褚翔鵬，萬人安，王鵬，韓浩，陳小波

[1.日照市人民醫(yī)院 胸外科，山東日照 276800；2.云南省腫瘤醫(yī)院（昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院） 胸外一科，云南 昆明 650118]

肺癌是指氣管、支氣管、肺部的惡性腫瘤，其中腺癌占比最高，肺癌發(fā)病率、病死率均較高，屬于重大公共衛(wèi)生問題[1-2]。MicroRNA （miRNA）在腫瘤中發(fā)揮的作用眾所周知，miRNA 可通過影響腫瘤的增殖、凋亡、浸潤等參與腫瘤的惡性進展[3-5]。MicroRNA-133b（miR-133b）在包括肺癌在內的多種腫瘤中異常表達，如miR-133b 在胃腸道間質瘤中下調[6]；miR-133b 可抑制人類抗原R，克服前列腺癌細胞的化療耐藥性[7]；miR-133b 可通過靶向PKM2基因促進肺癌A549 干細胞增殖，并降低A549 細胞藥物敏感性[8]。前期試驗表明，體外試驗中miR-133b 在肺癌細胞中異常低表達，有關miR-133b 在肺癌體內研究仍缺乏，因此本研究重點探討miR-133b 在肺癌裸鼠移植瘤中的抑瘤作用，并初步探討相關機制。WANG 等[9]研究表明，F(xiàn)GFR1-ERK1/2-SOX2 軸為信號促進FGFR1 促進肺癌細胞增殖、上皮間質轉化和轉移。前期體外實驗中，miR-133b 可通過靶向負調控FGFR1 抑制肺癌NCI-H1975 細胞增殖和轉移，生物信息網(wǎng)站分析可知miR-133b 與FGFR1 存在結合位點，F(xiàn)GFR1-ERK1/2-SOX2 在肺癌裸鼠移植瘤中如何表達、且與miR-133b 的關系將是本研究研討的內容。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞與試劑

SPF 級BALB/C 雄性裸鼠40 只[SCXK（蘇）2021-0013]購自常州卡文斯實驗動物有限公司。人肺成纖維細胞HLF-α（BFN6021545）、肺癌細胞株NCIH1975（BFN608006102）、A427（BFN60870154）、NGE-1（BFN60808930）、A549（BFN608007142）購自青旗（上海）生物技術發(fā)展有限公司。miR-133b mimic、mimic NC 由生工生物工程（上海）股份有限公司構建，F(xiàn)GFR1 抑制劑——AZD4547（S2801）購自上海Selleck 生物科技有限公司，CCK-8 試劑盒（C0037）、TUNEL 試劑盒（C1091）、HE 染色試劑盒（C0105S）購自上海碧云天生物技術有限公司，總RNA 抽提試劑盒（12183016）、逆轉錄試劑盒（4366597）、總蛋白提取試劑盒（89842）購自賽默飛世爾（上海）科技公司，Ki-67（GTX16667）、Cyclin D1（GTX27958）、VEGF-A（GTX21316）、FGFR1（GRX10646）、p-ERK1/2（GTX635617） 、 ERK1/2 （GTX134462） 、 SOX2（GTX101507）、GAPDH（GTX124502）抗體購自美國GeneTex 公司，山羊抗兔（ab6721）購自美國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 qRT-PCR檢測人肺成纖維細胞、肺癌細胞株miR-133b 表達提取人肺成纖維細胞HLF-α、肺癌細胞株NCI-H1975、A427、NGE-1、A549 細胞總RNA，將2 μg RNA 逆轉錄，cDNA 稀釋至50 ng/μL 上樣。反應體系：共10 μL，miScript SYBR?Green Mix 5 μL，cDNA（50 ng/μL）1 μL，正反向引物各0.5 μL，ddH2O 3.0 μL。反應條件：95℃預變性5 s，95℃ 變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共38 個循環(huán)。以U6為對照，2-ΔΔCt法計算目的基因miR-133b mRNA 相對表達量。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.2 熒光顯微鏡下觀察各組細胞的miR-133b 轉染效率體外培養(yǎng)NCI-H1975 細胞，于高糖DMEM培養(yǎng)基（添加10%胎牛血清）中培養(yǎng)細胞，并置于5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，設置溫度為37℃，每2天更換培養(yǎng)基，待細胞生長至80%左右時進行傳代。轉染前1 天，消化細胞并調整細胞濃度至2×105個/mL，接種在6 孔板上，細胞貼壁至80%左右進行轉染，通過Lipofectamine 3000 試劑盒分別轉染mimic NC 和miR-133b mimic 作為mimic NC 組和miR-133b mimic組，另常規(guī)培養(yǎng)細胞作為對照組。培養(yǎng)24 h 后，熒光顯微鏡下觀察轉染效率，轉染效率（%）=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)。

1.2.3 miR-133b 過表達調控FGFR1 對肺癌細胞NCI-H1975 細胞增殖、遷移的影響將NCI-H1975細胞分為對照組、mimic NC 組、miR-133b mimic 組、miR-133b mimic+pcDNA3.1 組、miR-133b mimic+pcDNA3.1 FGFR1 組。CCK-8 法檢測各組NCI-H1975細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）=（對照組OD 值- 實驗組OD 值）/對照組OD 值×100%。Transwell 實驗檢測NCI-H1975 細胞侵襲、遷移。細胞侵襲：于Transwell 小室中添加Matrigel，37℃固化3 h，加入NCI-H1975 細胞（5×104個），下室中添加RPMI 1640 培養(yǎng)基（含血清，500 μL），培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，經(jīng)多聚甲醛（4%）固定，0.1%結晶紫染色，光學顯微鏡下觀察。細胞遷移：實驗步驟除不加入Matrigel 膠外其余步驟均同侵襲試驗。 通過Targetscan 網(wǎng)站預測miR-133b 與FGFR1 結合位點。

1.2.4 人肺癌裸鼠移植瘤模型復制并分組取對數(shù)生長期細胞消化后，離心棄上清，計數(shù)，調整細胞密度，各組小鼠均在后背部接種4×106個細胞，待腫瘤體積變大至100 mm3時，將裸鼠分為對照組、mimic NC 組、miR-133b mimic 組、miR-133b mimic+AZD4547 組，每組10 只。mimic NC 組、miR-133b mimic 組、miR-133b mimic+AZD4547 組采用5 點注射法注射轉染試劑（100 μL），對照組以無血清培養(yǎng)基代替，miR-133b mimic+AZD4547 組再額外注射12.5 mg/kg AZD4547[10]。1 次/5 d，共4 次。觀察各組小鼠一般狀況。

1.2.5 HE 染色觀察腫瘤組織變化小鼠最后1 次觀測后斷頭處死，剝離腫瘤，稱重并測量腫瘤體積，腫瘤體積=1/2（長徑×短徑2），將腫瘤置于多聚甲醛中固定，制備石蠟切片。脫蠟水化后，經(jīng)HE 染色試劑盒進行染色、脫水、透明、封片后，光學顯微鏡下觀察腫瘤組織變化情況。

1.2.6 TUNEL 檢測腫瘤細胞凋亡取石蠟切片，TUNEL 細胞凋亡試劑盒進行腫瘤細胞的凋亡檢測，光學顯微鏡下觀察，棕黃色染色代表凋亡細胞。凋亡率（%）=（陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)）×100%。

1.2.7 免疫組織化學法觀察小鼠腫瘤組織VEGFA、Cyclin D、Ki-67 表達對石蠟切片進行脫水（梯度法：100%無水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、85%乙醇、70%乙醇），抗原修復（枸櫞酸鈉），H2O2封閉，山羊血清封閉，添加VEGF-A、Cyclin D、Ki-67 兔源一抗（稀釋比分別為1∶20、1∶500、1∶500），清洗后添加山羊抗兔二抗，DAB 顯色，蘇木精復染、分化、反藍、水化、透明、封片，光學顯微鏡下觀察。

1.2.8 Western blotting 檢測FGFR1、p-ERK1/2、ERK1/2、SOX2 蛋白相對表達量稱量100 mg 移植瘤組織，眼科剪剪碎，加入預冷裂解液勻漿器內勻漿，轉移至離心管內，離心（12 000 r/min，15 min）取上清液，置入-80℃冰箱冷凍保存待用。BCA 試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE 凝膠電泳，轉膜至PVDF 膜上，封閉，加入稀釋一抗FGFR1、p-ERK1/2、ERK1/2、SOX2，稀釋比分別為1∶200、1∶200、1∶200、1∶400，以GAPDH（1∶5 000）為內參，封閉，24 h 加山羊抗兔二抗（1∶5 000），封閉，ECL 顯色液，分析FGFR1、p-ERK1/2/ERK1/2、SOX2 蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較用t檢驗；多組間比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各細胞miR-133b表達的比較

人肺成纖維細胞HLF-α，肺癌細胞株NCIH1975、A427、NGE-1、A549 中miR-133b mRNA 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與人肺成纖維細胞HLF-α 比較，肺癌細胞株NCI-H1975、A427、NGE-1、A549 中miR-133b mRNA 相對表達量均降低（P<0.05），其中NCI-H1975 細胞中miR-133b mRNA 相對表達量最低，本研究選擇NCI-H1975 細胞作為研究細胞。見表2。

表2 各細胞miR-133b表達的比較 （±s）

表2 各細胞miR-133b表達的比較 （±s）

注：?與HLF-α 比較，P <0.05。

組別HLF-α NCI-H1975 A427 NGE-1 A549 F 值P 值miR-133b mRNA 1.02±0.12 0.16±0.02?0.52±0.06?0.74±0.09?0.46±0.05?106.965 0.000

2.2 miR-133b過表達NCI-H1975細胞

對照組、mimic NC 組、miR-133b mimic 組miR-133b mRNA 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），miR-133b mimic 組miR-133b mRNA相對表達量較對照組和mimic NC 組升高（P<0.05）（見表3）。miR-133b mimic 組的miR-133b 轉染效率較高，提示構建的轉染細胞株成功（見圖1）。

表3 各組細胞的miR-133b轉染效率比較 （±s）

表3 各組細胞的miR-133b轉染效率比較 （±s）

注：①與對照組比較，P <0.05；②與mimic NC組比較，P <0.05。

組別對照組mimic NC組miR-133b mimic組F 值P 值miR-133b mRNA 1.02±0.12 1.01±0.12 3.17±0.39①②154.033 0.000

圖1 熒光顯微鏡下觀察的轉染效率

2.3 miR-133b 調控FGFR1 對NCI-H1975 細胞增殖、侵襲、遷移的影響

各組細胞增殖抑制率、侵襲細胞數(shù)、遷移細胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與對照組比較，miR-133b mimic 組增殖抑制率升高（P<0.05），侵襲細胞數(shù)、遷移細胞數(shù)降低（P<0.05）；與 miR-133b mimic 組 比 較 ，miR-133b mimic+pcDNA3.1 FGFR1 組增殖抑制率降低（P<0.05），侵襲細胞數(shù)、遷移細胞數(shù)增加（P<0.05）（見表4 和圖2）。生信網(wǎng)站預測顯示，miR-133b 與FGFR1存在靶向關系（見圖3）。

表4 各組細胞增殖抑制率、侵襲細胞數(shù)、遷移細胞數(shù)的比較 （±s）

表4 各組細胞增殖抑制率、侵襲細胞數(shù)、遷移細胞數(shù)的比較 （±s）

注：①與對照組比較，P <0.05；②與miR-133b mimic組比較，P <0.05。

組別對照組mimic NC組miR-133b mimic組miR-133b mimic + pcDNA3.1組miR-133b mimic + pcDNA3.1 FGFR1組F 值P 值增殖抑制率/%0 0.54±0.07 32.71±4.67①31.72±4.51 18.24±2.62②154.056 0.000侵襲細胞數(shù)/個135.41±19.34 136.67±19.52 66.53±9.50①67.76±9.63 95.54±13.65②31.866 0.000遷移細胞數(shù)/個222.72±31.80 234.38±33.48 85.62±12.24①87.36±12.48 132.58±18.95②55.638 0.000

圖2 各組細胞侵襲、遷移情況

圖3 Targetscan網(wǎng)站預測FGFR1與miR-133b的關系

2.4 各組裸鼠成瘤后情況

裸鼠成瘤后，逐漸萎靡不振，攝食、飲水量均減少，消瘦，皮毛晦暗，雙目呆滯，行動緩慢；轉染干預后，miR-133b mimic 組裸鼠癥狀較mimic NC 組和對照組輕，miR-133b mimic+AZD4547 組癥狀較miR-133b mimic 組輕。肺癌細胞裸鼠皮下移植瘤均復制成功，成功率100%。

2.5 各組裸鼠移植瘤體積和重量的比較

對照組、mimic NC 組、miR-133b mimic 組、miR-133b mimic+AZD4547 組裸鼠處死時移植瘤重量和體積比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。miR-133b mimic 組移植瘤重量較對照組降低，體積縮?。≒<0.05），miR-133b mimic+AZD4547 組重量移植瘤較miR-133b mimic 組降低，體積縮小（P<0.05）。見表5 和圖4。

圖4 各組裸鼠處死后腫瘤形態(tài)

表5 各組裸鼠處死時移植瘤重量和體積的比較（n =10，±s）

表5 各組裸鼠處死時移植瘤重量和體積的比較（n =10，±s）

注：①與對照組比較，P <0.05；②與miR-133b mimic 組比較，P <0.05。

組別對照組mimic NC組miR-133b mimic組miR-133b mimic+AZD4547組F 值P 值重量/g 0.52±0.06 0.54±0.07 0.21±0.02①0.11±0.01②126.311 0.000體積/mm3 481.82±60.21 523.61±65.45 182.74±22.84①124.62±13.11②115.676 0.000

2.6 各組肺裸鼠移植瘤腫瘤組織病理變化

裸鼠皮下移植瘤與周圍組織分界清晰，容易剝除。HE 染色結果顯示，對照組、mimic NC 組腫瘤細胞空泡樣變性明顯、細胞結構消失、細胞紅染，miR-133b mimic 組空泡樣變性程度較對照組、mimic NC 組輕，miR-133b mimic+AZD4547 組細胞病變程度較miR-133b mimic 組輕。見圖5。

圖5 各組肺癌裸鼠移植瘤腫瘤組織染色結果 （HE染色×400）

2.7 各組肺癌裸鼠移植瘤腫瘤組織細胞凋亡情況

各組肺癌裸鼠移植瘤組織細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），miR-133b mimic 組腫瘤組織細胞凋亡率較對照組升高（P<0.05）；miR-133b mimic+AZD4547 組較miR-133b mimic 組腫瘤組織細胞凋亡率升高（P<0.05）。見表6 和圖6。

圖6 各組肺癌裸鼠移植瘤腫瘤細胞凋亡情況 （TUNEL染色×400）

表6 各組肺癌裸鼠移植瘤腫瘤組織細胞凋亡率比較（n =10，%，±s）

表6 各組肺癌裸鼠移植瘤腫瘤組織細胞凋亡率比較（n =10，%，±s）

注：①與對照組比較，P <0.05；②與miR-133b mimic組比較，P <0.05。

組別對照組mimic NC組miR-133b mimic組miR-133b mimic+AZD4547組F 值P 值凋亡率18.24±2.28 19.72±2.46 42.76±6.34①51.72±6.46②72.108 0.000

2.8 各組裸鼠腫瘤組織VEGF-A、Cyclin D1、Ki-67蛋白表達

免疫組織化學檢測結果顯示，VEGF-A 定位于細胞漿，Ki-67、Cyclin D 均定位于細胞核。miR-133b mimic 組Ki-67、Cyclin D、VEGF-A 陽性細胞比例較對照組低，miR-133b mimic+AZD4547 組VEGF-A、Cyclin D、Ki-67 陽性細胞比例較miR-133b mimic組低。見圖7。

圖7 各組裸鼠腫瘤組織VEGF-A、Cyclin D1、Ki-67蛋白表達 （免疫組織化學×400）

2.9 各組裸鼠腫瘤組織FGFR1、p-ERK1/2/ERK1/2、SOX2表達比較

各組裸鼠腫瘤組織FGFR1、p-ERK1/2/ERK1/2、SOX2 蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。miR-133b mimic 組FGFR1、p-ERK1/2/ERK1/2、SOX2 相對表達量較對照組降低（P<0.05），miR-133b mimic+AZD4547 組FGFR1、 p-ERK1/2/ERK1/2、 SOX2 相對表達量較miR-133b mimic 組降低（P<0.05）。見表7 和圖8、9。

表7 各組裸鼠腫瘤組織FGFR1、p-ERK1/2/ERK1/2、SOX2蛋白相對表達量的比較 （n =10，±s）

表7 各組裸鼠腫瘤組織FGFR1、p-ERK1/2/ERK1/2、SOX2蛋白相對表達量的比較 （n =10，±s）

注：①與對照組比較，P <0.05；②與miR-133b mimic組比較，P <0.05。

組別對照組mimic NC組miR-133b mimic組miR-133b mimic+AZD4547組F 值P 值FGFR1 2.03±0.25 2.01±0.25 0.97±0.12①0.52±0.09②93.671 0.000 p-ERK1/2/ERK1/2 0.86±0.11 0.84±0.10 0.25±0.03①0.13±0.02②151.453 0.000 SOX2 1.38±0.17 1.37±0.17 0.41±0.05①0.11±0.03②440.435 0.000

圖8 各組裸鼠腫瘤組織各蛋白表達

圖9 各組裸鼠腫瘤組織各蛋白相對表達量的比較（n = 10，±s）

3 討論

肺癌是我國較常見的惡性腫瘤，治療靶點的研究是永恒課題。隨著miRNA 在腫瘤領域的研究不斷深入，許多miRNA 被證實在肺癌中發(fā)揮作用。miR-133b 在許多惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用，miR-133b 過表達可抑制人胃癌AGS 細胞株增殖、遷移與侵襲[14]；miR-133b 可通過CTGF 調控卵巢癌上皮間質轉化[15]；miR-133b 通過靶向HOXA9 抑制結直腸癌轉移[16]；miR-133b 可充當LncRNA HOXDAS1 與MMP9 的中間橋梁參與非小細胞肺癌的遷移與侵襲[17]。與人肺成纖維細胞HLF-α 比較，肺癌細胞株（NCI-H1975、A427、NGE-1、A549） 中miR-133b 表達均降低，其中NCI-H1975 細胞中表達最低，因此本研究選取NCI-H1975 細胞作為miR-133b 與肺癌體內實驗關系的研究細胞株。本研究細胞實驗證實，miR-133b 可通過負調控FGFR1 抑制肺癌NCI-H1975 細胞增殖及遷移，因此復制肺癌NCI-H1975 細胞皮下移植瘤，待裸鼠成瘤后，裸鼠逐漸萎靡不振、攝食、飲水量減少，消瘦，皮毛晦暗，雙目呆滯，行動緩慢，腫瘤體積、重量呈升高趨勢，滿足實驗需求。裸鼠處死后，裸鼠腫瘤體積與重量均低于對照組與mimic NC 組，證明miR-133b 在體內也可發(fā)揮抑癌作用，與體外實驗具有一致性[17]。HE 染色、TUNEL 檢測結果顯示miR-133b mimic 組空泡樣變性程度、細胞凋亡率均降低，提示miR-133b 過表達在抑制NCI-H1975裸鼠移植瘤皮下增長、促進凋亡中發(fā)揮關鍵作用。Cyclin D1、Ki67 是細胞增殖相關蛋白，可作為評價細胞增殖狀態(tài)指標，可在一定程度上反應肺癌細胞的惡性增殖。新生血管為腫瘤生長提供營養(yǎng)與通道，抑制新生血管的生成也是抑癌的主要手段之一，VEGF-A 可促血管生成。本研究免疫組織化學檢測結果發(fā)現(xiàn)，miR-133b 過表達可降低VEGF-A、Cyclin D1、Ki67 陽性表達，微血管密度降低，即miR-133b 過表達可抑制NCI-H1975 細胞體內增殖與新生血管生成而延緩腫瘤生長速度。

FGFR1 在肺癌中被廣泛研究，被認為是調控肺部腫瘤侵襲、遷移的關鍵靶點，其激活可增強肺部腫瘤干細胞樣特性與抗凋亡能力，同時可觀察到SOX2 的上調[18]。SOX2 是腫瘤干性標志物，可調控肺癌的腫瘤生長，其激活可促進腫瘤的侵襲轉移[19]。實體瘤的致死與腫瘤的侵襲轉移關系密切。FGFR1 上調SOX2 的機制與其激活多種下游通路有關，MAPK 是FGFR1 的關鍵下游[20]。FGFR1/MAPK 在多種腫瘤細胞的生物學進展中屬于關鍵一環(huán)。WANG 等[9]研究顯示，F(xiàn)GFR1 抑制可通過促使下游ERK1/2 磷酸化進而上調SOX2 表達，促進肺癌細胞增殖。上皮間質轉化與轉移；LIN 等[21]研究顯示，F(xiàn)GF21 通過FGFR1-ERK1/2-Elk-1 途徑抑制HepG2 細胞載脂蛋白的表達；FANG 等[22]研究顯示，SOX2 與FGFR1 升高與小細胞肺癌患者的預后不良相關；本研究中，miR-133b 過表達可降低p-ERK1/2、SOX2 相對表達量，提示miR-133b 過表達抑體內移植瘤的作用可能是通過FGFR1-ERK1/2-SOX2 軸實現(xiàn)的，但具體機制仍待進一步分析。為此本研究通過瘤內注射FGFR1 抑制劑AZD4547，發(fā)現(xiàn)AZD4547 可進一步加大miR-133b 過表達導致的抑瘤作用。因此筆者認為miR-133b 過表達對裸鼠肺癌NCI-H1975 細胞皮下移植瘤生長具有抑制作用，且可能是通過調控FGFR1-ERK1/2-SOX2 信號通路實現(xiàn)的。

綜上所述，miR-133b 過表達可能通過抑制FGFR1-ERK1/2-SOX2 軸，對裸鼠肺癌NCI-H1975細胞皮下移植瘤生長具有抑制作用。但本研究也存在一定不足，僅用FGFR1 抑制劑驗證了FGFR1在FGFR1-ERK1/2-SOX2 中發(fā)揮的作用，下一步將繼續(xù)嘗試使FGFR1 過表達觀察小鼠腫瘤的變化，并對其下游機制進行充分驗證。