邊慶華 彭皇青 周月娟 印志進(jìn) （南昌市洪都中醫(yī)院，南昌 330000）

卵巢癌早期癥狀不明顯，患者確診時往往處于中晚期，且此時治療方式主要為化療，雖能一定程度提高患者五年生存率，但也存在顯著毒副作用，所以近年來，研究人員將關(guān)注重點放在了中草藥上［1-3］。研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花中的藏紅花素、藏紅花苦素等均有明顯抗癌作用，能夠抗白血病、卵巢癌、結(jié)腸癌等多種癌癥［4-6］。現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花素可以用于多種癌癥的治療，且臨床效果較好［7-8］。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）是細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程，ERK信號通路持續(xù)活躍參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［9］。所以本研究旨在觀察藏紅花水提取物對人卵巢癌細(xì)胞HO-8910增殖、凋亡、侵襲的影響，并初步探索其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人卵巢癌HO-8910細(xì)胞購自北京 BNCC。

1.1.2 試劑、儀器 大鼠抗小鼠ERK、Bax、Bcl-2抗體（無錫云萃生物科技公司）；DMEM培養(yǎng)基（深圳市百恩維生物科技公司）；胎牛血清（北京沃卡威生物技術(shù)有限公司）；MTT試劑盒（上海澤葉生物科技公司）；胰酶（江蘇采薇生物科技公司）；多功能酶標(biāo)儀（HBS-1101，北京華泰和合商貿(mào)有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（GC-300TL，上海沉匯儀器公司）；生物潔凈工作臺（BBS-H1100，濟南鑫貝西生物科技公司）；顯微鏡（CX33，山東高芯生物傳感器公司）；離心機（TG16G，鹽城凱特實驗儀器公司）；紫外可見分光光度計L9，上海儀電分析）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（SHJ-6A,常州金壇良友儀器公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取藏紅花水提取物 取75 g蒸餾水加熱至100 ℃，加入1.5 g藏紅花中，浸泡120 min，收集上清液；再加入75 g 100 ℃的蒸餾水，浸泡120 min，收集上清，將兩次收集的上清混合均勻后加熱，將濃度調(diào)整至187 g/L。pH值因素對藏紅花水提取物穩(wěn)定性的影響較大，強酸和強堿環(huán)境對其破壞性均較高，其初始pH值為6.2左右，在pH值為6的環(huán)境下較為穩(wěn)定，所以本實驗將藏紅花水提取物的pH值穩(wěn)定在6時進(jìn)行。實驗也是在各分組滲透壓穩(wěn)定的情況下進(jìn)行。

1.2.2 HO-8910細(xì)胞培養(yǎng) 取對數(shù)生長期細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)使用含10%FBS、100 U/ml 青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2，細(xì)胞傳代用0.25%胰蛋白酶。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖 將穩(wěn)定傳代的HO-8910細(xì)胞消化，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×104個/L，接種于96孔板內(nèi)，在每板每孔內(nèi)加入200 μl培養(yǎng)液。每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，分別加入藏紅花水提取物0 mg/L（對照組）、0.4 mg/L（低劑量組）、0.8 mg/L（中劑量組）、1.0 mg/L（高劑量組），作用24 h后，每孔加入5 mg/ml 200 μl MTT，靜置培養(yǎng)4 h后取出，1 000 r/min離心10 min，再將孔內(nèi)培養(yǎng)液小心吸

去，每孔內(nèi)加入200 μl DMSO，振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀OD 490 nm處檢測各孔吸光值（A）。計算各孔細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率（%）=（1-實驗組A值/對照組A值）×100%。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 將培養(yǎng)好的HO-8910細(xì)胞根據(jù)藏紅花提取物濃度標(biāo)記對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)，收集細(xì)胞懸液，控制恒溫4 ℃，此條件下添加適量PI染液和Annexin Ⅴ試劑，避光孵育20 min后，使用流式緩沖液洗滌后，檢測凋亡率。

1.2.5 劃痕實驗 收集HO-8910細(xì)胞并計數(shù)，接種于24孔板，濃度1×104個/孔。80%融合時，用塑料移液器槍頭比著直尺垂直沿同一方向刮傷，用PBS洗滌細(xì)胞3次，在37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后，在顯微鏡下拍攝結(jié)果照片，觀察傷口愈合情況。

1.2.6 細(xì)胞侵襲能力試驗 DMEM培養(yǎng)基配置基質(zhì)膠，加入24孔Transwell小室。分別使用0、0.4、0.8、1.0 mg/L濃度藏紅花水提取物作用于人卵巢癌HO-8910細(xì)胞16 h，Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力，顯微鏡下觀察細(xì)胞侵襲情況。

1.2.7 蛋白表達(dá)檢測 提取總蛋白，與上樣緩沖液按比例混合，煮沸5 min后，電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉1～2 h，加一抗溶液TBST（ERK、Bcl-2、Bax按照1∶1 000稀釋），4 ℃振蕩過夜，洗滌，加二抗溶液TBST（ERK、Bcl-2、Bax按照1∶5 000稀釋），室內(nèi)振蕩120 min，洗滌，顯色成像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)以±s記錄，統(tǒng)計分析用SPSS23.0軟件進(jìn)行，多組間比較采用F檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HO-8910的增殖活力 人卵巢癌細(xì)胞HO-8910的增殖活力受到藏紅花水提取物的影響，隨藏紅花水提取物劑量增加，人卵巢癌細(xì)胞HO-8910的增殖活力減弱，見表1。

表1 HO-8910的增殖活力（±s，n=6）Tab.1 Proliferation activity of HO-8910 （±s，n=6）

表1 HO-8910的增殖活力（±s，n=6）Tab.1 Proliferation activity of HO-8910 （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with low dose group， 2）P＜0.05； compared with the medium-dose group， 3）P＜0.05.

Proliferation activity/%69.85±6.98 44.56±4.591）36.38±2.691）2）22.89±0.381）2）3）121.363＜0.001 Groups Control Low dose Middle dose High dose Saffron extract concentration/（mg·L-1）0 0.4 0.8 1.0 F P

2.2 HO-8910的凋亡率 人卵巢癌細(xì)胞HO-8910的凋亡率受到藏紅花水提取物影響，隨藏紅花水提取物劑量增加，人卵巢癌細(xì)胞HO-8910的凋亡率增加，見表2、圖1。

圖1 HO-8910的凋亡情況Fig.1 Apoptosis of HO-8910

表2 HO-8910的凋亡率（±s，n=6）Tab.2 Apoptosis rate of HO-8910（±s，n=6）

表2 HO-8910的凋亡率（±s，n=6）Tab.2 Apoptosis rate of HO-8910（±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with low dose group， 2）P＜0.05； compared with medium dose group， 3）P＜0.05.

Apoptosis rate（%）8.69±0.81 12.94±0.961）24.28±1.031）2）35.62±1.111）2）3）911.453＜0.001 Groups Control Low dose Middle dose High dose Saffron extract concentration/（mg·L-1）0 0.4 0.8 1.0 F P

2.3 HO-8910的遷移情況 人卵巢癌細(xì)胞HO-8910的劃痕閉合率受到藏紅花水提取物影響，隨藏紅花水提取物劑量增加，人卵巢癌細(xì)胞HO-8910的劃痕閉合率下降，見表3、圖2。

圖2 HO-8910的遷移情況Fig.2 Migration of HO-8910

表3 HO-8910的遷移情況（±s，n=6）Tab.3 Migration status of HO-8910 （±s，n=6）

表3 HO-8910的遷移情況（±s，n=6）Tab.3 Migration status of HO-8910 （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with low dose group， 2）P＜0.05； compared with medium dose group， 3）P＜0.05.

Scratch closure rate/%99.69±0.21 75.25±6.961）50.28±4.031）2）33.69±2.031）2）3）291.026＜0.001 Groups Control Low dose Middle dose High dose Saffron extract concentration/（mg·L-1）0 0.4 0.8 1.0 F P

2.4 HO-8910的侵襲情況 人卵巢癌細(xì)胞HO-8910的侵襲細(xì)胞數(shù)受到藏紅花水提取物影響，隨藏紅花水提取物劑量增加，人卵巢癌細(xì)胞HO-8910的侵襲細(xì)胞數(shù)減少，見表4、圖3。

圖3 HO-8910的侵襲情況Fig.3 Invasion of HO-8910

表4 HO-8910的侵襲情況（±s，n=6）Tab.4 Ho-8910 invasion status （±s，n=6）

表4 HO-8910的侵襲情況（±s，n=6）Tab.4 Ho-8910 invasion status （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with low dose group， 2）P＜0.05； compared with medium dose group， 3）P＜0.05.

Number of invaded cells/%43.69±2.81 36.25±1.961）19.28±1.011）2）13.69±0.891）2）3）351.298＜0.001 Groups Control Low dose Middle dose High dose Saffron extract concentration/（mg·L-1）0 0.4 0.8 1.0 F P

2.5 HO-8910的ERK、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) ERK、Bcl-2蛋白的表達(dá)降低，Bax蛋白的表達(dá)增加，且藏紅花水提取物劑量越高，ERK、Bcl-2蛋白表達(dá)越低，Bax蛋白表達(dá)越高，見表5、圖4。

圖4 ERK、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)Fig.4 Protein expression of ERK， Bcl-2 and Bax

表5 HO-8910的ERK、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)（±s，n=6）Tab.5 Expression of ERK， Bcl-2 and Bax proteins in HO-8910 （±s，n=6）

表5 HO-8910的ERK、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)（±s，n=6）Tab.5 Expression of ERK， Bcl-2 and Bax proteins in HO-8910 （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with low dose group， 2）P＜0.05； compared with medium dose group， 3）P＜0.05.

Groups ERK Bcl-2 Bax 0.58±0.02 0.67±0.011）0.79±0.031）2）0.90±0.041）2）3）146.452 ＜0.001 Control Low dose Middle dose High dose Saffron extract concentration/（mg·L-1）0 0.4 0.8 1.0 F P 1.25±0.11 0.93±0.091）0.65±0.041）2）0.48±0.021）2）3）122.180＜0.001 0.79±0.06 0.61±0.041）0.49±0.021）2）0.31±0.011）2）3）192.591＜0.001

3 討論

近年來，卵巢癌的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，且卵巢位于盆腔內(nèi)，位置隱蔽，發(fā)病早期無特異性表現(xiàn)，缺少早期特異性診斷標(biāo)志物，較難診斷［10-11］。目前，卵巢癌的治療以手術(shù)切除、放化療為主，近年來，研究人員不斷探索新的治療方式，在此過程中，中藥憑借其靶點眾多，治療效果明顯，毒副作用小等優(yōu)點脫穎而出，得到眾多學(xué)者的關(guān)注。藏紅花是我國名貴的中藥材，有“植物黃金”的稱號［12-13］。藏紅花提取液是羥自由基與超氧自由基的強效清除劑，能夠明顯改善線粒體，抑制視網(wǎng)膜的凋亡，還具有提高免疫力、抗動脈硬化、抗氧化、保護腎臟等作用［14］。相關(guān)研究證實，藏紅花提取物具有光譜的抗腫瘤活性、對白血病、結(jié)腸癌等惡性腫瘤具有較強的抑制作用，對正常細(xì)胞影響較小，能夠與其他抗癌藥物聯(lián)合使用，減少抗癌物質(zhì)的毒副作用［15］。因此在本研究中，使用藏紅花水提取物研究其對人卵巢癌細(xì)胞HO-8910增殖、凋亡、侵襲的影響，以尋找其作用機制，為臨床上卵巢癌細(xì)胞的研究提供新的方向。

本研究觀察HO-8910細(xì)胞增殖活力發(fā)現(xiàn)，人卵巢癌細(xì)胞HO-8910的增殖活力隨藏紅花水提取物的劑量而改變，藏紅花水提取物的劑量越高，其對人卵巢癌細(xì)胞HO-8910的增殖抑制作用就越強，關(guān)于藏紅花抑制癌細(xì)胞增殖活力這一觀點，在李萍等［16］關(guān)于藏紅花素與宮頸癌的研究中也有提到。流式術(shù)表明，人卵巢癌細(xì)胞HO-8910的凋亡與藏紅花水提取物密切相關(guān)，藏紅花水提取物的劑量越高，人卵巢癌細(xì)胞HO-8910的凋亡率就越高，許存庚等［17］在文章中指出，藏紅花素聯(lián)合順鉑可抑制胃癌細(xì)胞BGC-823的增殖，促進(jìn)其凋亡，文中提到其作用機制可能與抑制ERK信號通路相關(guān)。細(xì)胞劃痕法證明，人卵巢癌細(xì)胞HO-8910的劃痕閉合率受到藏紅花水提取物影響，藏紅花水提取物的劑量越高，人卵巢癌細(xì)胞HO-8910的劃痕閉合率越低，這指示藏紅花水提取物可以有效抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移，并且藏紅花水提取物的劑量越高，其對癌細(xì)胞遷移的抑制作用越明顯。董盛宇等［18］在關(guān)于藏紅花素與人鼻咽癌細(xì)胞的研究中也證實，藏紅花素能夠有效抑制人鼻咽癌細(xì)胞株的遷移能力。另外，在本研究中采用Transwell法檢測藏紅花水提取物對人卵巢癌細(xì)胞HO-8910侵襲能力的影響，結(jié)果表明，藏紅花水提取物能茍有效抑制人卵巢癌細(xì)胞HO-8910的侵襲，并且其劑量越高，對癌細(xì)胞侵襲能力的抑制作用越明顯，李婷等［19］研究結(jié)果表明，hepaCAM過表達(dá)腺病毒聯(lián)合藏紅花素可顯著抑制PC3細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，作用機制或與EMT和 MMPs的表達(dá)有關(guān)。

文獻(xiàn)記載，藏紅花水提取物可以緩解使用順鉑、環(huán)磷酰胺等抗癌藥物后出現(xiàn)的毒副作用，由此推測，藏紅花提取物與其他抗癌藥聯(lián)合使用或許可減輕抗癌藥物帶來的毒副作用［20］。ERK處于細(xì)胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的末端位置，其能激活磷酸化，進(jìn)入到細(xì)胞核中，與AP-1、NF-κB等因子相結(jié)合，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。劉麗冰等［21］研究指出，CART肽提高OGD處理后星形膠質(zhì)細(xì)胞的活力，并通過激活ERK通路抑制OGD處理后細(xì)胞AQP-4的表達(dá)。Bcl-2、Bax是檢測凋亡的重要蛋白［22］。本實驗結(jié)果表明，隨藏紅花水提取物劑量升高，ERK蛋白表達(dá)量逐漸降低，這提示我們藏紅花水提取物可以抑制ERK的活性，由此推測藏紅花水提取物抑制腫瘤細(xì)胞生長可能與抑制ERK通路有關(guān)，且本研究還發(fā)現(xiàn)Bcl-2蛋白水平降低，Bax蛋白水平升高，表明藏紅花水提取物能夠提高凋亡蛋白的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這一點在徐婧等［23］、夏丹等［24］的文章中也有證實。

綜上所述，藏紅花水提取物抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖活力、遷移能力及侵襲能力，并誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，這可能是通過調(diào)控ERK、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)來實現(xiàn)的。