官慶華 姜雪梅 李新煥（青島大學(xué)附屬青島市海慈醫(yī)院心內(nèi)科，青島 266022）

膿毒癥是危及臨床危重病患者生命安全的一種疾病，主要是由機(jī)體對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)而引起器官功能障礙，心肌損傷是其常見并發(fā)癥之一，當(dāng)膿毒癥發(fā)生時(shí)機(jī)體產(chǎn)生大量炎癥因子，可通過(guò)多種途徑引起心肌損傷［1］。研究發(fā)現(xiàn)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可激活細(xì)胞核因子κB（NF-κB）等多種途徑而增加炎癥因子的分泌量從而加重炎癥反應(yīng)［2］。LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡可加重膿毒癥所致的心肌損傷，因而尋找有效藥物減輕心肌細(xì)胞損傷成為研究重點(diǎn)［3］。研究表明多糖類化合物具有抗氧化、抗炎等作用，并可通過(guò)調(diào)控微小RNA（miRNA）表達(dá)而減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥損傷［4］。蕨麻多糖是從鵝絨委陵菜干燥根中提取的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎等多種生物學(xué)活性，研究表明蕨麻多糖可通過(guò)增強(qiáng)腦組織抗氧化能力及抑制炎癥反應(yīng)而減輕大鼠腦缺血再灌注損傷［5］。miR-421在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)其表達(dá)可抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡從而減輕細(xì)胞損傷［6］。因此，本研究采用LPS誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞H9C2建立細(xì)胞損傷模型，探討蕨麻多糖是否通過(guò)調(diào)控miR-421的表達(dá)影響LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，為預(yù)防和治療膿毒癥所致的心肌損傷提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料 蕨麻購(gòu)自青海脊峰本草醫(yī)藥；LPS購(gòu)自北京百奧萊博；大鼠心肌細(xì)胞H9C2購(gòu)自上海弘順生物；LipofectamineTM3000 Transfection Reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；anti-miR-421、anti-miR-NC、miR-421 mimics、miR-NC購(gòu)自廣州銳博生物；miRNA提取試劑盒購(gòu)自上海研卉生物；反轉(zhuǎn)錄試劑與熒光定量PCR試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher；TNF-α、IL-6檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物；凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶；兔抗鼠cleaved-caspase3、cleaved-caspase9抗體與二抗購(gòu)自美國(guó)CST。

1.2 方法

1.2.1 蕨麻多糖的提?。?］稱取2 g蕨麻粉加入一定體積水后置于恒溫水浴鍋中浸提24 h，取出后室溫冷卻，裝入離心管中，5 000 r/min離心20 min后吸取上清液，向上清液中加入3倍體積的95%乙醇于4 ℃冰箱內(nèi)沉淀12 h后離心，用丙酮、乙醚多次沖洗沉淀物，冷凍干燥后獲得蕨麻多糖，檢測(cè)其含量為60.2%，加入培養(yǎng)基制備成實(shí)驗(yàn)所需濃度。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)處理及分組 心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后按3 000個(gè)/孔接種于96孔板，分別加入含有10 mg/L LPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h［8］，記為L(zhǎng)PS組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞記為Con組。蕨麻多糖加入培養(yǎng)基稀釋濃度分別為0.05 mg/ml、0.1 mg/ml、0.2 mg/ml［9］，分別將含有不同濃度蕨麻多糖與10 mg/L LPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別記為L(zhǎng)PS+蕨麻多糖低劑量組、LPS+蕨麻多糖中劑量組、LPS+蕨麻多糖高劑量組。參照LipofectamineTM3000 Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑分別將anti-miR-NC、anti-miR-421轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞后加入含有10 mg/L LPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別記為L(zhǎng)PS+anti-miR-NC組、LPS+anti-miR-421組。miR-NC、miR-421 mimics分別轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞后加入含有濃度為0.2 mg/ml蕨麻多糖與10 mg/L LPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別記為L(zhǎng)PS+蕨麻多糖+miR-NC組、LPS+蕨麻多糖+miR-421組。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)炎癥因子TNF-α、IL-6的水平 收集各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，采用ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-6的水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集各組心肌細(xì)胞加入預(yù)冷PBS洗滌后，3 000 r/min離心6 min后棄上清，向細(xì)胞沉淀中加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，室溫避光孵育10 min，于1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-421的表達(dá)水平 用miRNA提取試劑盒提取各組心肌細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。miR-421以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-421相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 Western blot檢測(cè)cleaved-caspase3、cleavedcaspase9蛋白表達(dá) 用蛋白裂解液提取各組心肌細(xì)胞總蛋白，采用BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量，蛋白高溫變性后經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，在90 V恒壓下將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，PVDF膜置于含有5%脫脂奶粉的封閉液中封閉2 h，加入cleaved-caspase3（1∶1 000）、cleaved-caspase9（1∶1 000）、GAPDH抗體（1∶2 000）稀釋液4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后加入二抗稀釋液（1∶3 000）室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光劑顯影后應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蕨麻多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響 與Con組比較，LPS組TNF-α、IL-6的水平升高（P＜0.05）；與LPS組比較，LPS+蕨麻多糖低劑量組、LPS+蕨麻多糖中劑量組、LPS+蕨麻多糖高劑量組TNF-α、IL-6的水平降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性，見表1。

表1 蕨麻多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響（±s，n=9）Tab.1 Effect of potentilla anserina polysaccharide on inflammatory response of cardiomyocytes induced by LPS （±s，n=9）

表1 蕨麻多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響（±s，n=9）Tab.1 Effect of potentilla anserina polysaccharide on inflammatory response of cardiomyocytes induced by LPS （±s，n=9）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05； compared with LPS group， 2）P＜0.05； compared with LPS+PAP low-dose group， 3）P＜0.05； compared with LPS+PAP middle-dose group， 4）P＜0.05. PAP.Potentilla anserina polysaccharide.

2.2 蕨麻多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響 與Con組比較，LPS組細(xì)胞凋亡率和cleavedcaspase3、cleaved-caspase9蛋白水平升高（P＜0.05）；與LPS組比較，LPS+蕨麻多糖低劑量組、LPS+蕨麻多糖中劑量組、LPS+蕨麻多糖高劑量組細(xì)胞凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白水平降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性，見圖1、表2。

表2 蕨麻多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of potentilla anserina polysaccharide on LPS-induced cardiomyocyte apoptosis（±s，n=9）

表2 蕨麻多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of potentilla anserina polysaccharide on LPS-induced cardiomyocyte apoptosis（±s，n=9）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05； compared with LPS group， 2）P＜0.05； compared with LPS+PAP low-dose group， 3）P＜0.05； compared with LPS+PAP middle-dose group， 4）P＜0.05. PAP.Potentilla anserina polysaccharide.

圖1 蕨麻多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effect of potentilla anserina polysaccharide on LPSinduced cardiomyocyte apoptosis

2.3 蕨麻多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞miR-421表達(dá)的影響 與Con組比較，LPS組miR-421的表達(dá)量升高（P＜0.05）；與LPS組比較，LPS+蕨麻多糖低劑量組、LPS+蕨麻多糖中劑量組、LPS+蕨麻多糖高劑量組miR-421的表達(dá)量降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性，見表3。

表3 蕨麻多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞miR-421表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of potentilla anserina polysaccharide on expression of miR-421 in cardiomyocytes induced by LPS（±s，n=9）

表3 蕨麻多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞miR-421表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of potentilla anserina polysaccharide on expression of miR-421 in cardiomyocytes induced by LPS（±s，n=9）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05； compared with LPS group， 2）P＜0.05； compared with LPS+PAP low-dose group， 3）P＜0.05； compared with LPS+PAP middle-dose group， 4）P＜0.05. PAP.Potentilla anserina polysaccharide.

2.4 干擾miR-421表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的影響 與LPS+anti-miR-NC組比較，LPS+anti-miR-421組TNF-α、IL-6的水平降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率和cleaved-caspase3、cleavedcaspase9蛋白水平降低（P＜0.05），見圖2、表4。

表4 干擾miR-421表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=9）Tab.4 Effect of interfering miR-421 expression on inflammatory response and apoptosis of cardiomyocytes induced by LPS（±s，n=9）

表4 干擾miR-421表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=9）Tab.4 Effect of interfering miR-421 expression on inflammatory response and apoptosis of cardiomyocytes induced by LPS（±s，n=9）

Note：Compared with LPS+anti-miR-NC group， 1）P＜0.05.

圖2 干擾miR-421表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的 影響Fig.2 Effect of interfering miR-421 expression on LPS-induced cardiomyocyte apoptosis

2.5 miR-421過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了蕨麻多糖（0.2 mg/ml）對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的作用 與LPS+蕨麻多糖+miR-NC組比較，LPS+蕨麻多糖+miR-421組TNF-α、IL-6的水平升高（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白水平升高（P＜0.05），見圖3、表5。

表5 miR-421過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了蕨麻多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的作用（±s，n=9）Tab.5 Overexpression of miR-421 reversed effect of potentilla anserina polysaccharide on inflammatory response and apoptosis of cardiomyocytes induced by LPS （±s，n=9）

表5 miR-421過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了蕨麻多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的作用（±s，n=9）Tab.5 Overexpression of miR-421 reversed effect of potentilla anserina polysaccharide on inflammatory response and apoptosis of cardiomyocytes induced by LPS （±s，n=9）

Note：Compared with LPS+PAP+miR-NC group， 1）P＜0.05.PAP.Potentilla anserina polysaccharide.

圖3 miR-421過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了蕨麻多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的作用Fig.3 Overexpression of miR-421 reversed effect of PAP on LPS-induced cardiomyocyte apoptosis

3 討論

膿毒癥可發(fā)展為膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征等，研究顯示40%～50%的膿毒癥患者會(huì)出現(xiàn)心臟功能障礙，膿毒癥誘發(fā)心肌損傷的致病機(jī)制較為復(fù)雜，炎癥因子生成過(guò)量可引起心肌細(xì)胞過(guò)度凋亡從而加重心肌細(xì)胞損傷，研究表明從植物中提取的活性成分在減輕心肌損傷方面具有重要作用，其可能以miRNA為靶點(diǎn)從而達(dá)到治療目的［10-12］。

蕨麻多糖對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷、神經(jīng)細(xì)胞損傷等均具有保護(hù)作用，研究表明蕨麻多糖可通過(guò)增強(qiáng)缺氧誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化能力而減輕細(xì)胞損傷［13］。蕨麻多糖可通過(guò)清除氧自由基而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)從而減輕四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷［14］。蕨麻多糖可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡從而改善低壓缺氧誘導(dǎo)的腦損傷［15］。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中TNF-α、IL-6的水平升高，與既往研究報(bào)道結(jié)果相似，提示細(xì)胞損傷模型建立成功［16］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，蕨麻多糖能夠以劑量依賴性的方式降低LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中TNF-α、IL-6的水平，提示蕨麻多糖可減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥損傷。炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇可促使心肌細(xì)胞凋亡過(guò)度，細(xì)胞凋亡執(zhí)行因子主要為caspase3，當(dāng)線粒體損傷時(shí)可激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，caspase9活化后可促進(jìn)caspase3活化進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［17］。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白水平升高，而隨著蕨麻多糖濃度的增加，LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白水平降低，提示蕨麻多糖可抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)而減輕細(xì)胞損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-421的表達(dá)量升高，而蕨麻多糖可降低LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-421的表達(dá)量，且呈劑量依賴性。研究表明miR-421在腦缺血再灌注損傷中高表達(dá)，干擾其表達(dá)可通過(guò)抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡從而減輕腦缺血再灌注損傷［18］。circPAN3通過(guò)靶向抑制miR-421而減輕心肌缺血/再灌注損傷［19］。本研究結(jié)果顯示，干擾miR-421表達(dá)后LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中TNF-α、IL-6的水平和細(xì)胞凋亡率降低，而上調(diào)其表達(dá)可拮抗蕨麻多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡的抑制作用，提示蕨麻多糖可通過(guò)調(diào)控miR-421表達(dá)而減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

綜上所述，蕨麻多糖可抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡進(jìn)而減輕細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制與降低LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-421的表達(dá)量有關(guān)，miR-421可能作為蕨麻多糖治療膿毒癥所致心肌損傷的潛在靶點(diǎn)，蕨麻多糖對(duì)膿毒癥所致心肌損傷具有保護(hù)作用，并可為蕨麻多糖在心肌損傷的預(yù)防與治療中奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。