劉 飛，楊春艷，沈 濤

（1．玉溪師范學(xué)院 物理與電子工程學(xué)院，云南 玉溪 653100；2.玉溪師范學(xué)院 化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪 653100）

中藥材三七為五加科人參屬植物三七（Panax notoginsng（Burk）F. H. Chen.）的干燥根和根莖，是我國特有的名貴藥材[1]；為人工種植，一般栽種3～5 年采收，主要分布于云南文山和廣西那坡靖西一帶.三七藥材的主要物質(zhì)成分為淀粉和皂苷，主要藥效成分為人參皂苷Rg1（C14H72O23）、Rb1（C54H92O23）和三七皂苷R1（C47H50O18），同時(shí)還有氨基酸、三七多糖、黃酮類化合物等[2]，已廣泛應(yīng)用于我國的藥品和保健品生產(chǎn).由于三七種植連作困難，采收后的地塊一般需要間歇8 年以上才能播種，加之前些年市場需求旺盛，導(dǎo)致三七的種植地域擴(kuò)散，市場上的三七品質(zhì)參差不齊.對三七藥材的品質(zhì)鑒別，傳統(tǒng)方法以三七的質(zhì)量大小來進(jìn)行判別，市面上按每500 克三七的頭數(shù)來評判三七的等級，頭數(shù)越少，說明三七的品質(zhì)越高.隨著現(xiàn)代種植技術(shù)在三七種植中的應(yīng)用和三七種植地域的擴(kuò)散，傳統(tǒng)的評判方法已經(jīng)不能客觀的評價(jià)三七的品質(zhì)，研究建立能簡便快速的鑒別三七質(zhì)量的方法很有必要.

中藥材的品質(zhì)鑒定，主要包括藥材的道地性和有效成分含量兩方面，《中國藥典2010》中規(guī)定，三七藥材干燥品中人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1的總量不得少于5.0%.對中藥材有效成分含量的評價(jià)，主要采用高效液相色譜法來測量和評價(jià)，但此方法比較繁瑣，用時(shí)長.陳士林等人認(rèn)為光譜鑒定技術(shù)具有指紋特性，在中藥材及飲片的質(zhì)量管理和鑒定中具有實(shí)用性[3].在光譜技術(shù)中，傅里葉變換紅外光譜（FTIR）技術(shù)反映樣品的整體化學(xué)性質(zhì)，儀器通用，操作簡單，既可定性鑒別中藥材品質(zhì)，又可定量分析樣本成分含量，在中藥材的質(zhì)量鑒定中有較強(qiáng)的應(yīng)用發(fā)展前景.偏最小二乘回歸法是一種多元統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析方法，可實(shí)現(xiàn)多元線性回歸分析、典型相關(guān)分析、主成分分析等多種分析方法的綜合應(yīng)用[4].偏最小二乘回歸法對中藥材及中成藥的藥效成份預(yù)測已有報(bào)道[5-7].本文擬按中國藥典中對三七藥材主要有效成分含量的測量方法來測量三七主根樣品中R1、Rg1、Rb1的含量，以3 種皂苷的總含量作為建模分析中的因變量（實(shí)際值），同時(shí)測試各三七主根樣品的FTIR 光譜，以樣品的紅外光譜作為自變量，利用偏最小二乘回歸法建立定量分析模型來研究三七主根中3 種皂苷Rb1、Rg1、R1總含量的預(yù)測方法，以期為市場上三七的定量分析評價(jià)提供簡便快捷和準(zhǔn)確的方法.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器設(shè)備與測試條件

傅里葉變換紅外光譜儀，型號Frontier，美國Perkin—Elmer 公司，裝備DTGS 檢測器，光譜分辨率4cm-1，掃描范圍4 000～400 cm-1，累加掃描次數(shù)16 次.

高效液相色譜儀，型號HPLC-10，日本島津公司，包括泵（HPLC-10ATVP）、手動(dòng)進(jìn)樣器（7725i）、二級管陣列檢測器（SPD-M10A VP，190～800 nm）.超聲波清洗儀，型號SY3200-T，上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司.

色譜條件，島津液相色譜柱（Shim-pack VP-ODS，150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相，乙腈-水梯度洗脫0～12 min，19%乙腈，12～45 min 19%～4%乙腈.流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30℃；檢測波長，203 nm.

1.2 材料與試劑

三七主根樣品，采自云南文山州及周邊7 個(gè)縣的12 個(gè)種植點(diǎn)，共100 株三年生三七的主根，樣品在45℃恒溫下烘干至恒重，用中藥粉碎機(jī)粉碎待測.

試劑與標(biāo)準(zhǔn)品：乙腈為色譜純（Fisher 公司）；水為超純水，其他試劑均為分析純.三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1，購自中國食品藥品檢定研究院.淀粉為分析純（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；溴化鉀為分析純（天津市福晨化學(xué)試劑廠）.

1.3 試驗(yàn)三七主根樣品主要有效成分含量的測量

采用高效液相色譜法測量100 個(gè)三七主根樣品的主要有效成分R1、Rg1、Rb1的含量，線性回歸方程及試驗(yàn)樣品所得數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析數(shù)值如表1 所示.

表1 試驗(yàn)三七主根樣品有效成分含量的統(tǒng)計(jì)分析數(shù)值（mg·g-1）

1.4 光譜測量方法及數(shù)據(jù)處理

測試樣品光譜時(shí)，將所取樣品放入瑪瑙研缽磨為均勻粉末，過200 目篩，按樣品與溴化鉀1∶75 質(zhì)量比加入溴化鉀，并攪磨均勻，然后壓片測試光譜.測試中實(shí)時(shí)扣除背景的影響，然后將所有光譜在Omnic8.0 軟件中進(jìn)行自動(dòng)基線校正、九點(diǎn)平滑和歸一化等預(yù)處理.偏最小二乘回歸建模時(shí)，將預(yù)處理后的樣品光譜信息和樣品中3 種皂苷的含量信息輸入光譜分析軟件TQ Analyst8.6，并將100 個(gè)樣品分為校正集75 個(gè)，驗(yàn)證集25 個(gè).建模分析中，采用導(dǎo)數(shù)光譜時(shí)，在TQ Analyst8.6 中計(jì)算樣品光譜的導(dǎo)數(shù)光譜，并進(jìn)行Norris Derivative 濾波處理.

2 結(jié)果與分析

2.1 三七主根及其主要組成物質(zhì)的紅外光譜分析

三七主根及其組成物質(zhì)淀粉、R1、Rg1、Rb1的紅外光譜如圖1 所示，圖2 為二階導(dǎo)數(shù)光譜.三七主根各組成成分在中紅外區(qū)域都有明顯的吸收，其紅外光譜主要吸收峰的峰強(qiáng)及歸屬[8]如表2 所示.在淀粉的紅外光譜中，主要顯示了3 400 cm-1、2 929 cm-1、1 647 cm-1、1 465 cm-1、1 159 cm-1、1 082 cm-1、1 018 cm-1、995 cm-1、928 cm-1、858 cm-1、763 cm-1等較明顯的吸收峰，1 159 cm-1、1 082 cm-1、1 018 cm-1、995 cm-1附近階梯增強(qiáng)的峰為C—O 伸縮振動(dòng)[9]，2 929 cm-1附近中等強(qiáng)度的吸收峰為亞甲基C-H 的反對稱伸縮振動(dòng)和對稱伸縮振動(dòng)，1 647 cm-1附近中等強(qiáng)度的吸收峰為O-H 彎曲振動(dòng)，928 cm-1、858 cm-1附近中等強(qiáng)度的吸收峰為糖環(huán)中C-C 伸縮振動(dòng)，763 cm-1附近的弱吸收為糖環(huán)骨架伸縮振動(dòng).人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1的紅外光譜非常相似，1 077 cm-1、1 042（1 035）cm-1附近的雙峰為光譜的強(qiáng)峰，1 160 cm-1附近為中等強(qiáng)度的吸收峰，均為C—O 伸縮振動(dòng)；1 458 cm-1、1 389 cm-1、1 359 cm-1、1 310 cm-1附近的弱吸收峰為C-H 彎曲振動(dòng)、變角振動(dòng)等的吸收峰；1 640 cm-1附近的弱吸收峰為羰基C=O 伸縮振動(dòng)；2 970 cm-1、2 929 cm-1、2 875 cm-1附近中等強(qiáng)度的吸收峰來自甲基和亞甲基中C-H 的反對稱伸縮振動(dòng)和對稱伸縮振動(dòng).

圖1 三七、淀粉、R1、Rg1、Rb1 的紅外光譜（A：三七；B：淀粉；C：R1；D：Rg1；E：Rb1）

圖2 三七、淀粉、R1、Rg1、Rb1 的紅外二階導(dǎo)數(shù)光譜（A：三七；B：淀粉；C：R1；D：Rg1；E：Rb1）

表2 三七主要紅外吸收峰歸屬情況

對比分析三七、淀粉、R1、Rg1、Rb1的紅外光譜和二階導(dǎo)數(shù)光譜，三七與淀粉光譜在1 160～1 020 cm-1范圍的峰形、峰位和相對峰強(qiáng)都很相近，說明三七中淀粉的含量較高.R1、Rg1、Rb1的紅外二階導(dǎo)數(shù)光譜在3 000～2 850 cm-1范圍，亞甲基和甲基的振動(dòng)形成了一系列的吸收峰；淀粉的紅外二階導(dǎo)數(shù)光譜在此范圍的吸收峰較少且相對較弱，三七在此范圍也顯示了多個(gè)吸收峰，且吸收光譜與R1、Rg1、Rb1的比較相似，說明此波段內(nèi)三七的紅外光譜主要為皂苷類物質(zhì)亞甲基和甲基的振動(dòng).在1 050～988 cm-1范圍，三七的二階導(dǎo)數(shù)光譜顯示了一系列吸收峰，對比淀粉及R1、Rg1、Rb1的二階導(dǎo)數(shù)光譜，淀粉的二階導(dǎo)數(shù)光譜在此范圍顯示了1 個(gè)很弱的吸收峰，而R1、Rg1、Rb1的二階導(dǎo)數(shù)光譜在此范圍顯示了一系列的吸收峰，且相對較強(qiáng)，說明此范圍三七紅外光譜的振動(dòng)與皂苷類物質(zhì)的振動(dòng)關(guān)系密切.上述紅外光譜及二階導(dǎo)數(shù)光譜分析反映，三七中富含淀粉和皂苷類物質(zhì).

2.2 三七中3 種皂苷總量的定量建模分析

在天然產(chǎn)物樣品中，由于組成物質(zhì)成分非常復(fù)雜，樣品各組成成分的光譜重疊嚴(yán)重，含量高的物質(zhì)成分光譜常常掩蓋了含量低的物質(zhì)成分光譜，且光譜變量間具有多重相關(guān)性，光譜變量數(shù)目大等，采用多元線性回歸或主成分回歸等方法來建立模型預(yù)測其中某種成分或某幾種成分的含量比較困難.偏最小二乘回歸是一種多元統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析方法，可以實(shí)現(xiàn)多因變量對多自變量的回歸建模，能較好的解決自變量間的多重相關(guān)性、樣本數(shù)量相比變量數(shù)較少的回歸問題[4].三七藥材是一種天然產(chǎn)物，本試驗(yàn)的測量結(jié)果以及前面的光譜分析表明，三七主根中主要皂苷R1、Rg1、Rb1的含量相對較低，因此本試驗(yàn)采用三七主根樣品的紅外光譜結(jié)合偏最小二乘回歸方法來建立3 種皂苷總含量的定量預(yù)測模型.將預(yù)處理后的樣品光譜及各樣品中3 種主要皂苷的總含量輸入TQ Analyst8.6 軟件，進(jìn)行定量建模分析.

2.2.1 3 種皂苷總含量的定量建模分析

將100 個(gè)樣品按三種皂苷含量大小較均勻的分為校正集75 個(gè)，驗(yàn)證集25 個(gè)，采用二階導(dǎo)數(shù)光譜，選擇全光譜（4 000～400 cm-1）范圍的光譜變量進(jìn)行3 種皂苷總含量的偏最小二乘回歸定量建模.以軟件自帶的對模型性能指數(shù)（相對殘差和，最大值為100，越接近100 越好）的計(jì)算結(jié)果來評價(jià)模型的優(yōu)劣，反復(fù)調(diào)整校正集和驗(yàn)證集樣品，直至得到較滿意的模型為止.固定校正集和驗(yàn)證集樣品，分別對原紅外光譜、一階導(dǎo)數(shù)光譜、二階導(dǎo)數(shù)光譜在全光譜范圍進(jìn)行3 種皂苷總含量的偏最小二乘回歸定量建模比較.表3 為不同級別的光譜在全光譜范圍結(jié)合偏最小二乘回歸定量分析3 種皂苷總含量的建模情況.由表3 知，3 種級別的光譜結(jié)合偏最小二乘回歸法建立的模型都能較好的預(yù)測三七主根樣品中的3 種皂苷總含量，相對而言，基于一階導(dǎo)數(shù)光譜的偏最小二乘回歸定量模型，性能更好.校正集樣品的預(yù)測值與實(shí)際值的相關(guān)系數(shù)為0.980 8，RMSEC 值為7.87；驗(yàn)證集樣品的預(yù)測值與實(shí)際值的相關(guān)系數(shù)為0.985 6，RMSEP 值為5.67，模型性能指數(shù)達(dá)到了89.9.圖3 為基于一階導(dǎo)數(shù)光譜的偏最小二乘回歸定量模型對各實(shí)驗(yàn)樣品的預(yù)測值與實(shí)際值的相關(guān)曲線，由圖可知，預(yù)測值與實(shí)際值的相關(guān)性較高.

圖3 一階導(dǎo)數(shù)光譜的預(yù)測模型對各樣品的預(yù)測值與實(shí)際值的相關(guān)曲線

表3 不同級別的光譜結(jié)合偏最小二乘回歸法對3 種皂苷總含量的定量分析情況

2.2.2 不同光譜范圍的一階導(dǎo)數(shù)光譜對3 種皂苷總含量的建模分析

按照2.2.1 中建模所用的校正集和驗(yàn)證集樣品，分別對一階導(dǎo)數(shù)光譜在全光譜、1 800～700 cm-1、3 250～2 650 cm-1等3 個(gè)光譜范圍的光譜變量進(jìn)行偏最小二乘回歸定量建模比較.表4 為不同光譜范圍的一階導(dǎo)數(shù)光譜結(jié)合偏最小二乘回歸法對3 種皂苷總含量的定量分析情況.由表4 知，一階導(dǎo)數(shù)的3 個(gè)不同光譜范圍結(jié)合偏最小二乘回歸法建立的3 種皂苷總含量測定模型也都能預(yù)測三七的3 種皂苷總量，相對而言，基于一階導(dǎo)數(shù)全光譜的偏最小二乘回歸定量模型，性能更好.

表4 不同范圍的一階導(dǎo)數(shù)光譜結(jié)合偏最小二乘回歸法對3 種皂苷總含量的定量分析情況

3 結(jié) 論

利用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)測試了采自云南文山州及周邊7 個(gè)縣12 個(gè)種植點(diǎn)，共100 株三年生三七主根的傅里葉變換紅外光譜，通過Omnic8.0 軟件計(jì)算各樣品紅外光譜的一階導(dǎo)數(shù)光譜和二階導(dǎo)數(shù)光譜.通過與純物質(zhì)淀粉、皂苷Rb1、Rg1、R1的光譜比較，樣品紅外光譜反映，三七主根中富含淀粉和皂苷類物質(zhì).按中國藥典中對三七藥材主要有效成分含量的測量方法來測量三七主根樣品中R1、Rg1、Rb1的質(zhì)量百分比，分別以樣品的紅外光譜、一階導(dǎo)數(shù)光譜和二階導(dǎo)數(shù)光譜作為自變量，利用偏最小二乘回歸法建立定量分析模型來研究三七主根中3 種皂苷Rb1、Rg1、R1總含量的測量方法，相對而言，基于一階導(dǎo)數(shù)光譜的偏最小二乘回歸定量模型，性能更好.校正集樣品的預(yù)測值與實(shí)際值的相關(guān)系數(shù)為0.980 8，RMSEC 值為7.87；驗(yàn)證集樣品的預(yù)測值與實(shí)際值的相關(guān)系數(shù)為0.985 6，RMSEP 值為5.67，模型性能指數(shù)達(dá)到了89.9.研究結(jié)果表明，基于三七主根的傅里葉變換一階導(dǎo)數(shù)紅外光譜結(jié)合偏最小二乘回歸定量模型可以較好的預(yù)測三七主根中主要的皂苷含量，為生產(chǎn)實(shí)踐中快速預(yù)測三七藥材中的主要皂苷含量提供了簡便快捷且準(zhǔn)確的方法.