宋志明 錢孝賢 余舒杰 （河南大學第一附屬醫(yī)院，開封 475001）

衰老是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展并最終導致心血管疾病的重要危險因素［1］。而與增齡相關的血管內皮細胞改變在心血管疾病中具有重要作用，且在動脈粥樣斑塊中可檢測到衰老的血管內皮細胞，提示內皮衰老與心血管疾病病理生理過程關系密切［2］。

硫化氫是人體內發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信號分子，在維持心血管系統(tǒng)功能中發(fā)揮重要作用。體外研究證實硫化氫能夠改善內皮細胞衰老［3］。本研究擬進一步在體內探討硫化氫對自然衰老小鼠內皮的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 雌性C57BL/6小鼠購自中山大學實驗動物中心，飼養(yǎng)于中山大學北校區(qū)動物實驗中心；NaHS購自Sigma-Aldrich；RNA提取Iso Plus試劑購自寶生物工程（大連）有限公司；Revert-Aid逆轉錄試劑盒、DyNAmo ColorFlash SYBR GREEN qPCR Kit購自美國Thermo公司；引物由美國Life Technologies公司設計合成；甲醛、戊二醛、氯化鎂、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀為分析純，氯化鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉為優(yōu)級純，購自廣州化學試劑廠；X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）購自碧云天生物技術研究所；NO檢測試劑盒、分型SOD活性及MDA檢測試劑盒購自南京建成生物公司；ICAM-1 ELISA試劑盒購自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 24只雌性C57BL/6小鼠隨機分為3組：對照組（control，3月齡，8只，每天腹腔注射無菌PBS）、模型組（model，22月齡，8只，每天腹腔注射無菌PBS）、實驗組（experimental，22月齡，8只，每天腹腔注射50 μmol/kg NaHS），腹腔注射時乙醇棉球消毒注射區(qū)域皮膚，持續(xù)6周。

1.2.2 標本采集 小鼠處理6周后繼續(xù)飼養(yǎng)3 d，處死并收取標本。共有5只老年小鼠在標本采集前死亡，其中模型組死亡3只，實驗組死亡2只。所有小鼠給予10%水合氯醛（600 mg/kg）進行麻醉，參考文獻［4］收集血清，剝離小鼠主動脈血管，保存。

1.2.3 qRT-PCR 實驗操作參考文獻［4］進行。引物序列為PAI-1 F：5'-TTCAGCCCTTGCTTGCCTC-3'，R：5'-ACACTTTTACTCCGAAGTCGGT-3'；ICAM-1 F：5'-GTGATGCTCAGGTATCCATCCA-3'，R：5'-CACAGTTCTCAAAGCACAGCG-3'；eNOS F：5'-GGCTGGGTTTAGGGCTGTG-3'，R：5'-CTGAGGGTGTCGTAGGTGATG-3'；β-actin F：5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3'，R：5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'。

1.2.4 ELISA ELISA檢測各組小鼠血清ICAM-1含量，操作均嚴格參考試劑說明書進行。

1.2.5 血清SOD及MDA測定 黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，硫代巴比妥比色法（TBA）測定MDA水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.6 NO含量測定 采用試劑盒測定小鼠血清NO含量，操作嚴格按照說明書進行。

1.2.7 衰老染色

1.2.7.1 染色工作液配制 將X-gal溶于二甲基亞酰，配制成20 mg/ml儲存液。配制40 mmol/L檸檬酸/磷酸氫二鈉（pH=6.0）、150 mmol/L氯化鈉、 2 mmol/L氯化鎂、5 mmol/L鐵氰化鉀、5 mmol/L亞鐵氰化鉀、1 mg/ml X-gal。

1.2.7.2 切片 將剝離的血管迅速保存于液氮，包埋于OCT液，-80 ℃固定，采用Leica CM1850進行切片（4 μm），收取于防脫玻片。

1.2.7.3 染色 預冷2%甲醛/0.2%戊二醛室溫固定5 min，棄固定液，每個切片加入1 ml預冷PBS，搖床緩慢清洗3 min，共3次，加入新鮮配制的染色工作液，1 ml/片，37 ℃、無CO2條件下遮光孵育過夜， 倒置顯微鏡下觀察（×10），拍照，藍色部分即為衰老組織。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計分析，定量資料用±s表示。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行組間兩兩比較，若方差齊，采用LSD檢驗；若方差不齊，采用K-W檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠體質量比較 NaHS干預前，3組小鼠體質量未見明顯差異。處理結束后，對照組和實驗組小鼠與處理前無明顯差異，而模型組小鼠體質量較處理前顯著降低（P＜0.01），同時，實驗組小鼠體質量較模型組明顯增加（P＜0.05，圖1）。

圖1 NaHS對小鼠體質量的影響Fig.1 Effect of NaHS on body weight of mice

2.2 小鼠主動脈內皮衰老情況 qRT-PCR結果顯示，模型組PAI-1 mRNA水平明顯高于對照組，實驗組PAI-1 mRNA水平低于模型組（P＜0.05，圖2A）。主動脈內皮衰老染色結果顯示，模型組內皮衰老程度較對照組明顯加重，而實驗組內皮衰老程度則較模型組顯著減輕（P＜0.05，圖2B）。

圖2 NaHS對小鼠主動脈內皮衰老的影響Fig.2 Effect of NaHS on aortic senescence in mice

2.3 小鼠主動脈組織ICAM-1 mRNA表達及血清ICAM-1含量比較 qRT-PCR結果顯示，與對照組相比，模型組主動脈血管ICAM-1 mRNA表達明顯升高，而實驗組ICAM-1 mRNA表達顯著減少（P＜0.05，圖3）。ELISA結果顯示，與對照組相比，模型組小鼠血清ICAM-1含量明顯升高，而實驗組能一定程度減少ICAM-1含量（P＜0.05，圖3）。

圖3 NaHS對小鼠主動脈組織ICAM-1 mRNA及血清ICAM-1的影響Fig.3 Effect of NaHS on aortic ICAM-1 mRNA and serum ICAM-1 in mice

2.4 小鼠血清SOD1及MDA含量比較 與對照組相比，模型組小鼠血清SOD1活性較對照組減弱，MDA含量升高。與模型組相比，實驗組小鼠體內SOD1活性升高，MDA含量減少（P＜0.05，圖4）。

圖4 NaHS對小鼠血清SOD1活性及MDA含量的影響Fig.4 Effect of NaHS on serum SOD1 activity and MDA concentration in mice

2.5 小鼠主動脈組織eNOS mRNA表達及血清NO含量比較 與對照組相比，模型組小鼠主動脈血管eNOS mRNA表達減少，血清NO含量降低，而實驗組eNOS mRNA合成增加，血清NO含量提高（P＜0.05，圖5）。

圖5 NaHS對主動脈組織eNOS mRNA及血清NO含量的影響Fig.5 Effects of NaHS on aortic eNOS mRNA and serum NO concentration

3 討論

研究證實，主動脈內皮衰老相關機制包括NO濃度降低、促炎細胞因子刺激及氧化應激損傷等［5］。雖然血管內皮衰老機制已有一定研究，但目前仍未發(fā)現(xiàn)有效治療方法。

硫化氫是人體內源性氣體分子，在心血管系統(tǒng)中主要由胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-r-lyase， CSE）催化產(chǎn)生。硫化氫在體外實驗中被證實具有抗炎和抗氧化應激作用［6］。本課題組既往研究已證實硫化氫分別通過調節(jié)Sirt1/eNOS和Akt活性，增加NO合成改善高糖誘導的內皮細胞衰老［3，7］。硫化氫的生物學作用存在雙向量效關系，即高劑量有害，低劑量發(fā)揮保護作用。正常哺乳動物組織和血漿中硫化氫濃度可達到1～160 μmol/L，且僅有1/3以氣體形式存在，而NaHS是常用的硫化氫供體［8］。既往研究中，硫氫化鈉腹腔注射小鼠的最常用劑量為 50 μmol/kg［9-10］。結合既往研究及本研究預實驗， 50 μmol/kg NaHS屬于小鼠生理范圍劑量，因此選用該劑量進行實驗。

主動脈內皮組織PAI-1表達及SA-β-Gal染色是論證血管衰老程度的重要指標［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，衰老小鼠主動脈組織PAI-1 mRNA表達和SA-β-Gal染色陽性率均較年輕對照小鼠明顯升高，而NaHS干預能夠一定程度改善上述指標，證實NaHS能夠改善老年小鼠血管衰老。

老年人群體內存在持續(xù)低水平的炎癥反應，炎癥標志物如IL-1、ICAM-1和MCP-1也隨著年齡增長而不斷增加［12］。本研究同樣證實老年小鼠體內炎癥反應較年輕小鼠明顯升高。增齡相關炎癥反應增加與機體免疫系統(tǒng)功能下降及體內氧化還原狀態(tài)改變密切相關。

生理條件下，體內自由基產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡。但隨著年齡增長，氧化損傷逐漸加重［13］。老齡化動物和人群中，氧自由基和脂質代謝產(chǎn)物MDA均明顯增加，同時抗氧化系統(tǒng)SOD等酶活性隨著年齡增長而減弱［14］。本研究提示老年小鼠體內SOD1活性減弱，MDA含量增加。

NO廣泛存在于心血管系統(tǒng)，具有調節(jié)內皮功能的作用，其產(chǎn)生主要受eNOS調控［15］。衰老內皮組織（細胞）表型變化中兩者均明顯降低，通過兩者檢測既能顯示內皮功能情況，又能間接證實內皮組織（細胞）衰老狀態(tài)［11］。與年輕人相比，老年人體內eNOS活性明顯減弱［16］。體外細胞衰老模型中，eNOS活性降低，NO合成減少［3］。本研究中，老年小鼠主動脈組織eNOS mRNA水平及血清NO含量均較年輕小鼠明顯降低，與既往報道一致。

老年人體重呈下降趨勢，可能與肌少癥相關［17］。線粒體突變等誘導的小鼠衰老模型中，體質量減輕是主要衰老相關表型之一［18］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)老年小鼠經(jīng)過6周飼養(yǎng)，體質量下降具有統(tǒng)計學意義。

綜上，本研究證實硫化氫能夠降低老年小鼠體內炎癥水平，減輕氧化應激，增加NO合成，改善衰老小鼠體質量減輕，進而發(fā)揮主動脈內皮保護作用。