李慶偉 齊豹 高龍飛

腰痛是臨床常見癥狀，50%～80%的人患有腰痛，15%的人可能患有慢性腰痛[1]。因腰痛就診的患者例數(shù)僅次于上呼吸道感染[2]。關(guān)于腰痛的發(fā)病機(jī)制尚未達(dá)成共識(shí)，最常見的原因是腰椎間盤退行性病變，這是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，受環(huán)境、年齡、遺傳、動(dòng)力學(xué)和其他許多因素的影響[3～5]。近年來，一些學(xué)者提出了一種新的椎間盤源性腰痛的概念，用于描述由于腰椎間盤內(nèi)部成分及結(jié)構(gòu)的病理性變化而引起的腰痛[6]。約40%的慢性腰痛患者患有椎間盤源性腰痛[7]。

目前，臨床對(duì)于椎間盤源性腰痛的發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)不足。在患有椎間盤源性腰痛的患者中，椎間盤的纖維環(huán)通常伴有病理間隙。由于各種炎癥介質(zhì)的作用，椎間盤的結(jié)構(gòu)在上述生長和修復(fù)過程中會(huì)發(fā)生病理變化，從而導(dǎo)致腰痛[8，9]。Peng 等[10]的磁共振成像研究顯示，椎間盤源性腰痛患者的腰椎間盤高信號(hào)區(qū)基本均為纖維環(huán)裂隙內(nèi)的炎性肉芽組織。交感神經(jīng)在上述傳導(dǎo)途徑中起重要作用[11]。椎間盤后部的纖維環(huán)內(nèi)以交感神經(jīng)和脊神經(jīng)為主，疼痛信息由交感神經(jīng)介導(dǎo)[12]。因此，研究椎間盤源性腰痛的傳導(dǎo)途徑具有重要意義。

目前大多數(shù)關(guān)于椎間盤源性腰痛的研究主要集中在動(dòng)物模型的交感神經(jīng)干上。然而，交感神經(jīng)干離斷對(duì)動(dòng)物的腹部臟器和下肢功能有著較大影響[13]。因此在本研究中，使用熒光金（FG）逆行追蹤，采用物質(zhì)P（SP）進(jìn)行免疫組織化學(xué)（IHC）實(shí)驗(yàn)來研究其機(jī)制，實(shí)驗(yàn)中最大程度保護(hù)大鼠的神經(jīng)功能。本實(shí)驗(yàn)在分離L5～6椎間盤的L2和L5交感神經(jīng)分支后，研究疼痛信息的傳導(dǎo)途徑，以此研究椎間盤源性腰痛的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇120 只體重為260～320g 的純種近交SD 大鼠，飼養(yǎng)在通風(fēng)良好、室內(nèi)濕度為51%～56%、溫度為20℃～25℃的清潔環(huán)境中，大鼠可以自由獲取食物和水。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 分組和準(zhǔn)備將120 只SD 大鼠分為椎間盤前部組（A 組，n=60）和椎間盤后部組（B 組，n=60）,A 組為椎間盤前部藥物注射并切斷不同交感神經(jīng)；B 組為椎間盤后部藥物注射并切斷不同交感神經(jīng)。再根據(jù)交感神經(jīng)分支切斷部位將A 組分為A0、A-L2、A-L5、A-L2-L5組，各15 只大鼠；將B 組分為B0、B-L2、B-L5、B-L2-L5組，各15 只大鼠。

以40mg/kg 的劑量給予大鼠腹膜內(nèi)注射3%戊巴比妥，并在麻醉后將其四肢固定至仰臥位，無菌條件下切開腹部，切口直徑約5cm，縱向切開腹膜使其橫向分離，并完全暴露交感神經(jīng)干與其交通分支相交的部位。A0 組和B0 組不切斷椎間盤的交感神經(jīng)分支，A-L2組切斷椎間盤前部的L2交感神經(jīng)分支，A-L5組切斷椎間盤前部的L5交感神經(jīng)分支，A-L2-L5組同時(shí)切斷椎間盤前部的L2和L5交感神經(jīng)分支。同樣，B-L2組切斷椎間盤后部的L2交感神經(jīng)分支，B-L5組切斷椎間盤后部的L5交感神經(jīng)分支，B-L2-L5組同時(shí)切斷椎間盤后部的L2和L5交感神經(jīng)分支。

1.3 FG 注射和治療處理將FG（購自奧特沃生物技術(shù)有限公司）注射到大鼠L5～6椎間盤的前后部。首先仔細(xì)處理L5～6椎間盤連通分支，縫合切口，然后將大鼠置于俯臥位。在大鼠背部行以L5～6椎間隙為中心的5cm 縱向切口。剝離椎旁肌，取出L5和L6椎板的上邊界，露出內(nèi)鞘，將內(nèi)鞘移出對(duì)側(cè)中線。然后使用含有0.2μl 的10%FG 注射器在纖維環(huán)處穿刺至1mm 深度，在10min 內(nèi)緩慢注射溶液，并用氰基丙烯酸酯粘合劑封閉針孔以避免FG漏出。在FG 已注射至椎間盤后，用手術(shù)線縫合切口。手術(shù)后4 天內(nèi)給予大鼠注射青霉素預(yù)防感染，劑量為2 000 000U/ml。手術(shù)后7 天對(duì)大鼠實(shí)施安樂死。移除T13～L6區(qū)段的前后背側(cè)神經(jīng)節(jié)（DRG），并且移除L5～6椎間盤軟組織。固定DRG 和椎間盤軟組織，并將其浸入蔗糖-PBS（20%）溶液中過夜。

1.4 免疫組化分析將DRG 洗滌包埋，制成40μm厚的長軸位DRG 切片。切片放于0.1%Triton X-100 溶液中孵育20min。將切片在1:50 稀釋的兔抗大鼠SP 血清（由中國上海Abcam Trading Co.，Ltd 提供）中孵育72h。然后將切片在1:100 稀釋的山羊抗兔二抗中孵育60min。之后用PBS 洗滌樣品并固定在載玻片上。最后蓋上載玻片密封。

1.5 篩選和細(xì)胞計(jì)數(shù)處理好的L5～6椎間盤使用XSP-63X 三目熒光顯微鏡觀察FG 在注射部位周圍的滲透。在椎間盤周圍組織中觀察到FG 從纖維環(huán)中滲出，并擴(kuò)散到髓核的中央?yún)^(qū)域。熒光顯微鏡檢查顯示FG 陽性細(xì)胞有金黃色細(xì)胞質(zhì)，SP 陽性細(xì)胞有鮮紅色細(xì)胞質(zhì)。在相同位置研究多個(gè)載玻片并計(jì)數(shù)FG 和SP 雙標(biāo)記陽性的細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較A-L2組2 只大鼠FG注射失敗，符合率為86.67%（13/15）。A-L5組1只大鼠FG 注射失敗，符合率為93.33%（14/15）；A-L2-L5組4 只大鼠FG 注射失敗，符合率為73.33%（11/15）。B-L2組和B-L5組各2 只大鼠FG 注射失敗，符合率均為86.67%（13/15）。B-L2-L5組3 只大鼠FG 注射失敗，符合率為80.00%（12/15）。各組大鼠性別、周齡及體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠一般情況比較[n（%）]

2.2 A 組大鼠椎間盤各部位DRG 細(xì)胞數(shù)量比較在大鼠L5～6椎間盤L2和L5交感神經(jīng)分支離斷前后，A-L2組和A-L2-L5組L2區(qū)段中帶有雙標(biāo)記的DRG 細(xì)胞數(shù)量顯著少于A0 組（t=5.173，P＜0.001；t=5.293，P＜0.001）。在其他區(qū)段中，不同組之間帶有雙標(biāo)記的DRG 細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。A-L2組和A-L2-L5組中，L2區(qū)段及其他區(qū)段中帶有雙標(biāo)記的DRG 細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在A-L5組與A0 組中，T13、L1、L2、L3、L4、L5及L6區(qū)段內(nèi)帶有雙標(biāo)記的DRG 細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 A 組大鼠L5～6 椎間盤中L2 和/或L5 交感神經(jīng)分支切斷前后帶有雙標(biāo)記的DRG 細(xì)胞數(shù)量（±s）

表2 A 組大鼠L5～6 椎間盤中L2 和/或L5 交感神經(jīng)分支切斷前后帶有雙標(biāo)記的DRG 細(xì)胞數(shù)量（±s）

注：與A0 組比較，*P＜0.01

組別nT13L1L2L3L4L5L6 A0 組154.1±2.814.8±4.819.4±4.16.4±2.55.4±3.12.8±1.24.3±1.8 A-L2 組134.2±2.014.5±3.911.8±3.6*5.9±2.85.2±3.22.5±1.34.1±2.0 A-L5 組143.8±2.413.9±5.118.9±5.16.3±3.04.8±2.52.9±0.93.5±2.3 A-L2-L5 組 113.5±1.912.4±4.210.7±4.6*5.8±3.14.5±2.13.0±1.43.7±1.9 F 0.2210.65914.2500.1400.2650.4040.460 P 0.8800.581＜0.0010.9350.8490.7500.711

2.3 B 組大鼠椎間盤各部位DRG 細(xì)胞數(shù)量比較在大鼠L5～6椎間盤L2和L5交感神經(jīng)分支離斷前后，與B0 組相比，B-L2組在L2區(qū)段中具有明顯更少的帶有雙標(biāo)記的DRG 細(xì)胞數(shù)量（t=5.561，P＜0.001），B-L5組在T13、L1和L2區(qū)段中具有明顯更少的帶有雙標(biāo)記的DRG 細(xì)胞數(shù)量（t=2.425，P=0.022；t=2.902，P=0.007；t=4.720，P＜0.001），B-L2-L5組在T13、L1和L2區(qū)段中具有明顯更少的帶有雙標(biāo)記的DRG 細(xì)胞數(shù)量（t=3.472，P=0.001；t=4.613，P＜0.001；t=10.150，P＜0.001）。在其他區(qū)段中，不同組別之間帶有雙標(biāo)記的DRG 細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。B-L2-L5組L2區(qū)段中帶有雙標(biāo)記的DRG 細(xì)胞數(shù)量明顯少于B-L2組和B-L5組（t=4.627，P＜0.001；t=5.229，P＜0.001）。在B-L2組和B-L5組中，T13、L1、L2、L3、L4、L5及L6區(qū)段帶有雙標(biāo)記的DRG 細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 B 組大鼠L5～6 椎間盤中L2 和/或L5 交感神經(jīng)分支切斷前后帶有雙標(biāo)記的DRG 細(xì)胞數(shù)量（±s）

表3 B 組大鼠L5～6 椎間盤中L2 和/或L5 交感神經(jīng)分支切斷前后帶有雙標(biāo)記的DRG 細(xì)胞數(shù)量（±s）

注：與B0 組比較，*P＜0.01；與B-L2 組和B-L5 組比較，#P＜0.01

組別nT13L1L2L3L4L5L6 B0 組158.3±3.415.8±5.119.4±4.612.6±3.811.2±2.7 8.9±3.4 4.2±2.7 B-L2 組137.8±2.813.7±4.510.7±3.5*11.4±4.89.3±5.47.8±3.1 3.8±2.5 B-L5 組135.3±3.1*10.8±3.8*11.8±3.8*11.7±5.110.3±3.8 9.0±4.6 4.1±3.2 B-L2-L5 組124.4±2.1*8.5±3.4*5.3±2.1*#8.9±4.29.9±3.47.7±3.4 3.6±1.4 F 6.2597.40033.9001.6010.5800.4700.151 P 0.001＜0.001＜0.0010.2010.6300.7040.928

3 討論

下背部疼痛主要是由于椎間盤內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化所致。腰椎間盤纖維環(huán)的外層中含有大量纖維，且分布在整個(gè)外周纖維環(huán)中[9]。其有兩種類型的疼痛傳遞纖維：有髓鞘的Aδ 纖維和無髓鞘的C纖維[14]。椎間盤在纖維環(huán)破裂或損傷后會(huì)發(fā)生炎癥反應(yīng)，這些反應(yīng)可能涉及多種炎癥介質(zhì)和炎癥細(xì)胞。由于椎間盤髓核中的內(nèi)部疼痛感受器和纖維環(huán)周圍組織中神經(jīng)末梢的刺激，觸發(fā)了不同程度的下背部疼痛[15，16]。正常椎間盤中的SP 免疫陽性神經(jīng)纖維可存在于纖維環(huán)外層，但在退行性病變的髓核和椎間盤中，也能觀察到SP 免疫陽性的疼痛神經(jīng)纖維[17]。機(jī)械或化學(xué)物質(zhì)刺激傷害感受器或疼痛感受器可引發(fā)腰痛[18]。發(fā)生病理變化的腰椎間盤疼痛信息是由腰椎竇椎神經(jīng)至相應(yīng)的DRG 傳導(dǎo)的，其中相應(yīng)的神經(jīng)元節(jié)段占主導(dǎo)作用[19]。然而，椎間盤源性腰痛并不是沿著其周圍組織的主導(dǎo)區(qū)域分布，而是表現(xiàn)為彌散性背痛，固定的壓痛點(diǎn)較少，難以定位[20]。腰部皮膚和下腰部受臀上皮神經(jīng)支配，這些神經(jīng)是L1～3段中皮神經(jīng)的后分支。相反，沒有皮神經(jīng)在S1和L5節(jié)段的后分支區(qū)域中分布。因此，腰椎間盤病變引起的腰痛只能用L1和L2段中引起疼痛來解釋，而不是S1和L5段的放射性疼痛[21]。生殖道神經(jīng)是L2區(qū)段中DRG 的分支之一，主要傳遞來自腹股溝區(qū)域皮膚的疼痛信息。因此，很難解釋神經(jīng)根神經(jīng)節(jié)段區(qū)域的具體主導(dǎo)[22]。

本研究采用FG 逆行追蹤和SP 免疫組織化學(xué)相結(jié)合的方法，研究大鼠L5～6椎間盤的疼痛信息通路。FG 具有高靈敏度，可用于標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)個(gè)數(shù)，是使用最廣泛的中性逆行示蹤劑。FG 不僅可以標(biāo)記傳遞疼痛的細(xì)胞和神經(jīng)纖維，還可以標(biāo)記非疼痛細(xì)胞和纖維神經(jīng)[23]。SP 是參與疼痛信息傳遞的神經(jīng)肽。腰椎間盤中具有鮮紅色細(xì)胞質(zhì)的SP 陽性細(xì)胞代表DRG 神經(jīng)元[24]。將大鼠L5～6椎間盤中切斷L5交感神經(jīng)分支后，在A-L5組和A0 組之間任何區(qū)段中帶有雙標(biāo)記的DRG 細(xì)胞數(shù)量均無顯著差異。這表明L5交感神經(jīng)分支不參與大鼠L5～6椎間盤的神經(jīng)傳導(dǎo)通路。在大鼠L5～6椎間盤中切斷L2交感神經(jīng)分支后，A-L2組和A-L2-L5組在L2區(qū)段中帶有雙標(biāo)記的DRG 細(xì)胞數(shù)量明顯少于A0 組。A-L2組和A-L2-L5組在L2區(qū)段中帶有雙標(biāo)記的DRG 細(xì)胞數(shù)量無顯著差異。此外，僅離斷L2交感神經(jīng)分支與同時(shí)切斷L2和L5交感神經(jīng)分支后的功能相似。在大鼠中，L5～6椎間盤中的疼痛信息傳導(dǎo)過程不涉及相同節(jié)段中的L5交感神經(jīng)分支或DRG。在L5～6椎間盤中切斷L5交感神經(jīng)分支后，與B0 組相比，B-L5組T13、L1和L2區(qū)段中帶有雙標(biāo)記的DRG 細(xì)胞數(shù)量顯著減少。此外，兩組之間其他區(qū)段帶有雙標(biāo)記的DRG 細(xì)胞數(shù)量無顯著差異。這表明椎間盤中的疼痛信息通過兩條不同的通路傳導(dǎo)到上下腰椎DRG。L5交感神經(jīng)分支參與上腰椎DRG 的傳導(dǎo)通路，而與下腰椎DRG 的傳導(dǎo)通路無關(guān)。在L5～6椎間盤中切斷L2交感神經(jīng)分支后，與B0 組相比，B-L2組中帶有雙標(biāo)記的DRG 細(xì)胞數(shù)量僅在L2區(qū)段中顯著減少。同時(shí)切斷L2和L5交感神經(jīng)分支，B-L2-L5組L2區(qū)段中帶有雙標(biāo)記的DRG 細(xì)胞數(shù)量顯著少于B-L2組和B-L5組。這表明L2和L5交感神經(jīng)分支均參與并影響從L5～6椎間盤到L2DRG 疼痛信息的傳導(dǎo)，L2和L5交感神經(jīng)分支在大鼠L5～6椎間盤的神經(jīng)傳導(dǎo)通路中起到了不同作用。Suseki 等[25]報(bào)道了腰椎間盤中存在交感神經(jīng)纖維和受體神經(jīng)纖維的分布。腰椎間盤中的感覺神經(jīng)沿竇椎神經(jīng)進(jìn)入交感神經(jīng)分支，但不進(jìn)入脊神經(jīng)的同一節(jié)段。因此，L2和L5交感神經(jīng)分支在大鼠L5～6椎間盤的疼痛信息傳導(dǎo)通路中起到了不同作用。

本研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)具有可重復(fù)性，不同組別大鼠的性別、年齡及體質(zhì)量無差異，確保了本研究的可靠性。但本研究仍存在一些不足之處：首先，在刺穿大鼠椎間盤時(shí)難以評(píng)估注射器刺入的深度，這可能導(dǎo)致同一區(qū)段中帶有雙標(biāo)記的DRG 細(xì)胞數(shù)量的差異。其次，疼痛神經(jīng)傳導(dǎo)途徑在大鼠和人之間不同，本研究并未揭示人類椎間盤源性腰痛的過程。再者，本實(shí)驗(yàn)使用正常大鼠進(jìn)行研究，因此無法研究可能發(fā)生在椎間盤源性腰痛發(fā)生發(fā)展過程中的特定機(jī)制。因此，在未來的研究中，應(yīng)在具有病理性椎間盤源性腰痛患者中研究疼痛感知傳導(dǎo)途徑，以進(jìn)一步驗(yàn)證本研究的結(jié)論。

總之，L2和L5交感神經(jīng)分支在大鼠L5～6椎間盤前部的疼痛信息傳導(dǎo)中起到了不同的作用。L2交感神經(jīng)分支參與從L5～6椎間盤到L2DRG 的疼痛信息通路過程，而L5～6椎間盤的疼痛信息則通過兩條不同的通路傳導(dǎo)至上下腰椎DRG。L5交感神經(jīng)分支參與從L5～6椎間盤向上腰椎的傳導(dǎo)通路過程，與L5～6椎間盤至下腰椎的傳導(dǎo)通路過程無關(guān)。