魯修明 李小祺 徐 皓 姚寒暉 （安徽醫(yī)科大學附屬六安醫(yī)院，六安 237000）

胃癌是世界上第二大惡性腫瘤相關(guān)死亡原因，五年生存率低于30%，雖然手術(shù)治療、化療或輔助化療在一定程度上可提高胃癌患者生存率，但效果仍然不佳。腫瘤細胞快速增殖和遷移是導致預后不良的主要原因之二。目前胃癌發(fā)病機制尚未完全闡明，深入了解細胞內(nèi)信號通路調(diào)控異常有助于制定新的治療策略［1］。膠原蛋白是人體內(nèi)最豐富的蛋白質(zhì)，占蛋白質(zhì)總量的1/3。在人類蛋白譜中，至少有28種不同類型的膠原蛋白并由44個膠原基因編碼［2］。

有證據(jù)表明許多類型的膠原蛋白在不同癌型中高表達，其中Ⅳ型膠原蛋白α1（collagen typeⅣ alpha 1，COL4A1）屬于Ⅳ型膠原蛋白家族，包含3個結(jié)構(gòu)域，是細胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）中最豐富的成分［3-4］。研究表明ECM是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，具有調(diào)節(jié)腫瘤細胞惡性行為作用［5］。因此，COL4A1可能是一個促癌基因，其在結(jié)直腸癌、膀胱癌及乳腺癌中高表達并參與腫瘤細胞的增殖和遷移［6-8］。然而，COL4A1在胃癌進展中的詳細機制尚未闡明。

本研究首先通過數(shù)據(jù)庫探討胃腺癌（stomach adenocarcinoma，STAD）患者中COL4A1表達情況；然后基于TCGA（The Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)庫構(gòu)建預測STAD患者預后的Nomogram模型；最后通過體外實驗揭示COL4A1調(diào)控胃癌細胞增殖和細胞周期的機制。本研究對COL4A1在STAD中的分子機制進行全面探討，可能為STAD的治療開辟新策略。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細胞系AGS、MKN-45、BGC-823和正常胃上皮細胞系GES-1（中國科學院細胞銀行，中國上海）；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素、鏈霉素（Gibco，Carlsbad，California）；靶向COL4A1的小干擾RNA（small interfering RNAs，si-RNA）和陰性對照（si-con）購自Genepharma（中國上海）；si-COL4A1正向引物：5'-GATCCGGAGCGAGATGTTCAAGAAGCCTTCCTGTCAGAGCTTCTTGAACATCTCGCTCCTTT-TTG-3＇；反向引物：5'-AATTCAAAAAGGAGCGAGATGTTCAAGAAGCTCTGACAGGAAGGCTTCTTGAACATCTCGCTCCG-3＇；Lipofectamine2000（Invitrogen，Carlsbad）；cDNA合成試劑盒（TaKaRa生物醫(yī)學科技有限公司，北京）；BCA試劑盒（Beyotime，Inc，中國上海）；ECL試劑盒（Beyotime，Inc）；3-2，5-二苯基四氮唑溴化銨（MTT，Solarbio，中國北京）；二甲基亞砜（Beyotime公司）；4%多聚甲醛、結(jié)晶紫（Sigma-Aldrich）；Transwell小室（BD Biosciences，F(xiàn)ranklin Lakes，New Jersey）；本實驗所有抗體均購自Abcam。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析

1.2.1.1 COL4A1表達特點及與STAD患者預后關(guān)系 GEPIA［9］（http://gepia.cancer-pku.cn/）數(shù)據(jù)庫檢測COL4A1基因的表達情況并利用GEO數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載GSE54129表達矩陣進行COL4A1基因表達驗證。The Human Protein Atlas［10］（https://www.proteinatlas.org/）數(shù)據(jù)庫分析COL4A1在STAD組織及正常胃組織表達的免疫組織化學染色情況。Oncomine（https://www.oncomine.org/）數(shù)據(jù)庫分析COL4A1在33種泛癌中的表達情況。從TCGA（https://cancergenome.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中下載STAD患者基因表達矩陣及臨床信息，提取COL4A1表達量及生存狀態(tài)信息，繪制生存曲線。

1.2.1.2 COL4A1表達與STAD患者免疫浸潤的關(guān)系 腫瘤浸潤性淋巴細胞是在癌癥前哨淋巴結(jié)狀態(tài)存活的獨立預測因子，本文擬研究該基因表達 是否與STAD患者免疫浸潤水平相關(guān)，首先從 TIMER2.0［11］（http://timer.comp-genomics.org/）數(shù)據(jù)庫下載STAD的6種免疫浸潤細胞的得分數(shù)據(jù)，分別分析COL4A1基因表達與這些免疫細胞得分的相關(guān)性。

1.2.1.3 COL4A1基因表達與藥物敏感相關(guān)性分析 從Cellminer［12］數(shù)據(jù)庫（https://discover.nci.nih.gov/cellminer/home.do/）下載DTPNCI60 Z評分及相應的RNA-seq表達數(shù)據(jù)。篩選與COL4A1基因表達相關(guān)且有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）的前18個藥物，繪制散點圖。

1.2.1.4 基于COL4A1表達構(gòu)建Nomogram模型 在腫瘤學和臨床醫(yī)學中，Nomogram模型是一種常用的預測預后方法［13］。從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載STAD患者基因表達矩陣及臨床信息，刪除臨床信息缺失樣本。首先單因素和多因素Cox風險回歸模型篩選變量。根據(jù)多因素Cox風險回歸分析結(jié)果，使用R軟件包“rms”建立Nomogram預測STAD患者一、三、 五年生存率。Nomogram提供圖形化，可通過與每個風險因素相關(guān)的點來計算單個患者預后風險。采用校正曲線就決策曲線評估Nomogram的預測效能。

1.2.1.5 GO富集分析及KEGG信號通路分析 GESA分析是解釋基因表達數(shù)據(jù)的一種常用分析方法［14］?；?于LinkedOmics［15］（http://www.linkedomics.org）數(shù)據(jù)庫獲得的STAD中COL4A1共表達基因，采用GSEA分析進行基因本體論（gene ontology，GO）富集分析及京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路分析。

1.2.2 實驗驗證

1.2.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人胃癌細胞系AGS、MKN-45、BGC-823和正常胃上皮細胞系GES-1常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS和100 U/ml青霉素及0.1 mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。當6孔板中的細胞生長到80%融合時，根據(jù)制造商方案，采用基于Lipofectamine2000的siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細胞系。RT-qPCR評估轉(zhuǎn)染48 h后的干擾效果。使用轉(zhuǎn)染效率超過80%的siRNAs。

1.2.2.2 RNA提取及RT-qPCR分析 RT-qPCR檢測COL4A1表達水平。根據(jù)制造商要求，TRIzol法提取細胞總RNA，cDNA合成試劑盒合成cDNA，并利用COL4A1和GAPDH（內(nèi)參）特異性引物進行PCR擴增。COL4A1正向引物：5＇-CAGGCACCCCATCTGTTGAT-3＇；反向引物：5＇-CATTGCCTTGCACGTAGAGC-3＇。PCR程序如下：50 ℃ 3 min，95 ℃ 5 min，（95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s）×40個循環(huán)，40 ℃ 1 min。在PCR循環(huán)結(jié)束時，進行熔融曲線分析。采用2-ΔΔCt法計算COL4A1在胃癌細胞中的表達水平。

1.2.2.3 蛋白質(zhì)印跡分析 從收獲的胃癌細胞中獲得總蛋白，采用BCA試劑盒對其濃度進行定量。基于SDS-PAGE分離30 μg/孔蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉膜的非特異性結(jié)合位點，使用以下一級抗體（COL4A1，1∶1 000；p-PI3K， 1∶1 000；PI3K，1∶1 000；p-AKT，1∶1 000；AKT，1∶1 000；GAPDH，1∶1 000）在4 ℃下培養(yǎng)膜過夜。隨后，將HRP結(jié)合的二級抗體添加到膜中，室溫培養(yǎng)2 h。使用ECL試劑盒顯示蛋白條帶。

1.2.2.4 細胞活力評估 將轉(zhuǎn)染si-con和si-COL4A1的胃癌細胞培養(yǎng)于96孔板，并使其黏附過夜。MTT法檢測細胞增殖：在每個培養(yǎng)4 h的孔中加入10 μl MTT，移除培養(yǎng)基并添加150 μl新鮮二甲基亞砜 10 min。使用微孔板讀取器記錄570 nm處的吸光度值（A），并使用630 nm處的吸光度值作為參考。細胞增殖率顯示：轉(zhuǎn)染組相對增殖率（%）=（A570nm-A630nm）/（對照組A570nm-A630nm）×100%。

1.2.2.5 集落形成試驗 將轉(zhuǎn)染si-con和si-COL4A1的胃癌細胞培養(yǎng)于60 mm培養(yǎng)皿，并在無干擾情況下培養(yǎng)7 d。以4%多聚甲醛固定細胞30 mim，0.5%結(jié)晶紫染色30 min。最后用Image J軟件進行菌落計數(shù)。

1.2.2.6 傷口愈合試驗、細胞遷移和侵襲試驗 細胞在6孔培養(yǎng)板中重復接種。一旦匯合，以無血清培養(yǎng)基預處理培養(yǎng)物12 h。第2天用10 μl的無菌微量移液管尖端刮傷單層，PBS清洗刮傷的單層。在0 h時間點記錄基線測量值。在24 h時測量治療后遷移到劃痕傷口間隙的情況。

在孔徑為8 μm的聚碳酸酯膜轉(zhuǎn)孔室中進行細胞遷移和侵襲實驗。采用不含Matrigel的Transwell小室評估遷移能力；采用涂有Matrigel的侵入小室實施侵襲試驗。將處理過的細胞培養(yǎng)到上腔，將含10%FBS的培養(yǎng)基置于下腔作為引誘劑。然后，將細胞在37 ℃下培養(yǎng)24 h，用棉簽去除上表面的非遷移細胞。4%多聚甲醛固定細胞30 min，0.5%結(jié)晶紫染色20 min。顯微鏡下對5個不同區(qū)域附著的細胞進行計數(shù)。每個實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法 使用SPSS22.0及GraphPad Prism 7.00進行統(tǒng)計學分析。采用Kaplan-Meier和log-rank檢驗繪制生存曲線。數(shù)據(jù)以±s表示，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 COL4A1在STAD中的表達情況 GEPIA數(shù)據(jù)庫證實COL4A1在STAD組織中高表達（圖1A）。GEO數(shù)據(jù)集GSE54129驗證COL4A1 mRNA在STAD組織中顯著上調(diào)（圖1B）。免疫組化結(jié)果分析COL4A1在STAD組織中陽性表達，而在正常胃組織中陰性表達（圖1C）。TCGA數(shù)據(jù)庫顯示COL4A1高表達患者的預后低于低表達患者（P＜0.05，圖2D）。此外，COL4A1在結(jié)直腸癌、淋巴瘤、頭頸部癌、胃癌、肝癌等組織中顯著上調(diào)（圖1E）。

圖1 COL4A1在STAD患者中的表達Fig.1 Expression of COL4A1 in STAD patients

2.2 COL4A表達水平與STAD患者免疫浸潤的關(guān)系 COL4A表達水平與B細胞水平呈負相關(guān)（P＜0.05）；與CD4 T細胞、CD8 T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞水平呈正相關(guān)（P＜0.05，圖2）。

圖2 COL4A表達水平與STAD患者免疫浸潤細胞散點圖Fig.2 Scatter diagram of COL4A expression level and immune infiltrating cells in patients with STAD

2.3 COL4A1表達水平與藥物敏感相關(guān)性分析 COL4A1表達水平與較多藥物敏感相關(guān)，如生物靶向治療腫瘤藥物（樂伐替尼、埃羅替尼、依魯替尼）或治療STAD患者常見化療藥物紫杉醇及奧沙利鉑（圖3）。

圖3 COL4A1表達水平與藥物敏感相關(guān)性Fig.3 Correlation between COL4A1 expression level and drug sensitivity

2.4 STAD患者預后Cox風險比例回歸模型分析 單因素及多因素Cox風險比例回歸模型分析結(jié)果顯示，COL4A1、年齡、TNM分期（Ⅲ期及Ⅳ期）、放射治療（否）是STAD患者病死的危險因素（P＜0.05，表1）。

表1 STAD患者預后Cox風險比例回歸模型分析結(jié)果Tab.1 Analysis results of Cox risk proportional regression model for prognosis of patients with STAD

2.5 構(gòu)建預測STAD患者預后的Nomogram模型 將COL4A1、年齡、TNM分期、放射治療作為構(gòu)建預測STAD患者一年、三年及五年生存率的Nomogram模型指標，見圖4A。內(nèi)部數(shù)據(jù)集驗證結(jié)果顯示 C-index為0.727（95%CI：0.651～1.000），見圖4B。一年（圖4C）、三年（圖4D）及五年（圖4E）決策曲線分析結(jié)果顯示，該Nomogram模型的臨床凈收益明顯高于單個指標。

圖4 STAD患者預后Nomogram模型及預測效能評估Fig.4 Nomogram model of prognosis and evaluation of predictive efficacy in patients with STAD

2.6 GO富集分析及KEGG信號通路分析 選取 5 000個與COL4A1共表達的基因進行GO富集分析及KEGG信號通路。GO富集分析顯示COL4A1主要富集在生物調(diào)節(jié)代謝、膜、蛋白結(jié)合（圖5A）；KEGG信號通路分析顯示COL4A1主要富集在AGERAGE signaling pathway、PI3K/AKT signaling pathway、Cell adhesion molecules （CAMs）及cGMP-PKG signaling pathway（圖5B）。

圖5 GO富集分析及KEGG信號通路分析Fig.5 GO enrichment analysis and KEGG signal pathway analysis

2.7 抑制COL4A1能降低AGS細胞增殖 RT-qPCR分析正常胃上皮細胞系GES-1和人胃癌細胞系（AGS、MKN-45和BGC-823）mRNA水平。如圖6A所示，癌細胞系中COL4A1的表達顯著高于正常細胞（P＜0.05），與數(shù)據(jù)庫分析得出結(jié)論一致。在所有檢測癌細胞系中，AGS細胞中的COL4A1表達水平最高。因此，后續(xù)的體外實驗均使用AGS細胞。

RT-qPCR和蛋白印跡法檢測AGS細胞中COL4A1 mRNA和蛋白表達評估si-COL4A1轉(zhuǎn)染效率。圖6B～D結(jié)果顯示si-COL4A1可顯著降低AGS細胞中COL4A1 mRNA和蛋白表達，干擾效率超過70%。MTT法檢測AGS細胞生長活性。結(jié)果顯示，對照組相比，COL4A1基因敲降后48 h、72 h和96 h AGS細胞生長速度明顯降低（P＜0.05，圖6E）。集落形成試驗觀察到轉(zhuǎn)染si-COL4A1的AGS細胞形成較少克隆數(shù)（P＜0.05，圖6F～G）。提示COL4A1在AGS細胞增殖中起重要作用。

圖6 抑制COL4A1能降低AGS細胞增殖和集落形成Fig.6 Inhibition of COL4A1 can reduce AGS cell proliferation and colony formation

2.8 抑制COL4A1能降低AGS細胞遷移和侵襲能力 如圖7所示，轉(zhuǎn)染si-COL4A1的AGS細胞與對照組相比，其遷移和侵襲能力明顯減弱（P＜0.01）。提示COL4A1基因敲降能明顯抑制AGS細胞的遷移和侵襲能力。

圖7 抑制COL4A1能降低AGS細胞遷移和侵襲能力Fig.7 Inhibition of COL4A1 can reduce migration and invasion of AGS cells

2.9 抑制COL4A1能抑制AGS細胞P13K/AKT信號通路 蛋白印跡法檢測P13K/AKT信號通路關(guān)鍵生物標志物p-AKT、AKT、p-PI3K和PI3K表達水平。圖8結(jié)果顯示COL4A1基因敲降后顯著抑制AGS細胞p-AKT和p-PI3K表達（P＜0.01），但對AKT和PI3K的總表達水平無明顯影響（P＞0.05）。提示COL4A1通過部分調(diào)控PI3K/AKT信號通路介導AGS細胞增殖和轉(zhuǎn)移。

圖8 蛋白質(zhì)印跡分析檢測抑制COL4A1后對AGS細胞中p-AKT、AKT、p-PI3K和PI3K的表達影響Fig.8 Western blot analysis was used to detect effect of inhibition of COL4A1 on expressions of p-AKT， AKT， p-PI3K and PI3K in AGS cells

3 討論

STAD是一種異質(zhì)性疾病，在病理特征、生物學行為和基因表達譜上存在顯著差異。盡管在診斷和治療方面取得了進展，但在診斷時大多處于晚期，具有較高的復發(fā)和轉(zhuǎn)移風險，預后差［16］。因此，闡明STAD發(fā)生和疾病進展的分子機制以確定潛在生物標志物和治療靶點相當重要。目前，COL4A1表達失調(diào)在幾種癌癥中均被報道，而在STAD中的生物學作用和預后價值尚不清楚［6-8］。本研究觀察到COL4A1在STAD組織中表達明顯高于對照組（使用TCGA、GEPIA和腫瘤數(shù)據(jù)）。此外，COL4A1表達水平與免疫浸潤及藥物敏感性相關(guān)。基于COL4A1表達水平及臨床數(shù)據(jù)，本研究構(gòu)建一種可以有效預測STAD患者一年、三年及五年生存率的Nomogram模型。體外實驗結(jié)果表明，COL4A1對AGS細胞生長、集落形成、遷移和侵襲具有顯著抑制作用，提示COL4A1可能作為一種STAD誘導癌基因，具有STAD診斷、治療及評估預后的臨床價值。

COL4A1是膠原家族重要成員，是大多數(shù)結(jié)締組織和胚胎組織中ECM的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分。在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者中觀察到COL4A1表達上調(diào)，可作為檢測術(shù)后復發(fā)的腫瘤標志物［6］。膀胱癌體外實驗結(jié)果證實，癌細胞產(chǎn)生的COL4A1通過誘導腫瘤出芽促進腫瘤侵襲；靶向COL4A1能抑制浸潤模式形成［7］。乳腺癌體外實驗結(jié)果也證實了類似結(jié)論［8］。本研究通過生物信息學分析COL4A1在STAD組織中過表達與不良預后相關(guān)；此外，在泛癌中也發(fā)現(xiàn)許多癌型組織中COL4A1表達上調(diào)。體外實驗也證實抑制COL4A1表達可抑制細胞增殖、存活、凋亡和遷移，提示COL4A1是一個促癌蛋白。癌細胞與其微環(huán)境間的相互作用是腫瘤進展的基礎部分，腫瘤微環(huán)境包括多形核細胞、巨噬細胞、T細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞和B細胞［17］。本研究通過免疫浸潤分析發(fā)現(xiàn)COL4A表達水平與B細胞水平呈負相關(guān)；與CD4 T細胞、CD8 T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞水平呈正相關(guān)。而高免疫浸潤與臨床藥物治療結(jié)果有關(guān)［18］。為此，本研究從Cellminer數(shù)據(jù)庫下載DTPNCI60 Z評分及相應的COL4A1表達數(shù)據(jù)，進一步發(fā)現(xiàn)COL4A1表達水平與較多藥物敏感相關(guān)，如生物靶向治療腫瘤藥物（樂伐替尼、埃羅替尼、依魯替尼）或治療STAD患者常見化療藥物紫杉醇及奧沙利鉑。這些結(jié)果提示COL4A1表達水平可評估STAD患者免疫浸潤及化療效果。目前尚未出現(xiàn)靶向COL4A1的藥物，為了更好地將COL4A1應用于臨床，本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫開發(fā)出一種可有效預測STAD患者一年、三年及五年生存率的Nomogram模型。內(nèi)部數(shù)據(jù)集的校正曲線證實Nomogram模型具有很好的預測效能。在一年、三年及五年的決策曲線分析中，Nomogram模型預測結(jié)果的臨床凈收益高于其他指標。COL4A1能加強TNM分期預測預后的能力，可對現(xiàn)有TNM分期方法進行補充。

為了更加詳細地闡述COL4A1的功能機制，課題組進行了GO富集分析及KEGG信號通路分析。GO富集分析顯示COL4A1主要富集在生物調(diào)節(jié)代謝、膜、蛋白結(jié)合；KEGG信號通路分析顯示COL4A1主要富集在AGE-RAGE signaling pathway、PI3K/AKT signaling pathway、Cell adhesion molecules （CAMs）及cGMP-PKG signaling pathway。已有研究證實PI3K/AKT信號通路主要參與調(diào)控細胞增殖、存活、凋亡和遷移等過程。值得注意的是，STAD中PI3K/AKT信號通路被異常激活，該通路在癌細胞存活中具有關(guān)鍵作用。據(jù)報道，胃癌細胞的增殖和侵襲能力增強時，p-AKT表達顯著上調(diào)［19］。此外，抑制p-PI3K和p-AKT已經(jīng)被證明可抑制癌細胞的增殖和侵襲［20］。本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致，COL4A1基因敲降后顯著抑制AGS細胞p-AKT和p-PI3K表達，但對AKT和PI3K的總表達水平無明顯影響。提示COL4A1通過部分調(diào)控PI3K/AKT信號通路介導AGS細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。COL4A1在淋巴母細胞系表達上調(diào)，并通過PI3K/AKT信號通路激活成纖維細胞，提示該基因可能是預測患者癌癥遺傳易感性的候選基因，并可用于腫瘤靶向治療［21］。然而，COL4A1如何調(diào)控PI3K/AKT信號通路，該通路是否通過與其他基因結(jié)合直接或間接調(diào)控尚未明確。因此，未來應該關(guān)注COL4A1與PI3K/AKT信號通路間的具體機制。

綜上所述，本研究結(jié)果表明COL4A1表達水平是STAD患者預后不良的獨立預測因素，可作為評估預后的腫瘤標志物，而本研究所構(gòu)建的Nomogram模型極有利于臨床實踐。抑制COL4A1可抑制細胞的增殖、集落形成、遷移和侵襲，其作用機制可能與PI3K/AKT信號通路有關(guān)。