楊萌，袁超燕，熊焱強(qiáng)

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院 婦產(chǎn)科，湖北 武漢 430014；2.湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院 婦科，湖北 恩施 445000）

宮頸癌是危害全球女性健康的最常見的癌癥類型之一，發(fā)病率和病死率次于乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌[1]。根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)的數(shù)據(jù)，2018年，宮頸癌患者人數(shù)為57 萬，比過去10年增加了7.8%，死于該疾病的人數(shù)達(dá)31.1 萬[2]。因此，盡管推薦了宮頸癌篩查方案，但近年來世界范圍內(nèi)宮頸癌的發(fā)病率和病死率都逐步增長(zhǎng)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，性別決定區(qū)Y 框蛋白4（sex-determining region Ybox 4,SOX4）可作為microRNA-129-5p（miR-129-5p）的直接靶點(diǎn)，兩者均參與宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等惡性表型[4]。然而，目前關(guān)于miR-129-5p、SOX4 與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。因此本研究通過檢測(cè)宮頸癌組織與癌旁組織的miR-129-5p、SOX4 表達(dá)，探討兩者與宮頸癌進(jìn)展及預(yù)后的關(guān)系，以期為宮頸癌治療提供一定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月—2019年8月湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院的101 例宮頸癌組織、癌旁組織標(biāo)本及其臨床資料。其中，年齡< 50 歲39 例，年齡≥ 50 歲62 例；產(chǎn)次≤ 1 次51 例，> 1 次50 例；FIGO 分期Ⅰ期47 例，F(xiàn)IGO 分期Ⅱ期54 例；鱗癌64 例，腺癌37 例；中/高分化48 例，低分化53 例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46 例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移55 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①宮頸癌均通過活檢或術(shù)后病理檢測(cè)確診，均為首次診治；②標(biāo)本保存完整，隨訪資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并血栓性疾病、血液系統(tǒng)疾病或系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫疾病者；②有嚴(yán)重肝腎功能不全或其他不適合手術(shù)疾病者；③其他原發(fā)性惡性腫瘤疾病者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)miR-129-5p mRNA 相對(duì)表達(dá)量手術(shù)獲取癌旁組織（與癌組織距離> 5 cm）和宮頸癌組織，液氮冷凍后置于-80℃超低溫冰箱保存。組織研磨后采用TRIzol 試劑（上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司，貨號(hào)：15596026）提取總RNA，RNA 檢測(cè)合格后逆轉(zhuǎn)錄（上海谷研實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)：GOY-C6397）cDNA，使用ABI 7500 型qRT-PCR 儀（美國ABI 公司）進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性90 s；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。各樣品均重復(fù)3 次，U6為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-129-5p mRNA 相對(duì)表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)SOX4 蛋白陽性表達(dá)手術(shù)獲取癌旁組織（與癌組織距離>5 cm）和宮頸癌組織，10%甲醛浸泡固定，制成4 μm 石蠟切片，嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)試劑盒（上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，貨號(hào)：RP1105）說明書進(jìn)行染色，待完成染色后封片鏡檢，出現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒則為SOX4 蛋白陽性表達(dá)。采用半定量結(jié)果判斷，分別對(duì)鏡下陽性細(xì)胞的百分比和染色強(qiáng)度給予評(píng)分。①陽性著色細(xì)胞數(shù)：每張切片上觀察5 個(gè)高倍視野（×400），計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞百分比。陽性細(xì)胞數(shù)> 75%為4 分、> 50%～75%為3 分、>25%～50%為2 分、5%～25%為1 分、< 5%為0 分。②染色強(qiáng)度：無色為0 分、淺黃為1 分、棕黃為2 分、棕褐為3 分。兩種分?jǐn)?shù)相乘，乘積為0～3 分為陰性表達(dá)，乘積>4 分為陽性表達(dá)。

1.3 隨訪

手術(shù)結(jié)束后隨訪3年，方式為定期門診復(fù)查或電話，必要時(shí)進(jìn)行影像檢查。隨訪期間患者出現(xiàn)癌因死亡則隨訪結(jié)束，隨訪截止時(shí)間為2022年8月。根據(jù)3年隨訪期間患者癌因死亡情況將其分為生存組79 例和死亡組22 例，所有患者均未失訪。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；繪制Kaplan-Meier 曲線分析miR-129-5p、SOX4 表達(dá)與宮頸癌患者3年生存率的關(guān)系；采用多因素Cox回歸分析宮頸癌患者預(yù)后的影響因素。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌旁組織和宮頸癌組織中miR-129-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量、SOX4蛋白陽性表達(dá)率比較

癌旁組織和宮頸癌組織中miR-129-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量、SOX4 蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），宮頸癌組織miR-129-5p mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織，SOX4 蛋白陽性表達(dá)率高于癌旁組織。見表2 和圖1。

表2 癌旁組織和宮頸癌組織中miR-129-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量、SOX4蛋白陽性表達(dá)比較 （n =101）

圖1 癌旁組織和宮頸癌組織中SOX4蛋白表達(dá)（免疫組織化學(xué)×200）

2.2 宮頸癌組織中miR-129-5p mRNA 相對(duì)表達(dá)量、SOX4蛋白陽性表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

以宮頸癌組織中miR-129-5p mRNA 相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)為界，101 例患者中51 例miR-129-5p低表達(dá)，50 例miR-129-5p 高表達(dá)；SOX4 蛋白陽性表達(dá)68 例，陰性表達(dá)33 例。結(jié)果顯示，不同年齡、產(chǎn)次、病理類型患者宮頸癌組織中miR-129-5p、SOX4 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。FIGO 分期Ⅱ期、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者宮頸癌組織中miR-129-5p 低表達(dá)，SOX4 蛋白陽性表達(dá)率高于FIGO 分期Ⅰ期、中/高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P<0.05）。見表3。

表3 不同臨床病理特征患者宮頸癌組織中miR-129-5p高/低表達(dá)及SOX4蛋白陽性/陰性表達(dá)的比較 例（%）

2.3 miR-129-5p、SOX4 表達(dá)與宮頸癌患者3年生存率的關(guān)系

Kaplan-Meier 生存曲線結(jié)果顯示，miR-129-5p低表達(dá)患者的3年生存率64.71%（33/51）低于miR-129-5p 高表達(dá)患者3年生存率92.00%（46/50）（χ2=11.040，P=0.001）；SOX4 陽性表達(dá)患者的3年生存率70.59%（48/68）低于SOX4陰性表達(dá)患者3年生存率93.94%（31/33）（χ2=7.111，P=0.008）。見圖2、3。

圖2 miR-129-5p高/低表達(dá)宮頸癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.4 宮頸癌患者3年生存率的單因素分析

生存組和死亡組的年齡、產(chǎn)次、病理類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；兩組的FIGO 分期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），死亡組FIGO 分期Ⅱ期患者比例低于生存組。見表4。

表4 宮頸癌患者3年生存率的單因素分析 例（%）

2.5 宮頸癌患者預(yù)后影響因素的多因素Cox 回歸分析

圖3 SOX4蛋白陽性/陰性表達(dá)宮頸癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

以宮頸癌患者3年內(nèi)是否死亡（否 = 0，是 = 1）為因變量，以miR-129-5p（低表達(dá) = 0，高表達(dá) = 1）、SOX4（陰性表達(dá) = 0，陽性表達(dá) = 1）、FIGO 分期（Ⅰ期 = 0，Ⅱ期 = 1）為自變量，進(jìn)行多因素Cox 回歸分析，結(jié)果顯示，SOX4 陽性表達(dá)[H^R =2.793（95% CI：1.495，5.219）]是宮頸癌患者3年內(nèi)死亡的危險(xiǎn)因素（P<0.05），miR-129-5p 高表達(dá)[H^R =0.809（95% CI：0.700，0.935）]是宮頸癌患者3年內(nèi)死亡的保護(hù)因素（P<0.05）。見表5。

表5 宮頸癌患者預(yù)后的多因素COX回歸分析

3 討論

宮頸癌是影響全球女性健康的第四大惡性腫瘤，被認(rèn)為是女性死亡的第二大原因[5-6]。宮頸癌的治療采用了多種策略，包括放療、化療和手術(shù)[7]。然而，宮頸癌細(xì)胞在晚期表現(xiàn)出的攻擊性行為，需要新的策略來消除[8]。尋找可靠的遺傳、分子和免疫組織化學(xué)標(biāo)志物，以早期預(yù)測(cè)腫瘤進(jìn)程和預(yù)后，也是目前現(xiàn)代腫瘤學(xué)的一項(xiàng)重要任務(wù)。

研究顯示[9-10]，多種miRNAs 在宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等過程中發(fā)揮重要作用。miR-129-5p屬于miR-129 家族，在人體的眾多組織和器官中表達(dá)，并廣泛調(diào)節(jié)生物學(xué)功能，其異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[11-12]。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織miR-129-5p 表達(dá)低于癌旁組織。提示miR-129-5p 可能作為一種癌癥抑制性miRNA 參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。相關(guān)研究同樣發(fā)現(xiàn)抑制miR-129-5p 可加速宮頸癌細(xì)胞的侵襲、遷移等進(jìn)展[13]，與本研究結(jié)果基本一致。目前miR-129-5p表達(dá)下降的分子機(jī)制尚不明確，可能與其下游因子轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及其編碼基因突變等有關(guān)。有研究顯示，miR-129-5p 表達(dá)升高從而下調(diào)宮頸癌中Hedgehog 信號(hào)通路抑制ZIC2，從而抑制細(xì)胞侵襲、遷移及腫瘤血管生成[14]。進(jìn)一步表明miR-129-5p可能通過調(diào)控下游多個(gè)相關(guān)通路，參與宮頸癌進(jìn)展。

SOX 蛋白是能夠調(diào)節(jié)不同分子途徑的轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)在胚胎發(fā)生、疾病發(fā)展和致癌過程中變化[15]。SOX4 是SOX 基因家族的成員，在脊椎動(dòng)物中高度保守，與骨、胰島和心臟的發(fā)育有關(guān)，且在20 多種惡性腫瘤中高度表達(dá)，并促進(jìn)惡性表型[16]。ZHANG 等[17]研究顯示，在宮頸癌組織和細(xì)胞系中，SOX4 表達(dá)上調(diào)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA SNHG5通過負(fù)調(diào)控miR-132 增強(qiáng)SOX4 表達(dá)來促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中SOX4 蛋白高表達(dá)，與CHEN 等[18]研究一致。推測(cè)SOX4作為miR-129-5p的靶基因，受miR-129-5p的負(fù)向調(diào)控，參與宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移。

本研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，F(xiàn)IGO 分期越高、分化程度越低、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的miR-129-5p表達(dá)越低、SOX4 表達(dá)越高。提示miR-129-5p、SOX4 可反映宮頸癌病情嚴(yán)重程度，miR-129-5p 表達(dá)降低后與SOX4 的3'-非編碼區(qū)結(jié)合減少，導(dǎo)致SOX4 表達(dá)增加，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的侵襲、遷移及腫瘤血管生成，兩者有可能成為新的腫瘤相關(guān)標(biāo)志物。此外，miR-129-5p 低表達(dá)、SOX4 陽性表達(dá)患者3年生存率明顯較低，兩者均是宮頸癌患者預(yù)后的影響因素，提示miR-129-5p、SOX4 表達(dá)異?？赡芘c宮頸癌患者預(yù)后不良有關(guān)，有成為預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力，但需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

綜上所述，與癌旁組織相比，宮頸癌組織中miR-129-5p 表達(dá)降低、SOX4 表達(dá)升高，兩者表達(dá)均與FIGO 分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及3年生存率有關(guān)，有可能成為宮頸癌預(yù)后的生物標(biāo)志物。但由于本研究方法較為基礎(chǔ)，研究樣本量相對(duì)較小，隨訪時(shí)間較短，尚需大樣本及基礎(chǔ)研究驗(yàn)證兩者參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。