蔣剛健 胡 淼 胡東坡 （漯河市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，漯河 462000）

支氣管上皮細(xì)胞是維持機(jī)體內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)定的重要屏障，可防御微生物等病原菌感染，支氣管上皮細(xì)胞損傷與感染性疾病發(fā)生密切相關(guān)，而炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等是導(dǎo)致支氣管上皮細(xì)胞損傷的重要原因，如何減輕支氣管上皮細(xì)胞損傷已成為研究重點(diǎn)，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的重要組成，可誘發(fā)炎癥反應(yīng)，并可作為支氣管上皮細(xì)胞損傷體外研究的重要誘導(dǎo)因子［1-2］。支氣管上皮細(xì)胞損傷的機(jī)制尚未闡明。微小RNA（miRNA）在支氣管上皮細(xì)胞中表達(dá)異常，并參與 支氣管上皮細(xì)胞損傷過程［3-4］。支氣管哮喘患兒miR-98-5p表達(dá)降低，并參與支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展過程［5］。starbase預(yù)測顯示缺氧誘導(dǎo)因子1-α抑制劑（HIF1AN）可能是miR-98-5p的靶基因，在心肌缺血再灌注損傷中表達(dá)升高，抑制其表達(dá)可減輕心肌缺血再灌注損傷［6］。本研究主要探討miR-98-5p與HIF1AN對(duì)LPS誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞損傷的影響及可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人正常支氣管上皮細(xì)胞16-HBE購自美國ATCC細(xì)胞庫；LPS購自北京百奧萊博科技有限公司；TNF-α、IL-6、IL-1α檢測試劑盒購自上海嵐派生物科技有限公司；Lipofectamine2000購自北京宜科思源科技有限公司；Trizol試劑購自上海索寶生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR檢測試劑盒購自上海迪奧生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染法檢測試劑盒購自上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司；miR-98-5p mimics及其陰性對(duì)照miR-NC、 si-HIF1AN及其陰性對(duì)照si-NC、anti-miR-98-5p及其陰性對(duì)照anti-miR-NC購自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA3.1購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；兔抗人Cleaved-caspase-3抗體購自美國CST；兔抗人HIF1AN、BNIP3抗體購自美國Abcam；二抗購自武漢艾美捷。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 16-HBE細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板，加入含100 ng/ml LPS的培養(yǎng)液刺激24 h， 記為LPS組［7］。正常培養(yǎng)的細(xì)胞記為NC組。參照Lipofectamine2000試劑說明分別將miR-NC、miR-98-5p mimics、si-NC、si-HIF1AN、pcDNA-NC、pcDNAHIF1AN、miR-98-5p mimics與pcDNA-NC、miR-98-5p mimics與pcDNA-HIF1AN轉(zhuǎn)染至16-HBE細(xì)胞，加入含100 ng/ml LPS的培養(yǎng)液刺激24 h，分別記為miR-NC+LPS組、miR-98-5p+LPS組、si-NC+LPS組、si-HIF1AN+LPS組、pcDNA-NC+LPS組、pcDNA-HIF1AN+LPS組、miR-98-5p+pcDNA-NC+LPS組、miR-98-5p+pcDNA-HIF1AN+LPS組。

1.2.2 qRT-PCR檢測細(xì)胞miR-98-5p、HIF1AN mRNA表達(dá) 取各組16-HBE細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄過程嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，按照試劑盒說明書操作，7500Fast型熒光定量PCR儀檢測miR-98-5p、HIF1AN mRNA相對(duì)表達(dá)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取各組16-HBE細(xì)胞加入預(yù)冷PBS洗滌，棄上清，加入500 μl結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，按照凋亡試劑盒說明書檢測細(xì)胞 凋亡率。

1.2.4 ELISA檢測炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1α水平 取各組細(xì)胞上清，ELISA檢測炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1α水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-98-5p與HIF1AN的靶向關(guān)系 分別構(gòu)建野生型載體WTNek6與突變型載體MUT-Nek6，分別將miR-NC、miR-98-5p mimics與WT-HIF1AN、MUT-HIF1AN共轉(zhuǎn)染至16-HBE細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測細(xì)胞熒光素酶活性。分別將miR-NC、miR-98-5p mimics、antimiR-NC、anti-miR-98-5p轉(zhuǎn)染至16-HBE細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，Western blot檢測HIF1AN蛋白水平。

1.2.6 Western blot檢測HIF1AN、Cleaved-caspase-3、BNIP3蛋白表達(dá) 16-HBE細(xì)胞加入500 μl RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，分別加入兔抗人Cleaved-caspase-3、兔抗人HIF1AN、BNIP3一抗（1∶1 000） 4 ℃孵育24 h，加入二抗稀釋液（1∶5 000）室溫孵育1 h，滴加ECL，暗室內(nèi)曝光顯影，Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS對(duì)16-HBE細(xì)胞miR-98-5p和HIF1AN表達(dá)的影響 與NC組比較，LPS組miR-98-5p表達(dá)降低（P＜0.05），HIF1AN mRNA及蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見圖1。

圖1 LPS對(duì)人正常支氣管上皮細(xì)胞16-HBE miR-98-5p 和HIF1AN表達(dá)的影響Fig.1 Effect of LPS on expressions of miR-98-5p and HIF1AN in human normal bronchial epithelial cells 16-HBE

2.2 過表達(dá)miR-98-5p對(duì)LPS誘導(dǎo)的16-HBE細(xì)胞凋亡和炎癥因子的影響 與NC組比較，LPS組細(xì)胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)及TNF-α、IL-6、IL-1α水平升高（P＜0.05）；與LPS組比較，miR-98-5p+LPS組凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)及TNF-α、IL-6、IL-1α水平降低（P＜0.05），見圖2。

圖2 過表達(dá)miR-98-5p對(duì)LPS誘導(dǎo)的16-HBE細(xì)胞凋亡 和炎癥因子的影響Fig.2 Effects of overexpression of miR-98-5p on apoptosis and inflammatory factors in LPS-induced 16-HBE cells

2.3 低表達(dá)HIF1AN對(duì)LPS誘導(dǎo)的16-HBE細(xì)胞凋亡和炎癥因子的影響 與si-NC+LPS組比較，si-HIF1AN+LPS組細(xì)胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)及TNF-α、IL-6、IL-1α水平降低（P＜0.05），見圖3。

2.4 miR-98-5p靶向HIF1AN starbase預(yù)測顯示，miR-98-5p與HIF1AN存在結(jié)合位點(diǎn)（圖4A）。miR-98-5p過表達(dá)可降低野生型載體WT-HIF1AN熒光素酶活性（P＜0.05）；miR-98-5p可負(fù)調(diào)控HIF1AN表達(dá)（P＜0.05，圖4B、C）。

圖4 miR-98-5p靶向調(diào)控HIF1AN表達(dá)Fig.4 miR-98-5p targeting regulates HIF1AN expression

2.5 過表達(dá)HIF1AN可逆轉(zhuǎn)miR-98-5p對(duì)LPS誘導(dǎo)的16-HBE細(xì)胞凋亡和炎癥因子的影響 與pcDNANC+LPS組比較，pcDNA-HIF1AN+LPS組細(xì)胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)及TNF-α、IL-6、IL-1α水平升高（P＜0.05）；與miR-98-5p+pcDNA-NC+LPS組比較，miR-98-5p+pcDNA-HIF1AN+LPS組細(xì)胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)及TNF-α、IL-6、IL-1α水平升高（P＜0.05），見圖5。

圖5 過表達(dá)HIF1AN可逆轉(zhuǎn)miR-98-5p對(duì)LPS誘導(dǎo)的 16-HBE細(xì)胞凋亡和炎癥因子的影響Fig.5 Overexpression of HIF1AN reverses effects of miR-98-5p on LPS-induced 16-HBE cells apoptosis and inflammatory factors

2.6 HIF-1α/BNIP3信號(hào)通路蛋白表達(dá) 與NC組比較，LPS組BNIP3蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與miRNC+LPS組比較，miR-98-5p+LPS組BNIP3蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與miR-98-5p+pcDNA-NC+LPS組比較，miR-98-5p+pcDNA-HIF1AN+LPS組BNIP3蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見圖6。

圖6 BNIP3蛋白表達(dá)Fig.6 BNIP3 protein expression

3 討論

miRNA在支氣管細(xì)胞損傷中表達(dá)異常并參與細(xì)胞損傷過程，如miR-Let-7f-1-3p通過靶向FOXO1抑制煙氣誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞凋亡［8］；miR-34a表達(dá)上調(diào)抑制支氣管上皮細(xì)胞凋亡［9］；miR-216a-5p通過靶向HMGB1/NF-κB途徑保護(hù)支氣管上皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷［10］。表明miRNA可能成為減輕支氣管上皮細(xì)胞損傷的作用靶點(diǎn)。

miR-98-5p在兒童支氣管哮喘中呈低表達(dá)，并可能作為篩查兒童支氣管哮喘的生物標(biāo)志物［11］。miR-98-5p通過靶向Hmga2減輕糖尿病腎病上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腎纖維化［12］。miR-98-5p通過抑制Bach1減輕氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷［13］。但miR-98-5p與支氣管上皮細(xì)胞損傷的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。本研究顯示，LPS誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞中miR-98-5p表達(dá)降低，提示miR-98-5p在支氣管上皮細(xì)胞損傷中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究顯示，LPS可提高支氣管上皮細(xì)胞凋亡率及Cleavedcaspase-3表達(dá)，與既往研究結(jié)果相似［14］，提示細(xì)胞損傷模型構(gòu)建成功。本研究進(jìn)一步分析顯示，miR-98-5p過表達(dá)可降低細(xì)胞凋亡率及Cleaved-caspase-3 表達(dá)。炎癥反應(yīng)加重可引起細(xì)胞凋亡，本研究深入分析顯示，LPS可提高炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1α水平，而miR-98-5p過表達(dá)可明顯降低TNF-α、IL-6、 IL-1α水平，提示miR-98-5p過表達(dá)可能通過抑制炎癥反應(yīng)抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕細(xì)胞損傷。

本研究證實(shí)HIF1AN是miR-98-5p的靶基因。下調(diào)HIF1AN表達(dá)可減輕心肌缺血損傷發(fā)揮心臟保護(hù)作用［15］。miR-1-3p通過與HIF1AN作用增強(qiáng)MC3T3-E1細(xì)胞成骨細(xì)胞分化［16］。miR-214可能通過靶向HIF1AN減輕心肌缺血再灌注損傷［17］。但HIF1AN在支氣管上皮細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制尚未可知。本研究顯示，LPS可提高支氣管上皮細(xì)胞HIF1AN與BNIP3表達(dá)，進(jìn)一步分析顯示HIF1AN過表達(dá)可明顯拮抗miR-98-5p過表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞凋亡及炎癥的抑制作用。

綜上，miR-98-5p可通過抑制HIF1AN表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)，減輕支氣管上皮細(xì)胞損傷，為進(jìn)一步闡釋支氣管上皮細(xì)胞損傷的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。但miR-98-5p是否可通過靶向調(diào)控其他靶基因發(fā)揮作用及其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。