曹小九 李洪智 張曉琦

肺結(jié)核屬于常見的呼吸系統(tǒng)傳染性疾病，流行病學調(diào)查研究顯示[1]，我國肺結(jié)核的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且涂陰性肺結(jié)核占比高達85%，約13%的結(jié)核病傳播由涂陰性肺結(jié)核所引起，故對涂陰性肺結(jié)核進行早期診斷在結(jié)核病防治工作中具有重要意義。目前臨床上以抗酸染色和痰涂片作為涂陰性肺結(jié)核的主要診斷手段，但抗酸染色鏡檢方法的陽性檢出率和敏感度較低，而痰涂片鏡檢操作復雜，且培養(yǎng)時間較長，均難以實現(xiàn)對涂陰性肺結(jié)核的及時診斷[2]。隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展，GeneXpert MTB/RIF 技術(shù)可在2h 內(nèi)直接檢出是否含有結(jié)核分枝桿菌及該菌是否對利福平耐藥，近年來被逐漸應(yīng)用于結(jié)核病診斷中[3]。但目前臨床上有關(guān)GeneXpert MTB/RIF 檢測涂陰性肺結(jié)核以及利福平耐藥性方面的報道較少，本研究對GeneXpert MTB/RIF檢測在涂陰性肺結(jié)核診斷和耐藥性檢驗中的應(yīng)用價值做進一步分析。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2019年11月～2021年12月于我院就診的120 例疑似涂陰性肺結(jié)核患者為研究對象。其中男78 例，女42 例，年齡21～85 歲，平均（53.17±7.97）歲。納入標準：①出現(xiàn)咳嗽、咳痰、胸痛、乏力等肺結(jié)核典型臨床癥狀；②經(jīng)影像學檢查，患者肺部有活動性肺結(jié)核病變。排除標準：①合并其他肺部疾病；②妊娠期或哺乳期女性。本研究已由我院醫(yī)學倫理委員會批準，受試者均自愿參與研究，且簽訂相關(guān)同意書，患者家屬獲有知情權(quán)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 患者入院后采集痰液3～5ml。若患者無法自然咳痰則對其采取霧化誘導措施進行排痰。取每份痰液標本的膿性部分做抗酸染色檢查，剩余的痰液標本各取1ml 進行GeneXpert MTB/RIF檢測和痰培養(yǎng)檢測。

1.2.2 痰培養(yǎng)檢測 在1ml 痰液中加入4%氫氧化鈉1ml，震蕩15～20s 后靜置15～20min。采用無菌吸管將痰液標本接種到MGIT 79 培養(yǎng)基中。然后將其置入全自動結(jié)核培養(yǎng)藥敏儀（型號：BACTEC MGIT960，廠家：Becton，Dickinson and Company）中。每周對培養(yǎng)結(jié)果進行報告和記錄，若痰液標本為陽性，儀器的紅色指示燈則會立即閃亮并出現(xiàn)提示音。

1.2.3 抗酸染色檢測 應(yīng)用齊-內(nèi)染色法對抗酸桿菌涂片進行檢測。結(jié)果判讀標準：結(jié)核分枝桿菌陽性（4+）：每個視野發(fā)現(xiàn)＞9 條結(jié)核分枝桿菌；結(jié)核分枝桿菌陽性（3+）：每個視野發(fā)現(xiàn)1～9 條結(jié)核分枝桿菌；結(jié)核分枝桿菌陽性（2+）：100 個視野發(fā)現(xiàn)＞9 條結(jié)核分枝桿菌；結(jié)核分枝桿菌陽性（1+）：300 個視野發(fā)現(xiàn)＞9 條結(jié)核分枝桿菌；結(jié)核分枝桿菌陰性（-）：300 個視野發(fā)現(xiàn)1～8 條結(jié)核分枝桿菌。

1.2.4 藥敏試驗 依據(jù)《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗標準化操作程序及質(zhì)量保證手冊》要求，將痰培養(yǎng)和抗酸染色中所有陽性標本接種至含有濃度為40μg/ml 利福平的羅氏培養(yǎng)基中進行藥敏檢測。在37℃環(huán)境下培養(yǎng)1 個月后對結(jié)果進行觀察。

1.2.5 GeneXpert MTB/RIF 檢測 采集患者痰液（1ml）后加入樣本處理液（2ml）在試管中予以混合，然后震蕩約30s，靜置15min 左右。使用GeneXpert MTB/RIF檢測專用的吸管將標本液體轉(zhuǎn)移至專用的樣本反應(yīng)盒后整體放置于GeneXpert MTB/RIF 檢測儀中，儀器開始自動化檢測，約2h 后可直接讀取結(jié)果。其中GeneXpert MTB/RIF 對結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥的檢測結(jié)果分別為結(jié)核分枝桿菌檢出、結(jié)核分枝桿菌未檢出和利福平耐藥檢出、利福平耐藥未檢出。

1.3 統(tǒng)計學分析應(yīng)用SPSS 21.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三種檢測方法檢測涂陰性肺結(jié)核陽性率比較痰培養(yǎng)、抗酸染色、GeneXpert MTB/RIF 檢測涂陰性肺結(jié)核陽性率依次為35.00%、32.50%、83.33%。與痰培養(yǎng)和抗酸染色相比，GeneXpert MTB/RIF 檢測涂陰性肺結(jié)核陽性率較高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 三種檢測方法檢測涂陰性肺結(jié)核陽性率比較（n）

2.2 三種檢測方法對涂陰性肺結(jié)核診斷效能比較以臨床最終診斷為“金標準”，其中臨床最終診斷涂陰性肺結(jié)核101 例。與痰培養(yǎng)和抗酸染色相比，GeneXpert MTB/RIF 檢測涂陰性肺結(jié)核的敏感度、特異性、準確度均較高，且與臨床最終診斷的一致性最高，見表2。

表2 三種檢測方法診斷效能比較

2.3 三種檢測方法檢測利福平耐藥的效能比較以絕對濃度法藥敏試驗結(jié)果為“金標準”，其中絕對濃度法藥敏試驗鑒定利福平耐藥16 例。痰培養(yǎng)、抗酸染色、GeneXpert MTB/RIF 檢測利福平耐藥的陽性率依次為26.73%、27.72%、23.76%，三者比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。GeneXpert MTB/RIF 檢測利福平耐藥的敏感度、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、準確度依次為87.50%、88.23%、58.33%、97.40%、88.11%，與痰培養(yǎng)和抗酸染色檢測相比較，GeneXpert MTB/RIF 檢測利福平耐藥的效能更優(yōu)，見表3。

表3 三種檢測方法與絕對濃度法藥敏試驗結(jié)果比較

3 討論

涂陰性肺結(jié)核具有較高的患病率和耐藥率，若不采取有效措施，則會嚴重威脅公共衛(wèi)生安全，故對涂陰性肺結(jié)核予以及時的診斷和耐藥性的早期發(fā)現(xiàn)則顯得尤為重要?？顾崛旧科ê吞蹬囵B(yǎng)是臨床上常用的結(jié)核病診斷方法，其中涂片法操作快速、簡單，但敏感度較低，且對標本的菌量要求較高，具有一定的局限性；而痰培養(yǎng)耗時較長，增加了延誤疾病診斷和治療的風險[4]。

GeneXpert MTB/RIF 檢測是近年來一種新型的檢測方法，能在2h 內(nèi)直接從痰液標本中檢出是否含有結(jié)核分枝桿菌及該菌是否對利福平耐藥。該檢測方法主要通過巢式實時熒光定量PCR 法對結(jié)核分枝桿菌特有的序列rpoB 基因上與利福平耐藥相關(guān)的核心區(qū)域（RRDR）進行檢測，整合并自動進行樣品純化、核酸擴增、單一或復雜樣品中的目標序列測定[5，6]。本研究結(jié)果顯示，與痰培養(yǎng)和抗酸染色法相比，GeneXpert MTB/RIF 檢測涂陰性肺結(jié)核陽性率明顯較高。表明采用GeneXpert MTB/RIF檢測在提高涂陰性肺結(jié)核診斷率、減少漏診風險方面具有積極意義。此外，雖然涂陰性肺結(jié)核的傳播性較弱，但是仍有約13%的結(jié)核病傳播是由涂陰性肺結(jié)核造成的，故有效提高涂陰性肺結(jié)核患者陽性診斷率在結(jié)核病的早期診斷和防治工作中具有十分重要的意義[7，8]。此外，本研究結(jié)果還顯示，以臨床最終診斷為“金標準”，與痰培養(yǎng)、抗酸染色相比，GeneXpert MTB/RIF 檢測涂陰性肺結(jié)核的敏感度、特異性、準確度均較高，且與臨床最終診斷的一致性最高，提示GeneXpert MTB/RIF 檢測對涂陰性肺結(jié)核的診斷效能較高。分析原因可能是因為抗酸染色涂片檢測受操作方法等因素的影響，加之痰涂片的檢出率和痰液標本的性狀密切相關(guān)，需要每毫升痰液中至少有5000 拷貝抗酸桿菌才能檢出陽性，故出現(xiàn)陽性檢出率高低不一的情況較多[9，10]。痰培養(yǎng)耗時較長，一般至少需要6～8周，且可能有部分患者在診斷為涂陰性肺結(jié)核前服用過相關(guān)治療藥物，導致培養(yǎng)結(jié)果為陰性[11]。而GeneXpert MTB/RIF 檢測則具有更高的敏感度和特異性，且在2h 內(nèi)即可得到檢測結(jié)果，因此與痰培養(yǎng)、抗酸染色相比，GeneXpert MTB/RIF 檢測在涂陰性肺結(jié)核中具有更優(yōu)的診斷效能和臨床應(yīng)用價值，可更好地對涂陰性肺結(jié)核患者進行輔助診斷。

利福平是目前臨床上治療肺結(jié)核的一線藥物，但耐藥性已成為肺結(jié)核傳播控制不理想的主要原因[12]。耐藥肺結(jié)核治愈率低、治療費用高且時間較長，已成為結(jié)核病防治工作中的重點難題[13]。本研究結(jié)果顯示，以絕對濃度法藥敏試驗結(jié)果為“金標準”，與痰培養(yǎng)和抗酸染色檢測相比，GeneXpert MTB/RIF 檢測利福平耐藥的效能更優(yōu)，與鐘莉等[14]的研究相比，敏感度略低，考慮原因可能是不同地區(qū)菌株流行情況有所不同，利福平耐藥中的rpoB基因突變比例存在一定的差異。值得注意的是，GeneXpert MTB/RIF 雖僅能對利福平進行檢測，但有研究顯示大部分對利福平耐藥的肺結(jié)核患者對異煙肼也耐藥。GeneXpert MTB/RIF 在利福平耐藥的早期檢測中具有積極意義，同時也可作為耐藥肺結(jié)核的診斷方式[15]。

綜上所述，GeneXpert MTB/RIF 檢測涂陰性肺結(jié)核的敏感度、特異性、準確度均較高，具有良好的診斷效能，同時在篩查利福平耐藥方面也具有較高的臨床應(yīng)用價值，值得推廣和應(yīng)用。