金 銘, 蔣燦燦

(安徽理工大學(xué)第一附屬醫(yī)院/安徽省淮南市第一人民醫(yī)院 消化內(nèi)科, 安徽 淮南, 232007)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是臨床常見的炎癥性腸道疾病，患者臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便及腹部包塊等[1]。腸道微生物可參與營養(yǎng)物質(zhì)代謝，形成生物屏障，進(jìn)而改善腸道微生態(tài)環(huán)境，但是UC中存在嚴(yán)重的腸道菌群失調(diào)[2]。腸道菌群大腸桿菌(Escherichia)在UC疾病中數(shù)量升高，導(dǎo)致共棲菌“變節(jié)”，參與代謝功能的糖苷酶等表達(dá)下降，而毒力和侵襲力增加，參與誘導(dǎo)UC的發(fā)病[3]。UC動物模型[4]證實,Escherichia豐度升高，可直接損傷黏液屏障，增加腸道滲透性，加快腸道組織損傷。

UC損傷機制是宿主黏膜對腸道細(xì)菌的過度反應(yīng)[5]。腸道黏液屏障是機體針對環(huán)境、生理和免疫刺激的第一道動態(tài)的屏障，可防止微粒、毒素、病原體和共生菌與上皮細(xì)胞直接接觸。黏蛋白是黏液主要成分，黏蛋白聚糖成分在維持黏液屏障功能中起重要作用。在慢性感染期間，成熟黏蛋白糖基化的數(shù)量減少，這可能是由于合成過程干擾和糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的變化造成。目前，研究多關(guān)注于病原菌損傷黏液屏障通過抑制MUC2核心蛋白合成或促其降解完成，啟動UC發(fā)病[6-7]。但結(jié)腸黏蛋白的聚糖特征性變化對UC是否有早期診斷價值及可能參與發(fā)病的機制尚不清楚。本研究嘗試建立人結(jié)腸黏液蛋白的O-聚糖的檢測方法，并探索其參與UC發(fā)生的機制，以期為UC的早期診斷提供可靠的生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2021年1月—2022年1月安徽省淮南市第一人民醫(yī)院消化科、胃腸外科收治的75例UC患者作為研究組，選取同期體檢者75例作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn): 經(jīng)腸鏡或手術(shù)治療進(jìn)行組織病理學(xué)確診為UC者; 符合《2018年中國炎癥性腸病診斷與治療的共識意見》診斷標(biāo)準(zhǔn)者; 腸鏡下取活組織標(biāo)本者。排除標(biāo)準(zhǔn): 未經(jīng)組織病理學(xué)確診或不符合診斷標(biāo)準(zhǔn)者; 其他原因?qū)е碌酿さ鞍譓UC2的糖基單一化者; 合并嚴(yán)重心肺、腎臟功能不全者; 合并嚴(yán)重感染、血液感染、免疫疾病及惡性腫瘤者; 妊娠期及哺乳期女性; 精神疾病或智力障礙者。通過Mayo評分系統(tǒng)對75例UC患者進(jìn)行劃分，輕度(3～5分)為27例，中度(6～10分)為26例，重度(11～12分)為22例。研究對象均了解本研究內(nèi)容，并簽署知情同意書。本研究符合本院倫理標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器

Escherichiacoli G1059購自上海保藏生物技術(shù)中心; 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)板購自上海臻科生物科技; LB液體培養(yǎng)基購自上海博湖生物科技有限公司; MUC2的多聚糖、單糖購自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司; 磷酸鹽緩沖液購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司; 慶大霉素購自西南藥業(yè)股份有限公司; TritonX-100購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司; 抗MUC2多克隆抗體，熒光定量PCR儀購自Bio-Rad公司。

1.3 免疫組化檢測組織中MUC2陽性表達(dá)

將正常組織及UC病理組織剪切成小塊，脫水、包埋后，采用甲醛固定，水化及 37.5 ℃靜置0.5 h后，加入1%的EDTA, 山羊血清封閉。加入1抗(1∶500), 加入兔抗人RECK、DLL4抗體，加入二抗0.5 h后，復(fù)染，封皮。選擇不交叉的10個視野，以淡黃色至棕褐色為陽性。染色成功后，所有切片均在同一條件下進(jìn)行光學(xué)顯微鏡檢查。采用Image-proplus 6.0圖像分析軟件，分析測定積分吸光度(A)值，以其平均值代表蛋白表達(dá)水平。

1.4 檢測C反應(yīng)蛋白(CRP)、糞便鈣衛(wèi)蛋白(FC)、降鈣素原(PCT)

CRP: 采集研究對象靜脈血3 mL, 3 000轉(zhuǎn)/min離心15 min, 保留上清液，采用ELISA試劑盒檢測血清中CRP表達(dá)。FCP: 留取研究對象5～10 g糞便, -20 ℃保存。解凍，接種環(huán)接種，挑取50 mg糞便樣品，放入離心管中3 000×g離心5 min, 保留1 mL上清液，ELISA法檢測，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。PCT: 取2 mL靜脈血，采用全自動生化分析儀檢測其表達(dá)。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

HT-29細(xì)胞以10%的胎牛血清接種于培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時分離細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，接種于培養(yǎng)瓶中，加入含有1%雙抗的10%胎牛血清中培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長至80%～90%時，進(jìn)行傳代, 75%乙醇消毒，棄去舊的培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，加入0.25%胰蛋白酶消化，生長至90%時，終止消化反應(yīng)，脫壁后，以3 500轉(zhuǎn)/min(離心半徑12 cm)離心5 min, 棄去上清液放入培養(yǎng)基中, 2～3 d傳代。

1.6 Escherichia處理

HT-29細(xì)胞使其適應(yīng)無血清培養(yǎng)基，再在每個培養(yǎng)孔中分別加入Escherichia106cfu/0.1 mL PBS, 37 ℃ 共孵育2 h。將得到的細(xì)胞分為A組(細(xì)胞+MUC2的多聚糖)、B組(細(xì)胞+單糖)、C組(細(xì)胞+磷酸鹽緩沖液)。在ELISA板中，每孔加入pH值為7的LB液體培養(yǎng)基170 μL, 10 μLEscherichia懸液(1×108cfu/mL), 分別加入0.01%的MUC2的多聚糖、0.01%的單糖及磷酸鹽緩沖液進(jìn)行培養(yǎng)，均設(shè)置3個復(fù)孔。

1.7 3組生物膜形態(tài)觀察

將3組細(xì)胞培養(yǎng)10 h, 分別置于倒置熒光顯微鏡(Ti-E 2000, Nikon, Germany)和激光共聚焦顯微鏡(CLSM, TCS SP5 Ⅱ, Leica Co.,Germany)下，觀察Escherichia生物膜的發(fā)育狀況。

1.8 黏附力及侵襲能力

黏附實驗: 處理后的細(xì)胞采用新鮮完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，加入0.5%的Triton X-100 200 μL/孔孵育10 min, 倍比稀釋后涂布含利福平的LB瓊脂平板, 24 h后計數(shù)菌落數(shù)。侵襲實驗: 細(xì)胞加入新鮮完全培養(yǎng)液(含100 μg/mL慶大霉素)孵育1 h。0.5% TritonX-100 200 μL/孔孵育10 min, 倍比稀釋后涂布含利福平瓊脂平板, 24 h后計數(shù)菌落數(shù)。

1.9 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測各組Escherichia毒力基因LasR、pvdA、pcrV的水平及代謝功能GUS基因的水平

根據(jù)參考文獻(xiàn)，合成LasR、pvdA及pcrV引物序列。LasR序列為F: 5′-CGCGGATCCATGGCCTTGGTTGACGGTTTTCTTG-3′, R: 5′-CCGGAATTCGAGAGTAATAAGACCCAAATTACGGC-3′;PCdA序列為F: 5′-GACTGAATAACGGGGTGAGCGCAGGCCGGA-3′, R: 5′-GTCGACGGCCGCTGATCAACAGATCTAC-3′;pcrV序列為F: 5′-GGCCTGGCGTGCGGCGGCCGGAGTGGCTG-3′, R: 5′-TG

CCGGCTTAATGAAGGACGTCCTGCAGCT-3′;GUS序列為F: 5′-GGTGGACCTTGAGGAAACT-3′, R: 5′-GTTGTGTGTTGAATTTGAAA-3′。PCR反應(yīng)體系(20 μL): 混合酶10 μL, 上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL, 菌液模板2 μL, ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)條件: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 20 s, 58 ℃ 20 s, 72 ℃ 45 s, 共35次循環(huán); 72 ℃ 5 min。取10 μL PCR擴增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 正常黏膜組織及UC組織中MUC2蛋白表達(dá)

正常黏膜組織及UC組織中MUC2蛋白表達(dá)水平分別為(0.71±0.05)、(0.56±0.08), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.770,P<0.001)。在結(jié)腸組織中MUC2主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，在UC組織中MUC2陽性表達(dá)顯著低于正常黏膜組織，見圖1。

圖1 免疫組化檢測正常黏膜組織及UC組織中MUC2陽性表達(dá)(放大200倍)

2.2 不同疾病程度的UC組織中MUC2蛋白水平比較

輕度UC患者組織中MUC2蛋白水平為(0.63±0.10), 中度UC患者組織中為(0.55±0.09), 重度UC患者組織中為(0.50±0.05), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.880,P<0.001)。與輕度患者比較，中度患者組織中MUC2蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與中度相比，重度患者M(jìn)UC2蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖2。

與輕度患者比較, *P<0.05; 與中度患者比較, #P<0.05。圖2 不同疾病程度的UC組織中MUC2蛋白水平比較

2.3 對照組及研究組患者CRP、FC、PCT水平比較

與對照組相比，研究組患者CRP、FC、PCT水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見表1。

表1 對照組及研究組患者CRP、FC、PCT水平比較

2.4 不同疾病程度UC患者的CRP、FC、PCT水平比較

與輕度患者相比，中度患者CRP、FC、PCT水平升高; 與中度患者相比，重度患者CRP、FC、PCT水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見表2。

表2 不同疾病程度UC患者的CRP、FC、PCT水平比較

2.5 MUC2與CRP、FC、PCT水平的相關(guān)性

在UC疾病中, MUC2與CRP、FC、PCT水平均呈負(fù)相關(guān), MUC2與CRP相關(guān)系數(shù)(r=-0.336,P=0.008)、MUC2與FC相關(guān)系數(shù)(r=-0.410,P=0.001)、MUC2與PCT相關(guān)系數(shù)(r=-0.377,P=0.003)見圖3。

圖3 MUC2與CRP、FC、PCT水平關(guān)系分析

2.6 Escherichia生物膜形態(tài)觀察

觀察3組Escherichia生物膜形態(tài), A組Escherichia的熒光強度顯著低于B組、C組，熒光聚集度也減弱，說明了在MUC2在作用下生物膜形成受到了抑制，見圖4。

圖4 各組腸道桿菌生物膜形態(tài)觀察(放大200倍)

2.7 Escherichia的黏附力及侵襲能力比較

A組、B組、C組Escherichia黏附率分別為(15.30±2.55)%、(63.25±8.08)%及(48.61±6.67)%, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=93.480,P<0.001)。 A組、B組、C組Escherichia侵襲率分別為(24.80±5.11)%、(70.21±10.60)%及(53.34±8.06)%, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=46.620,P<0.001)。與A組相比, B組Escherichia黏附率及侵襲率均升高，與B組相比, C組Escherichia黏附率及侵襲率均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖5、圖6。

與A組比較, *P<0.05; 與B組比較, #P<0.05。圖5 各組Escherichia黏附率比較

與A組比較, *P<0.05; 與B組比較, #P<0.05。圖6 各組Escherichia侵襲率比較

2.8 各組LasR、pvdA、pcrV及GUS基因水平比較

與A組相比, B組LasR、pvdA、pcrV及GUS基因水平升高，與B組相比, C組LasR、pvdA、pcrV及GUS基因水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見表3。

表3 各組Escherichia中LasR、pvdA、pcrV及GUS基因水平比較

3 討 論

UC是發(fā)病原因不明的慢性結(jié)腸及直腸病變，病變位置為結(jié)腸黏膜層，可累及整個結(jié)腸[8]。UC發(fā)病機制復(fù)雜，涉及免疫、感染、飲食及遺傳等因素。近些年對細(xì)胞因子及黏度因子的研究，正在逐步揭曉UC的發(fā)病機制，并認(rèn)為能夠為開發(fā)新的治療途徑提供依據(jù)。

黏液基因蛋白是黏液凝膠的主要組成成分，廣泛存在于消化道上皮細(xì)胞中。目前，有研究[9]證實MUC表達(dá)水平與消化道疾病的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性。MUC2是MUC蛋白家族成員之一，認(rèn)為其具有結(jié)腸黏膜保護(hù)作用，在UC患者中表達(dá)顯著低于健康人群，說明其表達(dá)缺失是UC發(fā)病的主要因素[10]。本研究結(jié)果顯示，在UC組織中MUC2表達(dá)顯著低于正常黏膜組織，在不同疾病程度UC組織中MUC2隨著疾病程度的加重而降低。HANSKI C等[11]在UC組織中，采用SMUC41探針原為雜交方法檢測MUC2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MUC2是杯狀細(xì)胞特異性產(chǎn)物，和疾病狀態(tài)無關(guān)聯(lián)性。但也存在與之相反的結(jié)論，在靜止期UC、活動期UC中檢測MUC2表達(dá)，活動期患者組織中MUC2活性降低3倍左右，同時其蛋白含量顯著降低，認(rèn)為其在UC結(jié)腸黏膜組織中無法發(fā)揮結(jié)腸黏膜保護(hù)作用，進(jìn)而加快疾病進(jìn)程[12]。張永萍等[13]研究表明，在UC患者的腸道上皮組織中MUC2表達(dá)降低，認(rèn)為其缺失可加快腸上皮細(xì)胞異常及潰瘍，導(dǎo)致結(jié)腸炎癥反應(yīng)，并通過恢復(fù)期水平改善黏液層形態(tài)，進(jìn)而改善腸道炎癥癥狀。

本研究結(jié)果顯示，在UC組織中CRP、FC、PCT表達(dá)水平顯著高于正常黏膜組織，并隨著UC疾病嚴(yán)重程度加重而升高，提示其表達(dá)升高而加快疾病進(jìn)程。CRP是機體炎癥損傷時分泌的急性蛋白，其反應(yīng)迅速，在UC發(fā)病2 d時可顯著升高，因此對于UC疾病的診斷具有較好靈敏度[14]。FC是中心粒細(xì)胞胞質(zhì)蛋白庫的重要組成部分，在多種感染性、炎性及惡性疾病中的血液、細(xì)胞或組織中呈高表達(dá)，與炎癥反應(yīng)呈正相關(guān)性[15]。FC在UC組織呈高表達(dá)，在UC活動期中FU表達(dá)水平顯著高于緩解期，隨著疾病程度的變化而改變。研究[16]證明, UC發(fā)生發(fā)展與腸腔內(nèi)細(xì)胞感染相關(guān), PCT是由菌毒素及炎性細(xì)胞因子共同刺激產(chǎn)生，可作為感染性疾病常見標(biāo)志物。PCT在UC患者外周血中表達(dá)升高，并隨著疾病的加重而升高，可作為UC疾病診斷的標(biāo)志物之一。本研究結(jié)果顯示，在UC疾病中, MUC2表達(dá)與CRP、FC、PCT均表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)性, MUC2表達(dá)缺失加重結(jié)腸炎癥反應(yīng)，而CRP、FC、PCT均為炎癥反應(yīng)相關(guān)因子，三者表達(dá)隨著MUC2表達(dá)降低而升高，而促進(jìn)疾病進(jìn)展。

Escherichia是引起新生兒腦膜炎、敗血癥的等疾病常見的細(xì)胞，黏附及侵襲作用時，其與宿主細(xì)胞HT29細(xì)胞發(fā)揮關(guān)鍵作用，其致病性只有穿過腸道屏障才可引起感染。既往研究[17]中,Escherichia可加快HT29細(xì)胞黏附及侵襲，并通過黏蛋白MUC2的糖基單一化加快黏度及侵襲能力。相關(guān)研究[18]表明，部分糖鏈可以成為微生物定植的位點，成為細(xì)胞與環(huán)境相互交通的平臺，并認(rèn)為O型-糖鏈缺失可導(dǎo)致腸道炎癥發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，B組細(xì)胞黏附及侵襲能力最強，說明MUC2被抑制后可通過合成一些酶類，其中含有O-型糖鏈，可導(dǎo)致其酶類活性降低，而無法發(fā)揮腸黏膜保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示, B組細(xì)胞中Escherichia所導(dǎo)致的毒性作用最強，主要表現(xiàn)為相關(guān)毒性基因LasR、pvdA及pcrV表達(dá)升高，同時GUS基因水平表達(dá)降低。LasR、pvdA及pcrV均為Escherichia生物膜相關(guān)毒力基因，其表達(dá)升高可加快Escherichia對宿主細(xì)胞的侵襲及黏附作用，進(jìn)一步定植于器官表層，提高炎癥反應(yīng)促進(jìn)UC疾病進(jìn)程。GUS基因是從Escherichia中克隆出的，其可調(diào)節(jié)植物甚至動物基因的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，在B組中GUS基因表達(dá)水平最高，說明MUC2的糖基單一化可增加Escherichia的GUS基因水平[19]。提示MUC2降低可增加細(xì)胞內(nèi)Escherichia數(shù)量，增強其毒力作用，故本研究推測通過MUC2的糖基單一化可提高LasR、pvdA及pcrV、GUS基因水平，進(jìn)而加快Escherichia的侵襲力，但是其具體機制還需要進(jìn)一步證實。

綜上所述, UC組織中MUC2表達(dá)降低，并隨著疾病程度的加重而降低，與CRP、FC、PCT表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。Escherichia與MUC2的糖基單一化培養(yǎng)后，可增加其侵襲及黏附能力，提高其毒性作用。