純化后，對HLA-A/B位點2、3、4外顯子進行正反雙向測序PCR，測序產(chǎn)物經(jīng)乙醇/醋酸鈉沉淀，熱變性速冷后ABI 3730毛細管測序電泳。Conexio分析軟件判讀分型結(jié)果。

1.2.3 單等位基因特異性測序 使用HLAssure SE SBT（Texas BioGene Inc.， Texas， USA.）單等位基因組特異性測序分型試劑，首先對樣本HLA-B*46、B*57進行等位基因組特異性擴增，以分開該位點的雜合等位基因。擴增產(chǎn)物ExoI/SAP酶純化后，以陽性組PCR產(chǎn)物為模板，進行2、3、4外顯子正反雙向測序PCR，1、5外顯子正向測序PCR。測序PCR產(chǎn)物再經(jīng)回收純化、熱變性速冷， ABI 3730測序儀測序電泳分析。AceuType SBT分型軟件數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 MHC蛋白分子三維結(jié)構(gòu)預測與差異分析

1.2.4.1 模擬分析差異氨基酸殘基在MHC蛋白分子三維結(jié)構(gòu)中的空間位置、理化性質(zhì)等變化 將新等位基因B*46：30及提交SWISS-MODEL同源建模在線服務器，結(jié)果數(shù)據(jù)文件通過RCSB PDB軟件，獲得MHC分子三維結(jié)構(gòu)模擬圖像。HLA-B46蛋白分子結(jié)構(gòu)由RCSB PDB數(shù)據(jù)庫獲得。模擬分析差異氨基酸殘基在MHC蛋白分子三維結(jié)構(gòu)中的空間位置、理化性質(zhì)等變化差異。

1.2.4.2 DSS值比較 HISTOCHECK在線比較B*46：01與B*46：30間差異，并將B*46：01與B*46：30及B*46常見及確認等位基因（common alleles and well documented alleles，CDW）：B*46：08、B*46：09、B*46：12、B*46：18、B*46：19間DSS值（dissimilarity score），以及A*02：01與A*02：03間DSS值進行比較［2-3］。

1.2.4.3 RMSD值比較 FATCAT在線比較B*46：30與B*46：01間均方根偏差（root-mean-square deviation，RMSD），并將B*46：01與B*46：30及B*46 CDW常見及確認等位基因間RMSD值，以及A*02：01與A*02：03間RMSD值進行比較［4］。

1.2.5 血清學表型檢測鑒定 血清學表型檢測使用Terasaki HLA Class I Asian Dry Typing Tray，Lot#2 Cat. ASN72D分型板進行微量淋巴細胞毒試驗。重新采集捐獻者新鮮ACD抗凝靜脈血，One Lambda熒光磁珠法分離T淋巴細胞，RPMI1640培養(yǎng)液混懸調(diào)整細胞數(shù)為2 000個/μl，分型板每孔中加入淋巴細胞1 μl，OLI補體1 μl，37 ℃孵育1 h，加入熒光終止劑5 μl。Olympus熒光倒置顯微鏡觀察結(jié)果。NIH法分數(shù)判定：1%～10%死細胞為1分（陰性）；11%～20%死細胞為2分（陰性可疑）；21%～40%死細胞為4分（弱陽性反應）；41%～80%死細胞為6分（陽性反應）；81%～100%死細胞為8分（強陽性反應）。

2 結(jié)果

2.1 Luminex PCR-SSOP分型 HLA Luminex流式SSOP雜交分型顯示B位點結(jié)果異常，無法給出完全匹配的分型結(jié)果。

2.2 PCR-SBT分型 HLA-B位點SBT雙鏈混合測序復核，顯示該位點無法給出完全匹配的分型結(jié)果。結(jié)果顯示該位點同源性最高的等位基因組合為B*46：01：01、57：01：01，但存在2個堿基差異，即第3外顯子第559位核苷酸序列為S（C/G）而非C，第560位為W（A/T）而非T（圖1），存在2個堿基差異替代。

圖1 PCR-SBT結(jié)果Fig.1 PCR-SBT results

2.3 單等位基因組特異性測序 單等位基因組特異性測序表明初次SBT結(jié)果所顯示堿基改變發(fā)生在B*46：01：01序列，即第3外顯子第559、560位核苷酸發(fā)生C-＞G、T-＞A替代改變（圖2），其相應第163位密碼子由CTG＞GAG，其編碼氨基酸由亮氨酸（Leu，L）變?yōu)楣劝彼幔℅lu，E）。

圖2 單等位基因SBT測序結(jié)果Fig.2 Single allele specific SBT results

2.4 申報命名 將序列遞交NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫，注冊序列號JN209964，經(jīng)EMBL-EBI申報被世界衛(wèi)生組織WHO HLA因子命名委員會正式命名為B*46：30。其HLA-A、B、DRB1位點最終分型結(jié)果為A*02：07，24：02；B*46：30，57：01：01；DRB1*07：01， 08：03。

2.5 新等位基因編碼蛋白分子三維結(jié)構(gòu)模擬分析

2.5.1 蛋白分子三維結(jié)構(gòu) 使用SWISS-MODEL同源建模及RCSB PDB軟件，獲得B*46：30編碼蛋白分子三維空間結(jié)構(gòu)模擬圖像見圖3。HLA-B46蛋白分子結(jié)構(gòu)（X-ray Diffraction 1.6 ?）由RCSB PDB數(shù)據(jù)庫獲得。

圖3 B*46：01與B*46：30編碼MHC蛋白分子三維結(jié)構(gòu)預測Fig.3 Comparisons of predicted MHC molecular structures between B*46：01 and B*46：30 molecules

模擬分析顯示，B*46：30第163位差異氨基酸殘基位于α2結(jié)構(gòu)域構(gòu)成抗原結(jié)合凹槽groove側(cè)壁的α螺旋上。相較于B*46：01，HLA-B*46：30第163位氨基酸殘基由疏水性脂肪族亮氨酸（L）→B*46：30帶負電荷的酸性谷氨酸（E）。RCSB PDB模擬分析還顯示，B*46：30的該谷氨酸殘基（163E）側(cè)鏈上的羧基COOH可跨越groove凹槽與α1結(jié)構(gòu)域α螺旋上第62位堿性精氨酸（62R）側(cè)鏈上的C=NH之間形成氫鍵。

2.5.2 Histocheck在線比較B*46：01與B*46：30差異 R值（Risler's score）及DSS（Dissimilarity score）值，見表1。B*46：01與B*46：30、B*46CDW（常見及確認等位基因）間DSS值［3］，以及A*02：01與A*02：03 間DSS值比較，見表2。

表1 B*46：01與B*46：30 間結(jié)構(gòu)比較DSS值及R值Tab.1 DSS Score and R Score compared between B*46：01 and B*46：30

表2 B*46：01與B*46：30、B*46 CWD間， A*02：01與A*02：03間DSS值Tab.2 DSS of structure comparisons between B*46：01 and B*46：30/B*46CWD，A*02：01 and A*02：03

2.5.3 FATCAT在線比較B*46：01與B*46：30、B*46 CDW間差異，以及A*02：01與A*02：03間差異 RMSD（root-mean-square deviation）值（?）比 較見表3。

表3 B*46：01與B*46：30、B*46 CWD間，A*02：01與A*02：03間結(jié)構(gòu)比較RMSD值（?）Tab.3 RMSD（?） of structure comparisons between B*46：01 and B*46：30/B*46CWD， A*02：01 and A*02：03

2.6 血清學表型檢測鑒定 HLA-B位點血清學表型檢測鑒定反應格局，見表4。其中12D、12E、6E、12A孔反應結(jié)果見圖4、圖5。血清學檢測結(jié)果顯示B46特異性（12D、12E孔）呈強陽性反應。

圖4 Terasaki HLA Ⅰ類分型板表型鑒定12D、12E孔反應結(jié)果Fig.4 Reactions of 12D， 12E of Terasaki HLA class Ⅰasian typing tray

圖5 Terasaki HLA Ⅰ類分型板表型鑒定6E、12A孔反應結(jié)果Fig.5 Reactions of 6E，12A of Terasaki HLA class Ⅰ asian typing tray

表4 Terasaki HLA Ⅰ類分型板表型鑒定反應格局表Tab.4 Reaction results（ Worksheet） of Terasaki HLA class Ⅰ asian typing tray

3 討論

HLA編碼基因位于人類第6號染色體短臂6P21.31～21.33，由一組緊密連鎖的復等位基因位點組成，是人類基因組中已知基因最密集的區(qū)域。其基因結(jié)構(gòu)以高度多態(tài)性為主要特征，每個位點含有大量的復等位基因，且其分布具有明顯的種族、地區(qū)差異。HLA的這種高度多態(tài)性顯示了遺傳背景的多態(tài)性和復雜性，被認為是人類在進化過程中抵御不良環(huán)境因素的一種適應性表現(xiàn)，使人類具有更大的抵抗病原體入侵的能力，對維持種群的生存與延續(xù)具有重要的生物學意義。

B*46等位基因在亞洲人群中頻率較高，明顯高于高加索白人和黑人。B*46：01在亞洲、高加索白人、黑人人群中基因頻率分別為7.46%、0.06%、0.05%［5］。B*46：01在 中 國 人 群 中 基 因 頻 率 為10.42%［3］。如按4位高分等位基因計算，B*46：01頻率高于B*40：01（9.787%）而在B位點中位列首位［3］。在本實驗室所作低分辨分型基因頻率統(tǒng)計中，B*46在山東地區(qū)（中國北方）人群中頻率（0.0558），位列B*13（0.1431）、B*15（62）（0.0727）、B*51（0.0702）、B*15（60）（0.0605）之后［6］。

為了對B*46：30差異氨基酸殘基在MHC分子三維結(jié)構(gòu)中的空間位置及其可能的生物學影響進行模擬分析，使用SWISS-MODEL在線服務器及RCSB PDB軟件，對其MHC編碼蛋白分子結(jié)構(gòu)進行模擬分析，以期對其編碼氨基酸殘基改變對MHC分子抗原多肽結(jié)合及TCR/抗體結(jié)合功能的可能影響進行初步預測分析。

既往研究顯示，構(gòu)成抗原多肽結(jié)合凹槽的氨基酸殘基，對其抗原多肽結(jié)合特性至關重要，以上關鍵位置單個氨基酸殘基理化性質(zhì)的改變，包括殘基側(cè)鏈的大小、伸展方向、疏水性等理化性質(zhì)的改變，都可對結(jié)合凹槽與抗原多肽的結(jié)合產(chǎn)生影響，并可直接或通過與多肽結(jié)合特異性的改變，影響HLA等位基因與T細胞受體（T cell receptor，TCR）及抗體的結(jié)合。此外，α螺旋上表面朝向上外側(cè)殘基側(cè)鏈理化性質(zhì)的改變，以及引起的可與TCR/抗體結(jié)合區(qū)域表面結(jié)構(gòu)形狀的改變，都可引起與TCR和/或抗體結(jié)合功能的改變［7-8］。同時這些區(qū)域也是序列多態(tài)性集中的區(qū)域。

通過模擬分析可得，B*46：30的第163位差異氨基酸殘基位于抗原結(jié)合凹槽側(cè)壁的α螺旋上的關鍵位置。相較HLA-B*46：01，B*46：30第163位氨基酸殘基由疏水性脂肪族亮氨酸L變?yōu)閹ж撾姾傻乃嵝怨劝彼酔。PDB模擬分析還顯示，發(fā)生改變以后，該163位帶負電荷的酸性谷氨酸（163E）側(cè)鏈上的羧基COOH可跨越groove凹槽與α1結(jié)構(gòu)域α螺旋上的第62位堿性精氨酸（62R）側(cè)鏈上的C=NH之間形成氫鍵。HistoCheck分析示其R值=32，并顯示163位為9肽P1、P2、P3位、HLA I類多肽以及TCR的結(jié)合位點［9］。以往研究顯示該位置是參與構(gòu)成抗原多肽結(jié)合凹袋Pocket A的關鍵位置［10］。同時，該位置亦是B*46：01構(gòu)成163LW eplet的關鍵位置，也是許多HLA-I類等位基因構(gòu)成163 eplet的關鍵位置［11］。根據(jù)結(jié)果推測，以上改變將有可能對其groove結(jié)合凹槽的多肽結(jié)合特性，以及α螺旋與TCR和/或抗體的結(jié)合特性產(chǎn)生影響，引起其結(jié)合特性的改變。

R值是由RISLER等［12］提出的通過氨基酸距離矩陣計算單對氨基酸交換之間的差異。其基本概念是，如果兩種氨基酸越相似，則它們在功能相關蛋白中相互替換的頻率越高。因此具有低取代率的氨基酸對（代表功能差異）產(chǎn)生更高的分值。DSS值是將HLA分子的多態(tài)性殘基分為主要（肽結(jié)合凹槽和/或TCR接觸區(qū)域）和次要（剩余氨基酸殘基）潛在同種異體反應性區(qū)域，通過將不同區(qū)域中每對氨基酸差異的R值加權(quán)相加而得出DSS值，作為一種同種反應性指標［13］。

通過將B*46：30及B*46常見及確認等位基因與B*46：01間的DSS值比較可以看出，B*46：30與B*46：01的DSS值1.32處于較低水平，明顯低于A*02：01與A*02：03間的3.98。A*02：03與A*02：01是臨床低分辨分型需要分開的不同血清型的等位基因，具有較高的同種反應差異性。這可能與B*46：30與B*46：01間僅存在單個氨基酸差異有關。但通過FATCAT在線分析，獲得B*46：01與B*46：30間RMSD值為0.59 ?，可以看到B*46：01與B*46：30間RMSD值較高，甚至高于A*02：01與A*02：03間的0.44 ?，與DSS值之間并無較一致的對應關系。這也反映了現(xiàn)有眾多自動蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對比算法常產(chǎn)生難以解釋的矛盾結(jié)果，且難以確定界值的現(xiàn)實狀況［14-15］。有國內(nèi)研究將修正RMSD值定為0.50?，作為allo-HSCT異基因造血干細胞移植發(fā)生Ⅰ/Ⅱ級aGVHD與Ⅲ/Ⅳ級aGVHD間的分界值［16］。

B*46：30血清學表型檢測顯示其B46特異性呈強陽性反應，即其表型鑒定為B46，顯示該血清學抗原分型板中所含單克隆抗體微量淋巴毒反應未能對B*46：30的163LW→EW eplet改變產(chǎn)生可見差異反應。另外，本次檢測6E孔（B7+/-55）顯示存在部分死細胞的弱陽性反應，分析懷疑該交叉反應是否可能由B7的163EW的eplet引起，有待進一步驗證。此外，12A孔BW6反應陰性，考慮可能為抗體血清學反應質(zhì)量問題。

雖然B*46：30血清學表型鑒定為B46未見明顯改變，但通過以上分析，本課題組推測其差異氨基酸殘基的改變，在可能導致B*46：30多肽結(jié)合功能的改變的同時，仍有可能直接及/或通過多肽結(jié)合功能的改變，影響其與TCR及抗體的結(jié)合特性，并可能對臨床造血干細胞移植及排異反應產(chǎn)生影響。上述推測尚需今后進一步研究證實。

在國內(nèi)已發(fā)現(xiàn)HLA新等位基因的報道中，一般僅對其變異序列進行一般性描述報告，未對其結(jié)構(gòu)差異及生物學影響進行探討分析。本文通過對B*46：30編碼蛋白分子三維結(jié)構(gòu)模擬分析，對其差異氨基酸變異的可能影響進行初步探討分析，對今后新等位基因功能研究具有一定的借鑒意義。